[毕业设计精品]茶多酚在窒息大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用.doc

茶多酚在窒息大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用 2008级硕士研究生学位论文 独 创 声 明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得（注：如没有其他需要特别声明的，本栏可空）或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日-学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国学术期刊（光盘版）电子杂志社将本学位论文收录到中国优秀博硕士学位论文全文数据库并通过网络向社会公众提供信息服务。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名： 导师签字：签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日目 录一、论文 茶多酚在窒息大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用1英文缩略语42中文摘要 53英文摘要 84论文主体前言 12第一部分 茶多酚对窒息大鼠心肺复苏后生存时间及神经功能的影响 材料与方法 14结果16讨论20结论21参考文献22第二部分 茶多酚对窒息大鼠心肺复苏后血sod、mda及脑形态学的影响材料与方法26 结果28 讨论29结论32参考文献325全文小结37 二、综述 综述 脑缺血再灌注损伤机制及茶多酚的保护作用38三、致谢 49四、在学期间发表论文 50英文缩略词 缩略词英文全称中文全称cprcardiopulmonary resuscitation心肺复苏cacardiac arrest心脏骤停tp tea polyphenols茶多酚rosc restoration of spontaneous circulation自主循环恢复sbp systolic blood pressure收缩压dbp diastolic blood pressure舒张压 map mean arterial pressure 平均动脉压nds neurological deficit score神经缺失评分sodsuperoxide dismutase超氧化物歧化酶mdamalondialdehyde丙二醛-茶多酚对窒息大鼠心肺复苏后脑损伤的保护作用摘 要心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation，cpr）后脑功能的恢复是衡量复苏成败的关键因素之一。心脏骤停（cardiac arrest，ca）时全身组织器官缺血缺氧，而再灌注后自由基的生成及其带来的一系列继发病理损害成为导致脑功能障碍的重要因素，如何避免或减轻脑功能损伤成为当前研究的热点。茶多酚（tea polyphenols，tp）有很强的抗氧化作用，其所包含的酚羟基能与氧自由基及脂质过氧化物结合而阻断氧化链的反应。在脑局部缺血再灌注损伤实验研究中已证实茶多酚具有保护脑的效果。心脏骤停与心肺复苏的过程同样可导致全脑缺血再灌注损伤，茶多酚是否同样具有保护复苏后脑功能呢？目前尚不清楚。基于以上原因，本文旨在通过建立窒息性大鼠心脏骤停模型，对复苏后大鼠即刻应用茶多酚，观察茶多酚对复苏后大鼠生存时间及神经功能的影响，并通过检测不同时间点的血超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, sod）、丙二醛（malondialdehyde，mda）值的变化、观察脑形态学改变，初步探讨其是否具有脑保护作用。方法：1、健康sd大鼠84只，体重320-440 g，于呼气末夹闭气管插管诱导窒息性心脏骤停，8min后给予胸外心脏按压及机械通气。按压1min时给予肾上腺素0.04mg/kg，复苏失败者排除实验，恢复自主循环的大鼠经静脉即刻随机给予盐水（2ml/kg, n=40）或茶多酚（10mg/kg，n=40），观察自主循环恢复（restoration of spotaneous circulation，rosc）后1h内收缩压（systolic pressure，sbp）、舒张压(diastolic pressure，dbp）及平均动脉压（mean arterial pressure，map）的变化，rosc后大鼠的存活时间及复苏后24h、48h大鼠神经缺失评分（neurological deficit score, nds）及存活率。2、健康sd大鼠，体重320-440g，随机分成空白对照组及模型组，空白对照组（n=5）仅麻醉、手术，不进行窒息和复苏，采用同样的方法复制大鼠窒息致心脏骤停模型，恢复自主循环的大鼠随机分成两组，分别经静脉即刻给予盐水（2ml/kg, n=52）或茶多酚（10mg/kg, n=24），每组再以存活到12h、24h、48h时间分为3组，每组5只大鼠。分别观察各组各时间点血清sod、mda值，各组各时间点取脑海马组织观察病理改变。结果：1. 茶多酚组与盐水组rosc 1h内sbp、dbp、map无明显统计学差异，茶多酚组大鼠的生存时间明显长于盐水组（37.311.2h vs 24.314.1h, p0.05），茶多酚组rosc后24h、48 h 生存率明显高于盐水组（p0. 01），且24、48 h nds评分显著好于盐水组（p0.05）。2. 茶多酚组大鼠心肺复苏后24h、48h血中sod含量明显高于盐水组（p0.05 ）；茶多酚组大鼠心肺复苏后12h、24h、48h血中mda值显著小于盐水组（p0.05或p0.01）；盐水组及茶多酚组12h的大脑海马ca区病理改变差异不明显，盐水组24h、48h大脑海马ca区损伤程度明显重于茶多酚组。