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项目信息表项目中文名称反向斑点杂交技术在预测抗癫痫药物致皮肤严重不良反应中的应用项目英文名称An application of reverse dot blot in prediction of cutaneous adverse drug reactions induced by antiepileptic drugs.申报指南代码项目申报单位名 称北京三博脑科医院通讯地址北京市海淀区香山南路香山一棵松50号邮 编100093单位类别医疗机构中央所属 军队所属企业所属 区县所属其他组织机构代码卫生机构市属卫生机构区县所属卫生机构组织机构代码研究机构市属科研院所组织机构代码单位性质 全额拨款单位（ ） 差额拨款单位（ ） 民营单位（ ）单位上级主管部门组织机构代码合作单位序号单 位 名 称无项目申请人姓 名王梦阳性别男 女出生年月1975年8 月学 历博士职 称主治医师联系电-项目组成员总人数 7人高级2人中级2人初级2人其他1人起始时间2012年 1 月终止时间2014年 12 月项目活动类型应用基础研究 应用研究 技术开发与推广研究 其它 预期成果专利 技术标准 新产品 新工艺 新装置 新材料计算机软件 论文 专著 研究报告 其他 经费预算10.4万元专项经费8万元匹配经费2.4万元其他经费0万元项目摘要(400字以内)临床常用的抗癫痫药物（AEDs）卡马西平（CBZ）、奥卡西平（OXC）、拉莫三嗪(LTG)及苯妥英钠(PHT)引起皮肤过敏反应的几率较高，其中Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(TEN)的死亡率达30%。亚洲人群HLA-B*1502等位基因与CBZ诱导的SJSTEN高度相关，特别是汉族人群。其他三种AEDs可能也与HLA-B*1502或HLA-B*1301、Cw*0801 及DRB1*1602其中的某几个等位基因高度相关，因此在处方以上四种AEDs时有必要对相关等位基因进行筛查，特别是CBZ，而目前国内尚未立法批准。本研究率先将快速、经济、准确的反向斑点杂交技术（RDB）应用于该项筛查，拟分别入组对四种AEDs 出现严重皮肤不良反应的患者及对照各10例，以DNA测序结果作为基因型诊断的金标准，统计应用RDB技术的时间成本、经济成本及准确率，结果与DNA测序为金标准进行对照。通过该项研究，我们首先要确认CBZ及以外三种AEDs致皮肤严重不良反应的相关等位基因，其次要确立RDB技术在该反应等位基因筛查中的优势地位，为实现商业化生产及尽快推进立法提供依据及技术支持。关键词：（5个以内）反向斑点杂交，抗癫痫药物，皮肤严重不良反应，基因多态性一、立题依据（限1000-2000字，附主要参考文献目录）1.国内外研究现状临床常用的抗癫痫药物(AEDs)中，卡马西平（CBZ）、奥卡西平（OXC）、拉莫三嗪(LTG)及苯妥英钠(PHT)的皮肤过敏反应较常见。以CBZ为例，它已在中国上市三十多，是局灶性癫痫及全面性强直阵挛发作的一线AEDs。服用CBZ 的患者中，约有16%会出现轻微皮肤过敏反应，极少病人可能引起严重过敏反应(约23/1000)，甚至致命。其表现程度从轻度斑丘疹到超敏反应综合征，甚至到严重的大疱性损害Stevens-Johnson综合征(SJS)和中毒性表皮坏死溶解症(toxic epidermal necrolysis，TEN)。严重皮肤不良反应的病死率可高达301-3。粗略计算，中国900万癫痫患者，服用以上4种药物的人数超过500万，如果用药不当，1-2万人会出现严重皮肤过敏反应，数千人可能因此而死亡。很多临床医生并不深晓该事件的严重性，即使有所认识，也无法提前预判。但是，2004年CHung等1一篇划时代的研究使这种预判成为可能。此后，多项来自台湾、香港、中国大陆、泰国、新加坡、泰国、马来西亚、印度及欧美、非洲的研究重复出了Hung的结果，显示 HLA-B*1502等位基因与CBZ诱导的SJSTEN的相关性有明显的种族特异性，亚洲人群HLA-B*1502等位基因与CBZ诱导的SJSTEN高度相关，特别是汉族人群。因此在汉族人群中检测HLA-B*1502基因可作为预防CBZ诱导的严重皮肤不良反应的一种重要手段4-15。2010年CHung等最新研究表明，OXC和PHT引起的SJSTEN也与该位点高度相关，LTG也有一定相关性，此外PHT引起的SJSTEN还与HLA-B*1301、Cw*0801 及DRB1*1602高度相关16，但后述结果并未得到广泛重复和认可。Locharernku17在2011年综述显示，HLA-B*1502等位基因筛选费用远低于SJS的治疗费用。