（水生生物学专业论文）斜带石斑鱼cd8α和cd8β基因克隆及表达模式分析.pdf

斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 1 3 基因克隆及表达模式分析 论文题目：斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 p 基因克隆 及表达模式分析 专业：水生生物学 硕士生：徐胜威 导师：吴金英副教授 摘要 c d 8 是t 细胞表面的双链糖蛋白，存在c d 8 c t 和c d 8 1 3 两种亚基形式，与 i 型主要组织相容性复合体( m h ci ) 结合，是t 细胞表面受体( t c r ) 的共 受体，也是t 淋巴细胞表面的重要标志物，它作为粘附分子和辅受体广泛参与 t c r 对m h c1 分子递呈抗原的识别和信号传递过程。在哺乳类，c d 8 分子作为 一类信号传递分子，其胞内区部分与蛋白酪氨酸激酶s r c 家族的p 5 6 k 。相连，参 与t c r 介导的信号级联反应。 本文利用同源克隆和r a c e 方法从斜带石斑鱼胸腺组织中克隆得到了斜带 石斑鱼c d 8 a 和c d s l 3 全长c d n a 序列及其相应的基因组序列。斜带石斑鱼 c d 8 ac d n a 全长1 5 5 7 b p ，包括一个长为6 8 4b p 的开放读码框( o r f ) ，编码一 段长为2 2 7 个氨基酸残基的多肽；c d 8 a 基因组序列长2 6 2 8b p ，包含5 个内含 子和6 个外显子。c d 8 pc d n a 全长1 4 4 0b p ，o r f 长为6 3 9b p ，编码2 1 2 个氨 基酸，其相应的基因组序列长4 6 2 0b p ，包含七个外显子和六个内含子，其中第 六个内含子位于y - u t r 中。生物信息学表明，未成熟的c d 8 a 和c d 8 p 分子多 肽序列都由信号肽、胞外可变区、铰链区、跨膜区和胞内区5 部分组成。在胞外 区可变区和铰链区部分各有两个高度保守的半胱氨酸残基，参与链内和链间二硫 键的形成。多肽序列多重比对发现，斜带石斑鱼与其他鱼类的c d 8 蛋白在结构 上是相似的，特别是与鲽形目种类同源性较高。 中山大学硕士学位论文徐胜威 通过r e a l - t i m er tp c r 技术，检测c d 8 a 和c d 8 d 在各组织和胚胎发育期 间的表达谱，研究了斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 1 3 的时空表达情况，并探索了 l p s 、p o l yi ：c 、c o n a 和p h a 对斜带石斑鱼头肾淋巴细胞c d 8 a 和c d 8 d 基因 表达情况的影响。定量结果表明，c d 8 a 和c d 8 f l 基因在胸腺中的表达量最高， 在其它免疫相关组织中也有少量表达，而在胃和肝脏中表达量极少。在胚胎发育 中，多细胞期的c d 8 表达量明显高于其它时期，肌节出现期也有较多表达。c d 8 在多细胞期转录产物的大量出现意味着这个时期可能是合成c d 8 转录产物的关 键期。此外，体外淋巴细胞刺激实验结果表明l p s 对淋巴细胞中c d 8 的表达影 响甚小，而在p o l yi ：c 、c o n a 和p h a 刺激组中，c d 8 的表达水平在2 h 后都有 了提高，在4 h 时达到了最高表达水平，之后表达量持续下降，呈现明显的时间 依赖效应，与c d 8 b 相比，c d 8 a 的表达水平更容易受到这三种分裂素的影响。 为了进一步研究斜带石斑鱼c d 8 的生物学功能，我们利用p e t3 2 a ( + ) 质粒 构建了表达c d 8 a 成熟肽胞外区的重组质粒，并将该重组质粒转入大肠杆菌 b l 2 1 中。之后，我们对表达条件进行了i p t g 的诱导浓度和诱导时间上的优化， 发现在3 7 ，0 7 m mi p t g 浓度诱导4 h 后可获得高产量的重组蛋白。 关键词：c d 8 ，斜带石斑鱼，克隆，表达，重组蛋白 斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 1 3 基因克隆及表达模式分析 m o l e c u l a rc l o n i n ga n de x p r e s s i o no fo r a n g e - s p o t t e dg r o u p e r ( e p i n e p h e l u sc o i o i d e s ) c d 8 aa n dc d 8 pg e n e s m a jo r ：h y d r o b i o l o g y n a m e ：x us h e n g w e i s u p e r v i s o r ：a s s o c i a t ep r o f w uj i n y i n g a b s t r a c t c d 8c o n s i s t so f t w od i s t i n g u i s h e dc h a i n s ，t e r m e do 【a n dpc h a i n sa n df u n c t i o n sa s ac o - r e c e p t o rf o rt c r b yb i n d i n gt