结论：1. 茶多酚明显延长窒息大鼠心肺复苏后的存活时间并减轻复苏后神经功能损伤。2. 在窒息大鼠心肺复苏后经静脉立即给予茶多酚能提高血中sod活性，抑制脂质代谢，同时减轻脑组织病理改变。关键词 茶多酚；窒息；心脏骤停；心肺复苏；脑保护the effect of tea polyphenols on brainprotection during postresuscitation in ratsabstractobjectives: the recovery of cerebral function is an effective evaluation measures for the cardiopulmonary resuscitation (cpr). the whole body and organs were under ischemic anoxia while cardiac arrest (ca). oxygen free radicals and the series of consequences are the main harmful effects on brain after reperfusion. how to prevent this overall tendency effectively becomes the hot point？tea polyphenols had strong antioxidant effect and could prevent the oxidizing reaction by its phenolic hydroxyl group combined of oxygen free radicals and lipid peroxides. its protection of the brain was confirmed in the cardio cerebral ischemia reperfusion study. the process of cpr and ca could cause the cerebral ischemic reperfusion in the same extent, thus it also lead to reperfusion injury. whether tea polyphennols protect the brain after cpr remains unclear. based on the above reasons，this experiment was to testify whether tea polyphenols protect the brain through the enhancing effect of superoxide dismutase （sod）and reduce the yield of malondialdehyde（mda）generated by lipid oxide in an asphyxia rat model after being treated with tea polyphenols intravenously following rosc。methods: 1. eighty-four spraguedawley rats, weighing 200-400 g, were anesthetized by intraperitoneal injection of 3ml/kg chloral hydrate. a 14-gauge cannula was inserted orally. cardiac rhythm was monitored with a standard lead ii ecg. a pe-50 catheter was advanced into the left formal vein for drug treatment. another pe-50 catheter was advanced into the left formal artery for measurement of aortic pressure. asphyxial cardiac arrest was induced by clamping the tracheal tubes. cardiac arrest was determined by loss of aortic pulsations and mean aortic pressure 10mmhg. at the end of 8 min of asphyxiation, cpr was started. ventilation was performed with a volume-controlled small animal ventilator (alc-v9, shanghai alcott biotech co. ltd, china), with room air at 70 breaths per min and tidal volume adjusted to 6 ml/kg. mechanical chest compression was performed at a rate of 180 compressions per min with equal compression-relaxation duration. epinephrine was treated at 1 min of compression. restoration of spontaneous circulation (rosc) was defined as