因此，在处方以上药物时，相应等位基因位点的筛查非常必要，这将大大减少因严重皮肤不良反应带来的医疗支出及死亡风险。包括台湾、美国、澳大利亚在内多个国家的抗癫痫协会及食品、药品监督管理局均立法或发表声明，要求医生给汉族人处方CBZ时应检测HLA-B*1502等位基因。而我国则还未出台相应的立法文件，这与筛查费用较贵、方法不够简单、缺乏相应设备及人员有关。目前文献通用的监测方法为序列特异性PCR（SSP），国外进口的试剂盒比较昂贵，进行科研工作是很好的选择，但是用于临床显然成本过高。常用的有：Micro SSP HLA Class IB Locus Specific( OneLamda, Canoga Park, CA, U.S.A.) 5 ，价格2800元（税前），8次；Micro SSP HLA ABDR Typing Kit ( OneLamda, Canoga Park, CA, U.S.A.) 9，18650元（税前），40次；PG1502 DNA detection kit (Pharmigene，台湾)10，进货渠道不畅。上述方法对PCR仪要求较高，需要昂贵的实时荧光定量PCR仪（real-time PCR），价格20-30万元，在中国当前的国情下不利于该检测在基层医院的推广。另外，也有研究使用反向线点杂交技术（RLD），试剂盒采用HLA-B sequence-specific oligonucleotide reverse line blot (Dynal Biotech，Lafayette Hill, Pennsylvania, USA) 10，价格46000元（税前），100次，同时需要配备RELI -Scan及相应软件，价格50000元（税前）。使用国外试剂盒，如包括提取DNA、PCR成本在内，检测一个等位基因位点的成本在400-500元之间，4个位点的成本至少1600元，远超国人承受能力。国内的几项研究普遍采用前述SSP方法，但所用试剂为研究者合成12-15，因荧光标记引物价格昂贵，每个等位基因位点检测成本不低于120元，4个位点达480元，且准确率和稳定性低于国外试剂盒，同样需要配备昂贵的实时荧光定量PCR仪。然而，一味追求价格低廉势必牺牲监测的准确性和稳定性。比如等位基因特异性PCR方法每个位点的成本估计仅10-20元左右（包括DNA提取等），但结果不稳定，不可直接用于临床。直接测序虽然准确，且价格不断走低，每个反应30左右元即可，但测序仪非常昂贵，不能常规配置，如到生物公司送检通常需要等待2-3个工作日，用于多个样品和个位点监测，检验成本均会大幅增加。2.研究目的与意义综上所述，我们设计该研究的目的就是要：1.确认CBZ及以外三种AEDs致皮肤严重不良反应的相关等位基因；2.建立一种更适合中国国情的筛查方法，以便普及并促进相应的立法工作，其具备如下特征：1)使用方便、高效、灵敏、价格便宜2)结果易于阅读3)仅需配备低端PCR仪（5万元以内）即可完成，4)适用于多个样品、多位点检测且不显著增加监测成本反向斑点杂交技术(reverse dot blot，RDB)能满足这种要求。它较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交具有快速、简便、高敏感性、特意性强的特点，尤其是基因分型、基因突变检测，病原体的检测等方面有其独特的优势。获得PCR扩增产物目的片段后，仅需杂交、洗膜(实现了洗膜条件同一化，无需不同洗膜条件)、显色、结果判定。杂交过程在3小时即可完成，加上DNA提取和PCR时间，7-8小时之内可以显示结果。既适用于少量标本的分型检测，也可适用于大量标本的同时分型18。结果显示时，将多个等位基因位点整合在一张膜条上，这将极大方便结果的阅读。 前述美国Dynal Biotech公司开发的HLA-B sequence-specific oligonucleotide reverse line blot试剂盒应用了RLB技术，该技术与RDB原理相似，但用于更多位点的筛查，不适合少数几个等位基因的检测，但从中我们可以明确“核酸杂交技术在该筛查中的应用已得到认可”。RDB技术成熟、可靠，在国内已经用于地中海贫血、肝豆状核等疾病基因突变的检测，如能应用于AEDs致严重皮肤不良反应等位基因的筛查，将大大推动该检测向广大基层医疗机构普及，从而挽救成千上万患者的生命。参考文献1Chung WH,Hung SI,Hong HS,et a1Medical genetics:a marker for StevensJohnson syndromeNature,2004,428:4862Hung SI,Chung WH,Jee SH,et a1Genetic susceptibility to carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions. Pharmacogenet Genomics. 