om h c c l a s si p r o t e i n st h a tp r e s e n tp e p t i d e so n t h ec e l ls u r f a c e ，a sw e l la st h ei m p o r t a n tm a r k e ro ft l y m p h o c y t e s i ta c t sa sa d h e s i o n m o l e c u l a ra n da u x i l i a r yr e c e p t o rp a r t i c i p a t i n gi na n t i g e ni d e n t i f i c a t i o na n ds i g n a l t r a n s f e r p r o c e s s i nm a m m a l s ，c d 8 sc y t o p l a s m i cd o m a i ni sr e s p o n s i b l e f o r i n t e r a c t i o nw i t hp 5 6 l c k ，a n di si n v o l v e di nt c r - m e d i a t e ds i g n a lc a s c a d e t h ef u l ll e n g t hc d n ao f g r o u p e rc d 8 aw a sf o u n dt ob e15 5 7 n u c l e o t i d e sl o n g ， a n dt h eo p e nr e a d i n gf r a m e ( o r e ) w a s6 8 4b pl o n g ，i t sc o r r e s p o n d i n gg e n o m i c s e q u e n c ew a s2 6 2 8b p i tw a sf o u n dt h a tt h ec d 8 ag e n ec o n s i s t e do fs i xe x o n s s e p a r a t e db yf i v ei n t r o n s t h eo r ft r a n s l a t e di n t oap r e d i c t e dp r o t e i no f2 2 7a m i n o a c i dr e s i d u e sa n dt h em o l e c u l a rw e i g h to ft h ep r e d i c t e dp r o t e i nw a se s t i m a t e dt ob e 2 4 9k d a t h ec d 8 1 3c d n aw a sf o u n dt ob e14 4 0n u c l e o t i d e si nl e n g t h ，c o n t a i n i n g 6 3 9b po fo r f , t h i sc o r r e s p o n d e dt oa g e n o m i cr e g i o no f4 6 2 0b p t h eg r o u p e rc d 8 1 3 g e n ew a sc o m p o s e do fs e v e ne x o n ss e p a r a t e db ys i xi n t r o n s ，w h e r et h es i x t hi n t r o n w a sf o u n di nt h e3 - u t r t h ep r e d i c t e do r fh a d212a m i n oa c i dr e s i d u e sa n dt h e m o l e c u l a rw e i g h to ft h i sp r e d i c t e dp r o t e i nw a s21 5k d a t h ep r e d i c t e dp r i m a r y s t r u c t u r eo fc d 8 aa n dc d 8 1 3c o n t a i n e das i g n a lp e p t i d e ，a ni g s fv - d o m a i n ，ah i n g e i i i 中山大学硕士学位论文徐胜威 r e g i o n , at r a n s m e m b r a n er e g i o na n dt h ec y t o p l a s m i ct a i l t h et w oc y s t e i n er e s i d u e s i n v o l v e di nt h ev - d o m a i no fg r o u p e rc d 8 aa n dc d 8 1 3c a p a b l eo ff o r m i n ga n i n t r a - c h a i nd i s u l p h i d eb o n d , a n dt h eo t h e rt w oc y s t e i n e si nt h eh i n g er e g i o na r e c o n s e r v e di nm o s to ff i s h e sr e s p o