the return of supraventricular rhythm with a mean aortic pressure of 20mmhg for a minimum of 5min. resuscitation efforts were discontinued in case failing to restore spontaneous circulation at 5 min following the initiation of cpr(n=4). the animals were intravenously treated randomly with either saline (sal-gro, n =40) or 10mg/kg tea polyphenols (tea-gro, n =40) following rosc. the changes of systolic pressure（sbp）、diastolic pressure (dbp)、mean arterial pressure(map)were monitored after an hour of rosc. survival time, neurological deficit score (nds) and the survival rate were recorded after 12, 24 and 48 h of rosc respectively .2. eight-six sprague-dawley rats, weighing 200-400g, were randomly divided into control group and model group. in control group, rats were only treated with anesthesia, and underwent surgical operation. in model group, the asphyxia rat model was established as part one. after restoration of spontaneous circulation, the model rats were randomly divided into two groups and immediately given intravenous saline (1ml / kg, n = 52) or tp (10mg/kg, n = 24). each group was divided into 3 groups according to the 12h, 24h, 48h time points, and took five rats accordingly. the changes of sod, mda in serum were assayed and cerebral pathological changes were observed with the set point 12h, 24h, 48h.results:1. there was no significant difference in sbp, dbp, and map within one hour of post-resuscitation in the tp group and the saline group. the survival time of rats in tp group was significantly longer than that of in saline group (37.311.2hvs24.314.1h, p 0.05), 24h and 48h survival rates in tp group after rosc was also significantly higher than the saline group (p 0.01), and the 24, 48 h nds score also significantly higher (p 0.05).2. the blood sod of 24h, 48h after rosc was significantly higher in tp group than in saline group (p 0.05), the blood mda of 12h, 24h, 48h time was significantly less in tp group than in saline group (p0.05 or p0.01). there was no significant difference of brain hippocampus pathologic between the two groups at 12h point, while at the 24h and 48h, rats of the saline group had more necrosis neurons than that of tp group.conclusion:1. tea polyphenols ensured a prolong survival time of the rats as well as which also reduced neurological damage after cardiopulmonary resuscitation in asphyxia models.2. tp increased the serum activity of sod, inhibited the reaction of lipid metabolism and alleviated the injury of cerebral pathology after cpr in an asphysixal rat model. key words tea polyphenols，asphyxia, cardiac arrest, cardiopulmonary resuscitation前 言随着心肺复苏（cardiopulmonary resuscitation, cpr）技术的普及和提高， 心脏骤停（cardiac arrest, ca）患者心肺复苏的成功率明显提高，自主循环恢复（restoration of spontaneous circulation,rosc）率已达25-501-3，院外发生的心脏骤停，心肺复苏后的自主循环恢复率约为2 -93,4，院内心肺复苏的自主循环恢复率可达185，但复苏存活患者中完全康复出院者仅占存活患者的5左右6。