2006,16:297-3063Chung WH, Hung SI. Genetic markers and danger signals in stevens-johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis. Allergol Int. 2010, 59(4):325-332.4Man CB,Kwan P,Baum L,et a1Association between HLA-B*1502 Allele and Antiepileptic Drug-Induced Cutaneous Reactions in Han ChineseAuthors. Epilepsia,2007,48:101510185Locharemkul c,Loplumlert J,Limotai C,et a1Carbamazepine and phenytoin induced Stevens-Johnson syndrome is associated with HLAB1502 allele in Thai populationepilepsia,2008,49:2087-20916Hung SI,Chung WH,Chen YTHLAB genotyping to detect carbamazepine induced Stevens-Johnson syndrome:implications for personalizing medicinePersonalized Medicine,2005,2:225-2377Yang CW,Hung SI,Juo CG,et a1HI_A-B1502bound peptides:implications for the pathogenesis of carbamazepine induced Stevens-Johnson syndromeJ Allergy Clin Immunol,2007,120:870-8778Wang Q, Zhou JQ, Zhou LM, et al. Association between HLA-B*1502 allele and carbamazepine-induced severe cutaneous adverse reactions in Han people of southern China mainland, Seizure, 2011, 20:446-448.9Chang CC, Too CL, Murad S, et al. Association of HLA-B*1502 allele with carbamazepine-induced toxic epidermal necrolysis and StevensJohnson syndrome in the multi-ethnic Malaysian population. International Journal of Dermatology, 2011, 50:221-214.10Chen P, Lin JJ, Lu CS, et al. Carbamazepine-Induced Toxic Effects and HLA-B*1502 Screening in Taiwan. New England Journal of Medicine, 2011, 364:1126-1133.11Min FL, Shi YW, Liu XR. HLA-B*1502 genotyping in two Chinese patients with phenytoin-induced Stevens-Johnson syndrome. Epilepsy & Behavior, 2011, 20:390-391.12Hu FY, Wu XT, An DM. Pilot association study of oxcarbazepine-induced mild cutaneous adverse reactions with HLA-B*1502 allele in Chinese Han population. Seizure, 2011, 20:160-162.13Zhang Y, Wang J, Zhao LM, et al. Strong association between HLA-B*1502 and carbamazepine-induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in