环境化学物的特殊毒性及其评价-遗传毒性

第六章环境污染物的特殊毒性及其评价 主讲教师 刘薇大连理工大学环境学院 生态毒理学 Ecotoxicology 一般毒性和特殊毒性 急性毒性亚慢性毒性慢性毒性蓄积毒性局部毒性 致突变作用致癌作用生殖和发育毒性 一般毒性 特殊毒性 安全性评价 3 污染物致突变作用机理 4 污染物致突变的不良后果 5 污染物致突变作用的评价 2 遗传损伤的类型 第一节环境化学物的致突变性及其评价 小鼠骨髓细胞微核实验 环境毒理学实验 1 引言 突变 mutation 是一种遗传状态 可以通过复制而遗传的DNA结构的任何永久性改变 突变 自发突变诱发突变 1 引言 1 1环境致突变作用 environmentalmutagenesis 化学物质及其他环境因素导致生物体遗传机构的改变 可以导致人类的某些遗传性疾病且与癌症的发生有关 1 引言 1 引言 1 2环境致突变作用研究简史 遗传毒理学 GeneticToxicology 化学性和放射性因素的致突变作用和机理 对人类接触致突变物引起的健康效应和预防措施的科学 研究内容 潜在的致突变作用致突变作用机制建立新的检测方法评价致突变物对人类健康的威胁 1 引言 1 3环境致突变剂 EnvironmentalMutagen 9 2 遗传损伤的类型 机制 以DNA为靶 不以DNA为靶 基因突变 染色体结构畸变 染色体数目畸变 细胞水平 分子水平 损伤牵涉范围 显微镜可见度 基因突变 染色体突变 基因组突变 碱基置换 移码突变 大段损伤 染色体数目畸变 染色体结构畸变 DNA链中正常的碱基配对 A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶C 胞嘧啶G 鸟嘌呤 A 腺嘌呤T 胸腺嘧啶G 鸟嘌呤C 胞嘧啶 2 遗传损伤的类型 2 1基因突变 基因突变 genemutation 基因中DNA序列的改变 又称为点突变 2 1基因突变 移码突变 从mRNA到蛋白质翻译过程中遗传密码子读码顺序的突变 使基因产物发生大的改变 引起明显的表型效应 常导致致死性突变 大段损伤 DNA序列上有较长的一段序列的重排分布 也叫DNA重排 2 1基因突变 2 2染色体突变 染色体突变 chromosomalmutation 染色体结构的改变 又称为染色体畸变 断裂剂 clastogen 能引起染色体畸变的外源化学物 染色单体型畸变 染色体型畸变 a染色单体断裂 b三辐射体 c 染色体断片 d 双着丝点染色体e 环状染色体f g 无着丝点断片 2 2染色体突变 2 3基因组突变 基因组突变 genomicmutation 基因组中染色体数目的改变 又称为染色体数目畸变 1 大加合物代表物 多环芳烃 生物毒素 黄曲霉毒素B和芳香胺类后果 DNA的立体构象发生明显变化 阻断受损部位DNA的半保留复制和转录 2 化合物的致突变机理 2 1DNA加合物和交联分子的形成 苯并 a 芘 芳香胺 黄曲霉毒素B 2 小加合物代表物 烷化剂 亚硝基化合物后果 对DNA的构象影响较小 易导致碱基错误配对 DNA甲基化 乙基化 2 1DNA加合物和交联分子的形成 3 DNA DNA交联 DNA分子上一条链的碱基与互补链上的相应碱基形成共价连接 代表物 如亚硝酸 丝裂霉素C 氮和硫的芥子气 各种铂的衍生物后果 DNA在复制中不能解链 螺旋局部形成 DNA复制和转录完全停止 细胞死亡 丝裂霉素C 碱基类似物 与天然碱基的结构非常相似的外源化合物后果 引发碱基替代突变 2 2碱基类似物在DNA复制时的掺入 亚硝基引起的氧化脱氨反应 NH2OH的致突变作用作用机制复杂 不同PH NH2OH浓度 产物不同 烷化剂的致突变作用硫酸二甲酯 甲基磺酸乙酯 乙基磺酸乙酯 MNNG 2 3DNA分子上碱基的化学修饰 2 4嵌合剂的致突变作用 原黄素 丫啶橙 代表物 丫啶橙 原黄素等丫啶类染料分子方式 以静电吸附形式嵌入DNA单链的碱基之间或DNA双螺旋结构的相邻核苷酸之间后果 移码突变 化合物的致突变机理 1 碱基损伤致突变物改变或破坏碱基的正常结构 1 碱基错配 2 平面大分子嵌入DNA链 3 碱基类似物取代 4 碱基化学结构改变或破坏2 DNA链结构损伤 1 形成嘧啶二聚体 2 