schoenenberger等7研究指出院外心脏骤停患者心肺复苏后脑功能不全是出院率下降的主要死因之一。复苏后脑损伤的原因与复苏后带来的一系列病理生理变化相关联，包括复苏后氧自由基的损伤、能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、钙超载、炎性反应等综合因素8,9。而自由基损伤作为其中一个重要因素，其引起的损伤波及到双侧大脑皮层或丘脑，就会发生意识障碍，甚至呈植物状态；波及到基底节和小脑，可能出现共济失调等。因此阻断自由基造成的损失，将提高患者的远期生存。基于上述背景，如果在心肺复苏后立即给予抗氧化的药物，是否可以阻止或减轻氧自由基对脑的损伤，最终起到保护脑功能，提高复苏后的存活率及康复出院的机会？茶多酚是从茶叶中提取的一种化学物质，其分子中包含有羟基结构，其抗氧化作用远高于vitc、vite10,11，tp能夺取过氧化过程中产生的脂质过氧化自由基，生成活性较低的多酚自由基，阻断自由基氧化链。同时tp的邻位二酚羟基具有较强的络合金属离子性能，络合游离铁而减轻自由基的生成和链反应的催化作用，发挥抗过氧化的作用12。tp还可通过络合细胞内钙而降低钙浓度，防止钙超载及其所带来的一系列继发性的病理损害13。tp还对细胞内抗氧化防御系统有协同及激活作用，进而强化其抗氧化作用。在局部脑缺血再灌注损伤模型研究表明：tp通过其抗氧化作用对神经元起保护作用14-19。本研究试图把局部脑缺血再灌注损伤模型中取得较好疗效的tp引入到复苏领域，旨在通过建立窒息性心脏骤停大鼠模型，对复苏后大鼠即刻应用茶多酚，观察其否能减轻复苏后大鼠的脑缺血再灌注损伤、提高复苏大鼠的生存时间和改善神经功能，为今后探索及改善心肺复苏后脑功能损伤的治疗药物和方法提供了一条新思路。茶多酚对窒息大鼠心肺复苏后存活时间及神经功能的影响心肺复苏后的脑功能障碍影响患者的长期生存18,19，主要与缺血再灌注后氧自由基的生成、细胞内钙离子超载等综合原因引起的脑损伤有关20-22。茶多酚具有极强的抗氧化及清除自由基的作用23,24，在脑局部缺血再灌注损伤的实验模型中已证实tp可明显减轻脑损伤13-17，但对心肺复苏后脑缺血再灌注损伤的保护作用尚未见有研究报道。本研究通过建立窒息性心脏骤停大鼠模型，对复苏后大鼠即刻应用茶多酚，观察其是否可以延长复苏动物的存活时间并改善脑功能障碍。1. 材料与方法1.1 主要仪器与设备alc-v9动物呼吸机 上海奥尔科特生物科技有限公司bl-420f生物机能实验系统 成都泰盟科技有限公司小动物胸外按压器 空气压缩机 上海捷德机械电器有限公司1.2 试剂与药品(其他为国产分析纯)10%水合氯醛注射液 第一附属医院5%葡萄糖氯化钠注射液 武汉滨湖双鹤药业有限责任公司0.9%氯化钠注射液 武汉滨湖双鹤药业有限责任公司肝素钠注射液 上海第一生化药业有限公司盐酸肾上腺素注射液 广州白云山明兴制药有限公司0.05%茶多酚溶液 自制1. 3动物的准备 选用健康sd大鼠84只，雌雄不拘，体重200400g（由实验中心提供）。大鼠经腹腔注射10%水合氯醛（3ml/kg）麻醉、经口气管插管插入14g套管以备接呼吸机用。经左侧股动脉插入一条pe50管以测动脉压，经同侧股静脉插入另一条pe50管以便用药，经四肢皮下针头常规记录标准ii导联心电图，bl - 420f生物机能实验系统(四川成都泰盟仪器公司)连续同步记录心电图、动脉压。1. 4实验方案：sd大鼠均在呼气末夹闭气管8分钟，造成窒息性心脏停搏模型后开始心肺复苏14。用定容型小动物呼吸机（alc-v9, 上海奥尔科特生物科技有限公司，中国）行机械通气（室内空气），通气频率70次/min，潮气量为6ml/kg，自制的按压器进行胸外心脏按压，频率180次/min。按压深度为大鼠胸廓前后径1/3，按压1min时给予肾上腺素 0.04mg/kg，复苏5min内未能恢复自主循环者定义为复苏失败，退出实验（n=4）。复苏5min内恢复自主循环的大鼠定义为复苏成功，将其随机分成两组，继续以下实验：经股静脉给予盐水（sal-gro，2ml/kg, n=40）或茶多酚（tp-gro, 10mg/kg, n=40），持续监护心电和血压变化60min。1小时后撤离呼吸机、拔除动静脉导管并缝合伤口，呼吸恢复后拔除气管插管，放入笼中，观察2天内存活时间， 24h、48h的存活率，并在24h、48h进行神经缺失评分。1.5诊断标准心脏停搏定义为动脉搏动波消失且伴有平均动脉压20mmhg，持续5min以上26；自主呼吸定义为rosc后，在机械通气的条件下，大鼠出现自主呼吸5次/min；撤离呼吸机标准定义为大鼠出现自主呼吸40次/min，停用呼吸机1min后血压、心率和呼吸状况稳定或持续好转；生存时间定义为从自主循环恢复到自主呼吸消失27。1.6 神经缺失评分(neurological deficit score, nds)参照jia等28 的神经功能评分方法，从意识、基本反射、运动、感觉、行为学等方面对存活大鼠在rosc后各时间点（24h、48h）进行神经功能评定，评分范围为0-80分，0分为死亡，80分为完全正常，评分由两人分别测定后取平均分值。