mainland Han Chinese patients. European Journal of Clinical Pharmacology, 2011, 67: 885-887.14Wu XT, Hu FY, An DM, et al, Association between carbamazepine-induced cutaneous adverse drug reactions and the HLA-B*1502 allele among patients in central China. Epilepsy & Behavior, 2010, 19:405-408.15An DM, Wu XT, Hu FY, et al. Association study of lamotrigine-induced cutaneous adverse reactions and HLA-B*1502 in a Han Chinese population. Epilepsy Research, 2010, 92:226-230.16Hung SI, Chung WH, Liu ZS,et al. Common risk allele in aromatic antiepileptic-drug induced Stevens-Johnson syndrome and toxic epidermal necrolysis in Han Chinese. Pharmacogenomics, 2010 , 11(3):349-356.17Locharernkul C, Shotelersuk V, Hirankarn N. Pharmacogenetic screening of carbamazepine-induced severe cutaneous allergic reactions. J Clin Neurosci. 2011, 18(10):1289-1294.18Li D, Liao C, Li J, Huang Y,et al. Prenatal diagnosis of beta-thalassemia by reverse dot-blot hybridization in southern China. Hemoglobin, 2006, 30(3):365-370.二、研究目标与内容1.拟解决的关键问题确认卡马西平（CBZ）、奥卡西平（OXC）、拉莫三嗪(LTG)及苯妥英钠(PHT)所致皮肤严重不良反应与HLA-B*1502、HLA-B*1301、Cw*0801 及DRB1*1602四个等位基因的相关性，并能够通过快速、经济的方法准确地监测出相应结果。2.研究目标 通过反向斑点杂交技术，将同时多个样品进行4个等位基因筛查的时间压缩在8小时以内，准确率不低于98%，每个样品单价控制在100元以内。3.研究内容1）受试者入组：四种AEDs 出现严重皮肤不良反应的患者及对照（用药后无皮肤过敏）各10例（总计80例）；2）DNA提取：全血DNA试剂盒提取；3）用反向斑点杂交技术、基因测序分别筛查HLA-B*1502、HLA-B*1301、Cw*0801 及DRB1*1602四个等位基因；4）统计反向斑点杂交技术检测所需时间、准确率、成本，准确率以测序作为金标准。4.特色与创新点将反向斑点杂交技术用于预测抗癫痫药物皮肤过敏反应，该技术可将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的样品DNA互不干扰，能一次性筛查多种不同的序列，大大提高筛查效率，为制定相关法律奠定技术基础。三、研究方案1.研究对象口服4种抗癫痫药物严重皮肤过敏反应患者及对照各10例（总计80例）。2.研究方法（1）DNA提取：使用全血基因组DNA极速抽提试剂盒，按说明书方法提取细胞基因组DNA，产物于紫外分光光度仪上测定DNA含量；（2）使用Primer4.0设计等位基因引物；（3）ABI梯度PCR仪PCR扩增；（4）反向斑点杂交方法（RDB）：首先，串联重复ASO探针的构建制备。ASO探针的长度一般为20个碱基，突变位点位于探针的中13部分。探针通常为两份，一份与正常基因序列杂交，一份与突变序列杂交，正常与突变探针除了在基因突变点处核苷酸不同外，其余序列都是相同的。通过控制洗脱温度，使正常探针只能与正常基因杂交而不与突变序列杂交，反之亦然。在本课题中，我们用连接探针单元的方法获得了串联重复ASO探针，探针长度在300500bp之间，克隆入载体后，用载体通用测序引物扩增其插入序列，片段长度为450650bp，这种长度的片段可以牢固结合于尼龙膜上。