n s i b l ef o rc d 8 a sa b i l i t y o ff o r m i n gb o m h o m o d i m e r sa n dh e t e r o d i m e r s t h ep r e d i c t e dg r o u p e rc d 8 aa n dc d 8 1 3p r o t e i n sw e r e s t r u c t u r a l l ys i m i l a rt oo t h e rf i s he s p e c i a l l yt ot h o s eo f p l e u r o n e c t i f o r m e s b yu s i n gr e a l - t i m er tp c r , c d 8m r n ae x p r e s s i o nl e v e l sw e r ea n a l y z e di n d i f f e r e n tt i s s u e s ，d i f f e r e n te m b r y o m cd e v e m p m e ms t a g e sa n dl y m p h o c y t e st r e a t e d w i t hs t i m u l a n t s i td e m o n s t r a t e dt h a tt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e lo fc d 8 aa n dc d s l 3 w a so b s e r v e di nt h y m u s ，f o l l o w e db yo r g a n si n v o l v e di ni m m u n o l o g i c a lr e s p o n s e s ， v e r yl o we x p r e s s i o nw a sd e t e c t e d i ns t o m a c ha n dl i v e r d u r i n ge m b r y o m c d e v e l o p m e n to ft h eg r o u p e r , t h eh i g h e s tc d 8t r a n s c r i p t sw e r ed e t e c t e d i nt h e m u l t i c e l ls t a g e ，f o l l o w e db ym u s c l eb u r ls t a g e ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h em u l t i c e l l s t a g em a yb ec r i t i c a li nc d 8t r a n s c r i p ts y n t h e s i s i ng r o u p e rh e a d k i d n e yl y m p h o c y t e s ， t h ec d 8m r n al e v e l sw e r es i g n i f i c a n t l ya f f e c t e di nt i m e d e p e n d e n tm a n n e rb yp o l y i ：c ，p h a ，a n dc o n a ，b u tn o tb yl p s i nt h ep o l yi ：c ，p h aa n dc o n ag r o u p s ，t h e e x p r e s s i o nl e v e lo fc d 8w a su p - r e g u l a t e da t2h o u r sp o s ts t i m u l a t i o n ( 1 a p s ) ，a n d r e a c h e dt h eh i g h e s te x p r e s s i o nl e v e la t4l a p s ，h o w e v e r , t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fc d 8 b e c a m el o w e ra t8l a p s c o m p a r e dt oc d 8 1 b ，t h ec d 8 a se x p r e s s i o nc o u l db em o r e e a s i l ya f f e c t e db ys t i m u l a t a n t s i no r d e rt of u t h e ri n v e s t i g a t et h eb i o l o g i c a lf u n c t i o no fg r o u p e r sc d 8 ，t h ec d 8 a f r a g m e n te n c o d i n gt h ee x t r a c e l l u l a rr e g i o no fm a t u r ep e p t i d ew a ss u b c l o n e di n t o p e t 3 2 a ( + ) e x p r e s s i o nv e c t o ra