形成DNA加合物和DNA 蛋白质交联物 3 影响细胞分裂过程 4 对修复酶的影响 激活原癌基因或灭活抑癌基因 化学 物理 生物因素 原癌基因点突变原癌基因扩增染色体易位与基因重排原癌基因抑制解除抑癌基因缺失 原癌基因抑癌基因 癌基因 致突变因素 机体对突变的修复 遗传毒性的后果及其形成机制 致突变作用 体细胞突变 生殖细胞突变 良性肿瘤 恶性转化 细胞衰老 分化的胚胎细胞受损 未分化的胚胎细胞 显性致死 隐性致死 存活突变 动脉硬化 未知疾病 癌变 老化 出生缺陷 流产 死胎 癌变 出生缺陷 功能或结构畸形 流产死产 出生缺陷基因负荷 先天性疾病 3 遗传毒性检测实验 2染色体畸变试验哺乳动物细胞染色体畸变试验微核试验显性致死试验小鼠遗传易位试验 3DNA损伤与重组试验细菌DNA修复试验程序外DNA合成试验姊妹染色单体交换 SCE 试验SOS显色试验 SOSchromotest 1基因突变试验原核细胞微生物试验真核微生物试验昆虫试验哺乳动物体细胞体外试验小鼠基因突变试验 3 1原核细胞微生物试验 Ames试验 利用鼠伤寒沙门氏菌组氨酸缺陷型突变株 根据受试物是否诱发沙门氏菌突变型 his 回复为野生型 his 的形成菌落的能力 测定受试物 Ames试验方法 顶层琼脂培养基混匀 Ames试验标准菌株和敏感性 标准菌株TA97移码突变TA98移码突变TA100碱基置换突变TA102碱基置换突变 对醛类 过氧化物及DNA交链剂比较敏感 脂多糖突变 rfa 增加细胞壁的通透性uvrB缺失DNA损伤后修复力降低R因子增高诱变率 哺乳动物细胞 正向 突变试验 细胞株 小鼠淋巴瘤细胞 L5178Y 中国仓鼠肺细胞 V79 中国仓鼠卵巢 CHO 人成纤维细胞或淋巴细胞 哺乳动物细胞野生型 BrDU 死亡 3 2哺乳动物体细胞致突变体外试验 3 3染色体畸变试验 细胞受到诱变剂的作用后 染色体数目和较大范围的结构改变 在细胞分裂中期 利用光学显微镜下直接观察到这些变化 体外实验中国仓鼠卵巢细胞中国仓鼠肺细胞外周血淋巴细胞 体内实验小鼠骨髓细胞染色体畸变试验小鼠睾丸细胞 细胞分裂周期 原理 染色体畸变试验方法 急性试验染毒一次亚急性试验连续染毒5天慢性实验连续染毒3个月 淋巴细胞培养细胞 中期相细胞 受试物 培养基 染色体数目结构 秋水仙素阻止纺垂丝形成 处死前2 4h腹腔注射 体外实验 染色体畸变 染色体结构异常裂隙 断裂 缺失 微小体 着丝点环 无着丝点环等数目异常多倍体或非整倍体 3 4微核试验 在致突变剂作用下 染色体损伤产生的无着丝点染色体断片和环 在细胞分列时不能定向移动进入细胞核 残留在细胞质中 微核的着色和细胞核相同 比正常细胞核小 本试验可以检测受试物的染色体断裂作用和非整倍体诱变作用 微核试验方法 外周血淋巴细胞微核试验细胞培养微核试验植物细胞非哺乳类动物细胞 3 5显性致死试验 雄鼠 连续染毒5天从染毒第一天起经过一个精子发育周期 大鼠60天 小鼠35天 未交配过的雌鼠同笼5天 妊娠12 14天剖腹 检查活胎数 早死胎数 晚死胎数 3 6姊妹染色单体交换试验 SCE SCE是指一个同源染色体内 两个染色单体之间DNA复制产物发生互相交换 可能与染色体断裂和重接有关 判断受试物是否具有DNA损伤作用 SCE试验原理示意图 第一次细胞分裂 BrDU BrDU掺入到新合成的DNA链 第二次细胞分裂 BrDU掺入到新合成的DNA链 SCE交换 BrDU 遗传毒理学试验可信性评价 实验方法灵敏性 特异性 准确性 Ames试验17 19 89 3 10 30 20 29 69 骨髓细胞染色体畸18 18 100 2 10 20 20 28 71 变试验或微核试验显性致死试验18 18 100 8 10 80 26 28 93 遗传毒性检测实验组合原则 1 应包括每一类型的遗传终点 应能检出基因突变 染色体断裂 重组作用 非整倍体或多倍体改变 Ames试验 微核试验 细菌DNA修复试验 SCE 2 应包括进化程度不同的物种 3 体内外实验配合 体外试验应有体外活化系统 4 应包括生殖细胞和体细胞 USEPA遗传毒性评价试验程序 特异座位试验形态学改变生物化学改变 体内骨髓细胞遗传学试验染色体畸变试验微核试验 Ames试验 体外哺乳动物细胞基因突变试验 与