在探针单元两侧插入5个核苷酸(1inker)分割和连接探针单元，使每个单元都能发挥杂交作用而不至于“挤在一起”。根据突变位点设计好正常突变探针单元后，需要再分别设计他们的反向交错互补链。互补链的5端与探针链突变点位置的后一位核苷酸相对应，其中间与探针链的3端互补，两条链伸出的5端分别是对方的5端互补序列，这样在退火后探针链与互补链就可以首尾排列起来。探针链自身连接反应；连接DNA片段的回收纯化、探针与T载体的连接大肠杆菌DH5a感受态细胞的制备转化大肠杆菌DH5a感受态细胞、筛查挑选菌落(菌落PCR)、SDS碱裂解法制备质粒DNA：小量制备其次，制备杂交膜。将提取的质粒稀释20倍，作为PCR的模板，扩增质粒中插入的相应的探针序列。取2ul PCR产物，以15琼脂糖凝胶电泳，紫外透射仪下观察扩增情况。取适量PCR产物，加入400ul碱变性液，混匀后室温放置15分钟。用点样器将变性的PCR产物抽真空点在尼龙膜上，正常探针点成一行，对应的突变探针点在第二行)，抽干后加入400ul中和液，真空抽干。将膜条取出，放在纸巾上使其干燥，紫外交联仪交联固定，真空包装后，室温下避光保存。第三，反向斑点杂交。将待用的探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，每个探针一个点并编上号，再将待测的DNA样本(PCR扩增产物，在PCR引物5端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，这样待检样本就会与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本，由于待测的DNA样本具有生物素类的标记物，结合了待测DNA的探针点上就带有生物素类的标记物，再经相应的显色反应就能显出杂交信号。同一条膜上的多种探针同时与不同扩增的PCR产物进行杂交，并要求所有结合于膜上的探针应有大约相同的Tm值。观察结果，阳性反应显示蓝色斑点，不显色的提示不杂交。（5）焦磷酸测序方法：PCR扩增产物直接送生物公司测序。3.技术路线被试入组流程图DNA提取引物设计PCR探针制备测序反向斑点杂交两种方法时间、准确率及成本比较4.统计方法花费的时间、成本比较使用t检验，准确率比较使用卡方检验。5.组织实施与管理措施主要由三博脑科医院神经内科分子生物实验室组织实施，由科教部负责管理。四、工作基础与优势1.申请者及研究组主要成员的研究经历及研究成果(近5年)在癫痫分子遗传学方面，王梦阳博士有5年分子生物学实验经验，曾负责多个有关癫痫分子遗传学方面的研究，熟练掌握DNA和RNA提取、RT-PCR和MSP-PCR，能够熟练搜索NCBI、UCSC数据库，应用生物信息学知识合理分析各种DNA变异。刘兴洲教授曾是卫生部全国重点学科项目“遗传性运动障碍疾病的临床、电生理、分子生物学研究” 项目负责人及国家自然科学基金“Machado-Joseph病的临床病理分子生物学研究”项目的主要参与者，并获得国家科技进步二等奖和卫生部科技进步一等奖。其他参加人员在癫痫病学及分子生物学方面也经验丰富。1Wang M, Wu L, Zheng Y, Zhang Q, Li C.The Chinese QOLIE-AD-48: Translation, validity, and reliability. Epilepsy Behav 2009, 14(3): 476-80. 2王梦阳, 吴立文, 刘兴洲. 中文版青少年癫癎患者生活质量问卷信度及效度检验. 癫癎与神经电生理学杂志. 2011, 20(4): 210-17.3王梦阳, 刘兴洲, 陈述花, 张玮, 隋伟, 王静, 王海祥, 李学秀. 携带新生SCN1A突变的婴儿严重肌阵挛癫痫1例. 第四届北京三博国际神经科学论坛. 2010:130-131. 4王梦阳, 吴立文, 林华, 王铮, 黄尚志. 一个中国北方遗传性癫(癎)伴热性惊厥附加症家系的基因定位研究. 癫癎与神经电生理学杂志. 2010, 19(2): 77-81.5王梦阳, 吴立文, 卢强, 金丽日, 刘秀琴, 黄颜. 国际抗癫痫联盟国际癫痫综合征分类可分类率比较及架构分析. 中华神经科杂志. 2009, 42(7): 440-445.6王梦阳, 吴立文. 儿童良性癫(癎)伴中央颞区棘波遗传学研究进展. 中华神经科杂志. 2008, 41(9): 638-640.7王梦阳, 董立羚译. 特发性全面性癫痫. 任连坤主译. 癫痫发作和综合征的诊断与治疗.北京: 中国协和医科大学出版社. 第一版, 2008, 248-319.8王梦阳译. 婴儿重症肌阵挛性癫痫.刘兴洲主译. 癫痫性脑病及其远期预后.北京:人民卫生出版社. 