f t e rd i g e s t i o nw i t hac o m b i n a t i o no f b a m hia n d h i n di l i f i n a l l y ，a f t e ro p t i m i z i n gp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o nc o n d i t i o n s ，w ed e t e r m i n e d t h eo p t i m u mi n d u c e m e mt i m ea n dc o n c e n t r a t i o no fi s o p r o p y l t h i o p d - g a l a c t o s i d e ( i p t g ) u n d e rt h ec o n d i t i o no f0 7m mi p t gf o r4 ha t3 7 w ec a no b t a i nt h e h i g h - p r o d u c i n gr e c o m b i n a n tp r o t e i n k e yw o r d s ：c d 8 ，o r a n g e s p o t t e dg r o u p e r , c l o n i n g ，e x p r e s s i o n , r e c o m b i n a n t p r o t e i n 斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 1 3 基因克隆及表达模式分析 缩略语 a m p ( a m p i c i l l i n ) b p ( b a s ep a i r ) b s a ( b o v i n es e r u ma l b u m i n ) c d ( c l u s t e ro fd i f f e r e n t i a t i o n ) e d n a ( c o m p l e m e n t a r yd n a ) c o n a ( c o n c a n a v a l i na ) d e p c ( d i e t h y p y r o c a r b o n a t e ) d m s o ( d i m e t h y ls u l f o x i d e ) d n t p ( d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) e d t a ( e t h y l e n e d i a m a n e t e t r a a c e t i ca c i d ) h ( h o u r ) i p t g ( i s o p r o p h y lt h i o p d - g a l a c t o s i d e ) k d a ( k i l o d a l t o n ) k g ( k i l o g r a m ) l ( 1 i t r e ) l p s ( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e ) m g ( m i l l i g r a m ) r a i n ( m i n u t e ) m l ( m i l l i l i t r e ) m r n a ( m e s s e n g e rr n a ) o d ( o p t i c a ld e n s i t y ) o r f ( o p e nr e a d i n gf r a m e ) p b s ( p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n e ) p c r ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) p h a ( p h y t o h e m a g g l u t i n i n ) p o l yi ：c ( p o l y i n o s i n i c ：p o l y c y t i d y l i ca c i d ) 氨苄青霉素 碱基对 牛血清蛋白 分化抗原簇 互补d n a 伴刀豆球蛋白a 焦磷酸二乙酯 二甲基亚砜 脱氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸钠 小时 丙基硫代一p d 半乳糖苷 千道尔顿 千克 升 脂多糖 毫克 分钟 毫升 信使r n a 光密度 开放阅读框 磷酸盐缓冲液 聚合酶链式反应 植物凝集素 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸 中山大学硕士学位论文徐胜威 r a c e ( r a p i da m p l i f i c a t i o no fc d n ae n d s ) r p m ( r e v o l u t i o np e rm i n u t e ) s ( s e c o n d ) s d s ( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) t e m e d ( n ，n ，n ，n - t e r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ) t r i s ( t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ) 嵋( m i c r o g r a m ) 肛l ( m i c r o l i t e r ) u t r ( u n t r a n s l a t e dr e g i o n ) x g a l ( 5 - b r o m o 一4 - c h l o r o - 3 一i n d o l y - p d g a l a c t o s i d e ) e d n a 末端快速扩增 每分钟转数 秒 十二烷基硫酸钠 n ，n ，n ，n 四甲基乙二胺 三( 羟甲基) 氨基甲烷 微克 微升 非翻译区域 5 - 溴一4 一氯- 3 - 吲哚p - d 一半乳糖苷 论文原创性声明 本人郑重声明： 所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本 论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品 成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本 人承担口 学位论文作者签名：彼啦烈 日期：如声年石月钐日 学位论文使用授权声明 本人完全了解中山大学有关保留、使用学位论文的规定， 即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构 送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目 的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查 阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以 采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。 学位论文作者签名：铉雅威 导师签名：旌姜 日期：多j l o 年石月g 曰日期：厦彬年多月孑日 斜带石斑鱼c d 8 t t 和c d 8 p 基因克隆及表达模式分析 文献综述 目前，哺乳动物的免疫反应及免疫相关分子的研究已经较为成熟，而鱼类的 免疫系统方面的研究成果不多。基于生理、解剖以及胚胎发育上的相似性，对鱼 类的研究通常以哺乳动物的研究成果为基础，进行比较性探索。鱼类虽然是低等 脊椎动物，但已具备免疫防御系统。免疫功能的执行有赖于免疫系统与神经内分 泌系统之间、免疫系统与抗原之间、免疫系统中细胞之间的相互作用。细胞之间 相互识别的物质基础是细胞表面功能分子，包括细胞表面的多种受体和抗原，它 们在细胞分化和成熟、细胞迁移、抗原识别以及免疫应答中起着重要的作用。 1 m i - i c 分子 1 1m h c 的组成与分布 主要组织相容性复合体( m a j o rh i s t o c o m p a t i b i l i t yc o m p l e x ，m h c ) 是脊椎动 物中发现的编码i g 样受体的高度多态的基因座所组成的一个遗传区域，是与免 疫应答和抗病性密切相关的多基因家族【n ，决定着动物的免疫排斥反应，在机体 免疫系统中发挥着非常重要的抗原递呈作用，也与动物的抗病性相关【2 】。 m h c 由m h ci 、m h ci i 和m h c 三类分子组成，这三类分子在结构、 抗原结合部位的特异性、激活的t 细胞类型、组织分布和功能都是不同的【3 l 。 m h ci 和i i 类分子具有相似的结构并且在免疫反应中发挥重要的抗原呈递作 用，而m h ci i i 类分子与i 类和i i 类分子的结构和功能完全不同，编码几种补体 因子，发挥免疫辅助作用【4 】。m h ci 类分布在所有有核细胞表面，主要负责内源 性抗原的呈递和加工，激活细胞毒性t 细胞( c t l ) ；而m h ci i 类负责外源性抗 原的呈递和加工，激活特异性c d 4 + t 辅助细胞，主要分布于抗原呈递细胞表面【3 1 。 1 2m h c 抗原呈递 抗原递呈细胞( a e c ) 的m h ci 类分子呈递内源性抗原包括3 个阶段：首 先是抗原肽的产生过程，细胞蛋白通过泛素、蛋白酶体等降解【5 】；其次是m h c i 类分子的合成和组装过程【6 j ；最后一步是肽段与m h ci 类分子的结合与表达， 中山大学硕士学位论文徐胜威 m h ci 抗原肽复合物形成后，表达在a p c 表面，之后被c d 8 + t 细胞的t 细胞 抗原受体( t c r ) 所识别，最后启动信号转导途径，激活t 细膨7 ，引。 m h ci i 类分子呈递细胞外产生的抗原包括3 个阶段：首先，外源性抗原通过 多种组织蛋白酶水解 9 1 ，然后是m h c i i 类分子的合成、装配与转运过程【1 0 】，最 后m h ci i 抗原肽复合物形成后，经分泌表达在细胞膜上，被c d 4 + t 细胞t c r 所识别，从而诱导产生辅助性t 细胞免疫【l l 】。 m h c ，i 和m h ci i 类分子呈递外源性抗原的特异性并不是绝对的。