2010, 29-39.9Lin H, Li J, Wang M, Wang Z, Wang Y, Wu L. Mutation screening of three Chinese families with genetic epilepsy with febrile seizures plus. Neurosci Lett. 2011,500(2):123-8.10Lv RJ, Wu LW, Jin LR, Lu Q, Wang MY, Liu H. Reliability and validity of a Chinese version of the Impact of Pediatric Epilepsy Scale. Epilepsy Behav. 2009,16(1):150-5.11陈晏, 吴立文, 房岳, 王梦阳, 许琪, 沈岩. 夜发性额叶癫痫三家系临床和遗传学特征. 中华神经科杂志. 2009, 42(6):386-389.12林华, 王玉平, 王梦阳, 吴立文.全面性癫痫伴热性惊厥附加症家系致病基因的连锁定位和突变分析.中华医学杂志. 2008, 88(12):3177-3188.13林华, 王玉平, 王梦阳, 吴立文.中国10个全面性癫痫伴热性惊厥附加症家系的临床特征分析.脑与神经疾病杂志. 2009, 17(1): 5-8.2.单位科研条件及保障措施三博脑科医院癫痫中心是完全按照国际三级癫痫中心标准建立的以癫痫内外科、临床电生理、影像学、心理学综合一体的大型医疗中心。每年就诊的癫痫患者达3000人，其中80%至少会使用卡马西平、奥卡西平、拉磨三嗪、苯妥英钠中的一种。神经内科分子实验室能够完成DNA、RNA提取、PCR、核酸杂交等分子遗传学实验，已开展临床及科研工作多年。我院对科研重视程度极高，通常会在资金人员方面给予获得科研基金的项目给予支持。这些为保证本研究的顺利进行奠定了坚实的基础。3.政策法律法规保障 该研究所有内容符合国家法律法规的规定。 五、研究进度与考核指标年度时间（年、月）研究内容考核指标第一年2012.1-2012.12入组15例严重皮肤不良反应患者，15例对照，分别用两种筛查方法检测4个等位基因位点完成率不低于80%第二年2013.1-2013.12入组15例严重皮肤不良反应患者，15例对照，分别用两种筛查方法检测4个等位基因位点完成率不低于80%第三年2014.1-2014.12入组10例严重皮肤不良反应患者，10例对照，分别用两种筛查方法检测4个等位基因位点。统计数据，课题总结。完成率不低于80%六、预期成果与知识产权管理1.预期成果形式：包括技术标准与规范、人才培养、学科建设、论文、专著、专利、成果、新项目等。预期培养硕士研究生一名，发表1篇综述、1篇核心期刊论文、1篇SCI论文。形成反向斑点杂交检测抗癫痫药物致皮肤严重不良反应等位基因的技术规范，为该项目在临床推广奠定基础。2.社会效益和经济效益每年中国新增癫痫患者数十万人，加上周围神经痛而口服卡马西平患者，数字有百万之众，产生严重皮肤不良反应的患者近万人。进行癫痫药物过敏反应等位基因筛查可避免易感人群服用上述抗癫痫药物，从而减少严重皮肤不良反应的发生率，挽救数以千计患者的生命。反向斑点杂交技术将筛查时间缩短到2小时以内（测序通常需要2-3天），成本较酶切及测序低廉，而准确率与测序接近，因此更符合卫生经济学要求，如能商品化，将更有利于该项筛查在基层医院的推广。3.知识产权归属与管理归属北京三博脑科医院。七、医学伦理管理与风险分析1.研究中的伦理问题及对策 本研究涉及被试者DNA，需要签署知情同意书，使研究符合伦理要求。2.研究中的技术、政策、管理等风险分析及对策反向斑点杂交探针的制作是关键，需提高实验室无菌水平，购买相应设备。在政策和管理方面风险较低。伦理问题：（1）疾病预知与处理的两难问题：等位基因筛查并不能保证患者百分之百没有皮肤不良反应的风险。特别是轻微的皮肤不良反应与以上等位基因关联不密切。（2）个人心理负担与家庭关系稳定问题：基因检测具有自身的风险，主要体现在心理负担上。受检者对是否存在与某种严重疾病有关的基因，对检验结果焦急的期待可能引起抑郁；（3）社会歧视与舆论压力问题：当有基因缺陷患者的遗传密码被破解并记录在案时，他们可能遭到来自社会各方面的压力。对策：1知情同意原则；2基因隐私保护原则；3尊重个人遗传特征原则- 15 -八、项目组成员项目申请人姓 名性别年龄职务/职称业务专业任务分工为本项目工作时间（%）所在单位身份证号签字王梦阳男36主治医师癫痫病学、分子遗传学实验设计、实验操作60%北京三博脑科医要研究人员姓 名性别年龄职务/职称业务专业任务分工为本项目工作时间（%）所在单位身份证号签字刘兴洲男62主任医师神经病学、神经电生理、癫痫病学入组及诊断50%北京三博脑科医述花女副主任医师神经病学、神经影像学、癫痫病学入组及诊断50%北京三博脑科医玮男