某些情 况下，外源性抗原可进入胞质溶胶途径，被m h c i 类分子呈递1 3 1 ；内源性抗 原也可从细胞中释放出来，然后被a p c 细胞吞噬进入内体溶酶体途径，再被 m h ci i 类分子呈递【1 4 1 。虽然这种抗原呈递途径的交叉现象在体内并不是主要的， 但这种方法为病毒和肿瘤疫苗的设计提供了更多的选择余地。 1 3m h c 的免疫功能 m h c 免疫方面的表现是其最重要的功能之一l l5 1 。c u e s t a 等发现金头鲷的i 类在非病原的酵母细胞孵育后表达下降，但在有丝分裂素或病原细菌的孵育后表 达上升【1 6 1 。l a n d i s 等则发现虹鳟的i 类在病毒感染后表达量上升【17 1 ；i i 类基因 方面，d ee y t o 等在研究了大西洋鲑的a 基因后，得出在种内和种间保持m h c 的基因变异的种群是最能抵抗流行疾病的种群【l 列；在金头鲷中，a 基因在用病原 细菌或酵母细胞孵育后白细胞中的表达量上升【1 9 】；在大菱鲆中，b 基因在注射鳗 弧菌后在头肾和肝中的表达从2 4 h 到4 8 h 呈下降趋势，在鲈鱼中，用l p s 刺激 头肾白细胞4 h 后，b 基因的表达变化不明显，但2 4 h 后表达则显著下降【2 0 】。研 究表明，在脊椎动物中，m h c 基因的多态性与抗病能力有着重要的关系，每个 个体中m h c 的多态性使得m h c 能够结合、呈递不同抗原到t 细胞中，影响t 细胞识别【2 l 】。在鱼类组织移植中，当供体与受体i i 类基因的d a b 位点上所有等 位基因都相同时，成功率最高；2 个等位基因都不同时，成功率最低【2 2 l ，这说明 m h c 在鱼类组织排异中具有重要的影响。 2 t c r 分子 t c r 是表达于t 淋巴细胞表面识别自身m h c 抗原肽复合物的受体蛋白，由 t c r a 3 或t c r v 8 与c d 3 分子组成复合体，负责识别m h c 一抗原复合物和特异性 2 斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 b 基因克隆及表达模式分析 抗原产生的活化信号瞄，2 4 】。t c r 作为t 细胞识别抗原的分子，在免疫调节和免 疫应答中发挥重要的作用，近年来t c r 在自身免疫病和病毒的关系得到广泛关 注和研究。 2 1 t c r 与自身免疫性疾病 自身免疫病( a u t o i m m u n ed i s e a s e s ，m d ) 是自身免疫反应发生质和量的异 常，免疫应答攻击自身靶细胞和组织的一种免疫性缺陷疾病。大量实验证明在 a i d 中存在特异性的自身反应性t 细胞浸润，并且突出表现为有限的几种t c r a p t 细胞克隆参与致病【2 5 1 。k i t a 等在研究s l e 患者盘状皮损与外周血来源的t 细 胞中的t c rv b 基因时，发现s l e 患者皮损t 细胞中的t c rv p 库呈现出异质 性，揭示浸润至皮肤的t 细胞可识别皮肤中的自身抗原上的表位，进而启动自 身免疫应答【2 甜。z h a n g 等对类风湿关节炎( r a ) 患者的2 5 个v p 亚家族基因进 行扩增，发现在r a 患者外周血和滑膜中v p 的表达没有明显限制性，在滑膜中 主要表达的有v 1 3 6 、v 1 3 1 7 、v 1 3 2 2 ，其中v 1 3 1 7 的表达水平显著升高【2 7 1 。 2 2t c r 与病毒病的关系 某些病毒如e b 病毒( e b v ) ，细胞巨化病毒( c m v ) ，人免疫缺陷性病毒 ( h i v ) ，流行性感冒等病毒的感染，也会出现t c r 细胞的限制性表达和克隆性 增殖。k j e r - n i e l s e n 等【2 8 1 研究发现e b v 抗原表位e b n a 3 与t 细胞反应后出现v a 和v p 优势增长。m i l e s 等【2 9 1 发现e b v 编码的核抗原1 ( e b n a l ) 表现出t r b v 9 、 t r a v 2 0 和t r a v 2 9 的优势增长。另有研究表明，h i v 病毒的k f l1 抗原可诱导 t r a v 5 和t r b v l 9 的优势增长【3 0 1 。展开研究t 细胞库的选择对于疾病的疫苗开 发和免疫治疗具有和重要的意义。 3 c d 4 分子 c d 4t 淋巴细胞表面的i 型跨膜糖蛋白，是t 淋巴细胞表面重要的分子标志 【3 l 】，主要表达于胸腺及成熟的t 细胞表面，作为m h ci i 限制性1 1 1 细胞和部分 胸腺细胞的表面受体，c d 4 分子参与t c r 介导的n l 细胞增殖活化和胸腺细胞 发育过程【3 2 , 3 3 j 。 在免疫应答中，c d 4 分子可作为共受体分子或粘附分子发挥作用，增强c d 4 + t 淋巴细胞与a p c 表面m h ci i 类分子结合的稳定性 3 4 】；另外，c d 4 分子也可以 3 中山大学硕士学位论文 徐胜威 作为一种信号传递分子，参与促进t 淋巴细胞的激活【3 5 】：c d 4 分子利用其n 端 免疫球蛋白超家族( i g s f ) 可变( v ) 结构域与a g m h ci i 类分子的砣和p 2 结 构域结合，从而使胞质内p 5 6 k k 激酶分子被激活，通过磷酸化途径的级联反应使 得t 淋巴细胞被激活。目前认为在细胞内c d 4 与t c r c d 3 复合物结合在一起， 共同对免疫应答起调节作用【3 6 3 7 。 利用过继转移c d 4 + t 细胞的模型和c d 4 + t 细胞基因敲除鼠实验已证实：在 无c d 8 + t 细胞的情况下，c d 4 + t 细胞具有肿瘤抑制的能力【3 8 】。另有实验结果表 明激活的c d 4 + t 细胞可能诱导迟发型超敏反应，吸引炎症细胞以及n k 细胞到 肿瘤细胞附近，如移除c d 4 + t 细胞则导致肿瘤浸润的巨噬细胞缺失，肿瘤不能 被保护【3 9 1 ，这表明c d 4 + t 细胞可以直接激活淋巴结或巨噬细胞。虽然有研究表 明起始c d 8 + t 细胞的激活不需要c d 4 + t 细胞【柏】，但也有研究显示在c d 8 + t 细 胞的激活阶段需要c d 4 + t 细胞的辅助【4 1 1 。此外，c d 4 + t 细胞对于维持c d 8 + t 细胞的记忆和促进其存活也是重要的【4 2 】。 4 c i ) 3 分子 c d 3 分子表达于成熟t 淋巴细胞表面，与t c r 以非共价连接，由丫、6 、 、t 1 五种亚基组成 2 4 1 。c d 3 分子五个亚基的胞质区都含有免疫受体酪氨酸活化 基序( i t a m ) ，其中c d 3 分子的丫、6 、链各含有一个i t a m 序列，而和t 1 链 分别含有三个和两个i t a m 序列【4 3 1 。当t c r 结合由m h c 分子递呈的抗原肽后， 致使i t a m 酪氨酸发生磷酸化，结合具有两个串联s h 2 结构域的蛋白酪氨酸激 酶分子，引起蛋白酪氨酸激酶的激活，并将识别信号转入t 细胞 4 4 4 引。 5 c i ) 8 分子 c d 8 是t 淋巴细胞表面的i 型跨膜糖蛋白，是t 淋巴细胞表面重要的标志 性分子之一m ，主要表达于c t l 、抑制性t 细胞( t s 细胞) 和n k 细胞表面【4 7 ， 4 8 1 。c d 8 分子作为t c r 的辅助受体参与外来抗原的识别和递呈，增加 t c r - m h c a g 三元复合体结构的稳定性，专一性地识别m h ci 类分子所递呈的 抗原肽 4 9 1 。除此之外，c d 8 分子还可作为粘附分子，以不依赖于t c r 的方式与 4 斜带石斑鱼c d 8 a 和c d 8 1 b 基因克隆及表达模式分析 m h c1 分子结合，这种相互作用加强了m h c 与t c r 之间的亲和力【5 0 】。 5 1c d 8 分子的组成与结构 c d 8 分子可能存在多种构型，天然的c d 8 分子由c d 8 a 和c d 8 1 b 两种亚基 构成，组成方式主要以两条c d 8 a 链组成同二聚体c d 8 a a 和由一条c d 8 a 链和 c d 8 1 3 链组成异二聚体c d 8 a 1 3 e 5 ，目前也有实验发现在脊椎动物的某些组织中存 在c d s l 3 f l 同二聚体结构【5 2 1 。 1 9 7 5 年，c a n t o rh 等【5 3 1 在鼠中首次发现c d 8 分子，当时c d 8 分子被命名为 l 弘2 和l y t - 3 ，其中l y t - 2 相当于现在的c d 8 a 链，l y t 一3 相当于现在的c d 8 1 3 链。 编码小鼠的c d 8 a 、c d 8 1 3 的l y t - 2 和l y t 3 基因定位于第6 号染色体，各有二个 等位基l y t 2 a ，l y t 2 b 和l y t 3 ，l y t 3 b ，分别编码l y t - 2 1 、l y t 一2 2 和l y t 一3 1 和 l y t 3 2 t 5 4 】；在人类中，c d 8 a 链是由l e u - 2 a 基因编码，c d 8 1 3 链由l e u - 2 b 基因编 码【5 5 1 。c d 8 a 和c d 8 1 3 链i g v 样区约含1 0 0 个氨基酸残基，与1 9 1 c 和i 酚轻链的 v 区有3 0 3 5 同源性，与t c rv a 和v p 有2 4 同源性【5 6 1 。比较不同物种的c d 8 a e d n a 序列，发现变异主要集中于c d 8 a 分子胞外可变区，而信号肽、跨膜区和 胞内区变化不大，胞内区较为保守。 5 2c d 8 a 链的分子结构 c d 8 a 是一个功能类似而且较为保守的跨膜蛋白，约由2 3 0 个氨基酸构成， 包含一个信号肽，一个i g 高变区，然后是富含脯氨酸的铰链区，之后是较为保 守的跨膜区和胞质区。在哺乳类中，胞质区还包含一个保守的p 5 6 k k 结合位点， 但在硬骨鱼中缺乏此保守基序【5 7 1 。在整个蛋白序列中半胱氨酸残基一直是人们 研究的焦点。在哺乳类，c d 8 a 可变区的两个半胱氨酸残基在各物种中是高度保 守的，这两个残基在链内可以形成二硫键，另外两个保守的半胱氨酸残基在二聚 体的形成中起重要作用【5 8 枷】。 5 3 c d 8 1 3 链的分子结构 c d 8 1 3 长约1 9 0 个氨基酸，包含一个由2 1 个氨基酸组成的信号肽，然后是： i g 高变区，铰链区，跨膜区以及胞质区。在人的c d 8 1 3 中存在6 个o 糖基化位 点和一个n 糖基化位点【6 l 】；第2 0 位和9 5 位的半胱氨酸残基形成了c d 8 1 3 链内 二硫键，第1 3 4 位和1 4 7 位的半胱氨酸残基参与链间二硫键的形成【6 2 】。有报道 称c d 8 1 b 还有一条异构体( c d 8 1 b 2 ) ，现已证明c d 8 1 b 与其异构体是由两条相似 中山大学硕士学位论文徐胜威 的c d n a 分别编码的，且在较小的一条c d n a 的5 端有一段可删除的受体结合 序列【6 3 。 5 4c d 8 分子的分布 c d 8 分子除了表达于c t l 、t s 细胞和n k 细胞表面外，在巨噬细胞、肥大 细胞和树突状细胞表面也有少量表达_ t 6 4 j 。在异基因骨髓移植病人中可出现t c 脚6 c d s a a 表型的t 细胞，n k 表面的c d 8 分子也为c d 8 a a 同型二聚体，此外，通 过细胞分泌和胞膜外分子脱落实验，发现在血清中存在着可溶性c d 8 分子 3 4 1 。 5 5c d 8 分子的粘附作用 c d 8 分子不但是区分t 淋巴细胞亚群的标志性分子，还是具有一系列重要 免疫学功能的跨膜分子【5 3 1 ，有实验结果表明t 细胞的激活在某种程度上依赖于 这种c t l 表面标志的免疫学功能【6 5 1 。t c r 与m h ci - a g 复合物发生作用需要 c d 8 a 链与m h c 分子上的a 3 结构域的结合，c d 8 作用于m h ci a g 复合物后 可以稳定m h ci 类分子限制的t 细胞与靶细胞结合，提升c t l 对靶细胞的黏附 力【6 6 1 。通过c d 8 a a a g m h c 复合体的结构分析发现，两条c d 8 子链与m h c 分 子的结合是有差别的，其中一条链起着7 5 的主导作用，而p 链在两者配接中 所起的作用目前仍不清赳6 7 1 ，对于a l s t c r 而言，c d 8 分子最重要的功能是参与 t 细胞活化【6 引。与c d 8 c t 不同，c d 8 b 链由于缺乏胞内酪氨酸磷酸化位点，因此 不直接参与蛋白酪氨酸激酶p 5 6 k k 的t 细胞信号转导通路，c d 8 1 5 链独特结构可 能起着强化c d 8 a 链与激酶p 5 6 k k 的作用【6 9 1 。也有研究表明c d 8 分子p 链参与 细胞膜表面脂筏的形成【7 0 】。最近的研究还揭示了小鼠肠上皮下t 淋巴细胞中 c d s a a 同型二聚体分子可作为肠上皮组织屏障，行使免疫调节的功能【7 l 】。c d 8 a a 分子可以以不依赖t c r 的方式单独与非经典的m h ci 类胸腺白血病抗原( t l ) 结合，形成小鼠肠道组织与外界环境之间的屏障【7 2 1 。 5 6c d 8 的信号转导作用 c d 8 是蛋白酪氨酸激酶p 5 6 k k 路径的组成部分，c d 8 a 链通过尾部s h 2 结构 与蛋白酪氨酸激酶p 5 6 酞结合【7 3 1 。t c r 依靠其跨膜区锚定在c t l 细胞上，通过 其多变区v 吖p 环识别m h ci 类分子递呈的抗原肽，这依赖于c d 8 分子与m h c i 多肽0 【3 区的结合，c d 8 不直接参与t c r p m h c 的反应，只协同p 5 6 k 。酪氨酸 激酶将信号传导给t c r c d 3 来调解t 细胞活性【鲫。c d 8 通过与m h ci 的a 3 6 斜带石斑鱼c o g a 和c d 8 b 基因克隆及表达模式分析 的结合，首先活化p 5 6 姚，继而活化t c r c d 3 复合体【7 3 1 。c d 3 信号传导体由三 个亚基组成，c d 3 i e 和c d 3 7 e 异型二聚体均存在一个酪氨酸激酶激活基序 ( t k a m s ) ，在c d 3 鹳同型二聚体含有三个酪氨酸激酶激活基序，协同c d s a 链 与t c r 的信号传递7 4 1 。 6 鱼类的细胞毒作用及c d 8 分子研究现状 淋巴细胞对其它细胞的杀伤现象的发现源于1 9 6 0 年g o v a e r t s 的报道【7 5 1 。目 前鱼类细胞毒作用机理的研究还不够深入，但可以说明鱼类和哺乳动物一样具有 c t l 亚群 7 6 】，目前研究的较多的是细胞介导的细胞毒反应( c e l l m e d i a t e d c y t o t o x i c i t y ，c m c ) 。 特异性c m c 由t c 细胞执行，在他们细胞表面，被感染的细胞将病毒多肽 递呈到t c r + c d 8 + t c 细胞的m h ci 上【7 7 7 8 1 。t c r 和m h ci 结合后导致细胞介 导的胞毒反应，反应的结果依赖于t c r 和m h ci 及多肽抗原的相容性。因此， 这个过程受m h ci 限韦l j t 7 9 。通过m h ci ，t c r 和c d 8 的研究发现鱼类与哺乳 动物在抗原递呈方面存在相似性【8 0 - s 2 1 。在虹鳟和鲤鱼中研究中已证实p 2 一微球蛋 白具有稳定m i - i ci 的分子的作用【8 3 s 4 1 。另外，涉及胞内装载m h ci 多肽链的 基因如低分子量蛋白质l m p s 和鱼类的抗原加工相关转运子t a p 已经相应被报 导和测序 7 6 1 。在抗原识别过程中，t c r s 被整合到c d 3 t c r 复合体，这是胞内 信号传导的关键。与哺乳类类似，所有鱼类的c d 3 链都含有基于免疫受体酪氨 酸活化基序( i t a m s ) ，i t a m s 中包含有信号传导中的磷酸化位尉8 5 】。t c r 和它 的辅助分