详细评分方法见附件。1.7统计学处理 采用spss13.0软件进行统计分析，计量资料用均数标准差(s)表示，比较用t检验，计数资料用2检验或秩和检验，p0.05为差异有显著的统计学意义。2. 结果2. 1复苏前两组大鼠相关参数比较 窒息前两组大鼠的体重、心率、血压等参数、窒息到心脏停搏时间，比较无明显差异，见表1-1。表1-1 两组大鼠基础参数比较( s)组 别茶多酚组（n=40）盐水组（n=40）体重（g）330.189.6331.5.695.9心率（次/分）418.425.6426.831.2收缩压（mmhg）136.124.1134.821.9舒张压（mmhg）103.718.894.420.0平均动脉压（mmhg）118.020.5111.020.1窒息到心脏停搏时间（sec）245.9.332.1237.337.0复苏前体温（。c）35.81.036.30.92. 2自主循环恢复（rosc）时间和存活时间 两组大鼠rosc时间无显著性差异。但rosc后，茶多酚组大鼠的存活时间明显长于盐水组（p0.05），见表1-2。表1-2自主循环恢复时间和存活时间的比较(s)组 别自主循环恢复 (s)存活时间(h)盐水组（n=40）116.349.524.314.1茶多酚组（n=40）99.636.437.311.2* 与盐水组比较，*，p0.05 2.3 两组大鼠不同时间点存活率比较rosc后，茶多酚组大鼠24h、48 h 存活率明显高于盐水组(p0.01)，见表1-3。表1-3两组大鼠不同时间点存活率比较组 别24h48h盐水组（n=40）52.5%（n=21）15.0%（n=6）茶多酚组(n=40)85.0%*（n=34）40.0%*（n=16） 与盐水组比较，*，p0.012. 4 两组大鼠神经缺失评分比较 rosc后茶多酚组大鼠24h、48h nds评分明显高于盐水组（p0.05），见表1-4。表1-4两组大鼠nds评分比较m(p25，p75)组 别24hnds48hnds盐水组35(0,54) 0(0,0)茶多酚组57(47,62) *0(0,68) * 与盐水组比较， *，p0.052.5 rosc后血压的比较2.5.1 rosc后，茶多酚组和盐水组大鼠的sbp比较差异无统计学意义，见图1-1。图1-1 自主循环恢复60分钟后两组大鼠收缩压比较（p0.05）figure1-1 the comparison of the sbp between the two groups after rosc 60min (p0.05) ,（bl=baseline,基础状态；pr=post resuscitation, 复苏后）2.5.2 rosc后，茶多酚组和盐水组大鼠的dbp比较差异无统计学意义，见图1-2。图1-2自主循环恢复60分钟后两组大鼠舒张压比较（p0.05）figure1-2 the comparison of the dbp between the two groups after rosc 60min(p0.05), （bl=baseline,基础状态；pr=post resuscitation, 复苏后）2.5.3 rosc后，茶多酚组和盐水组大鼠的map比较差异无统计学意义 ，见图1-3。图1-3 自主循环恢复60分钟后两组大鼠平均动脉压比较（p0.05）figure1-3 the comparison of the map between the two groups after rosc 60min(p0.05) ，（bl=baseline,基础状态；pr=post resuscitation, 复苏后）3.讨论复苏后中枢神经系统损伤是影响复苏成功患者者远期存活的重要因素之一18,29，如何减轻心脏骤停后脑功能的损伤已成为目前研究的热点。本研究通过建立窒息大鼠心脏骤停/心肺复苏模型，观察tp对复苏大鼠远期生存的影响。结果表明在cpr后加用茶多酚，可以显著延长大鼠的存活时间，并改善神经系统功能恢复，其作用机制尚不清楚。心脏骤停及随后实施的心肺复苏的过程也是全身器官和组织（包括心、脑）的缺血再灌注损伤过程。心肺复苏后的脑损伤的机制之一就是再灌注后氧自由基的损伤20-22：氧自由基与细胞膜和亚细胞结构的膜磷脂中不饱和脂肪酸进行氧化反应，生成脂质过氧化物，损伤线粒体膜，加重细胞能量代谢障碍；破坏酶活性和蛋白质，导致细胞结构和功能破坏；引起dna断裂及细胞变性、坏死，最终导致神经元损伤，影响复苏后脑功能的恢复。因此有效的阻断或减轻复苏后氧自由基带来的损害，可能会改善复苏患者的预后。tp是从茶叶中提取的一类含有多酚羟基化学物复合体的物质，具有抗氧化能力，减轻氧自由基，阻断自由基氧化链，抑制黄嘌呤氧化酶作用，tp还对细胞内抗氧化防御系统有协同及激活作用，进而强化其抗氧化作用。已有研究13-17证明tp在局部脑缺血再灌注损伤模型中通过其抗氧化作用取得了很好的治疗效果，但在全身缺血再灌注损伤模型是否也有相似效果尚不清楚。本实验对窒息致心脏骤停大鼠心肺复苏后即刻经静脉给予tp后在24h、48h行神经功能缺失评分结果显示：tp组nds24h、48h明显好于盐水组，24h、48h生存率也高于盐水组，提示应用tp后可明显减轻窒息诱导的心脏骤停大鼠心肺复苏后脑功能损伤，进而改善其远期生存状态，其机制可能与tp在局部脑缺血再灌注模型中的保护机制相似13-17,30，即tp通过提高脑组织抗氧化能力和抑制脂质过氧化、清除和或抑制氧自由基的作用及降低全脑缺血大脑迟发性神经元死亡作用，最终起到保护窒息大鼠心肺复苏后脑细胞功能。本实验在cpr后加用茶多酚，大鼠的sbp、dbp、map均稍低于盐水组，但其差异无统计学意义，提示该剂量的茶多酚并不影响血流动力学。4.结论茶多酚可明显改善窒息大鼠复苏后神经功能的损伤程度、显著延长复苏后大鼠的生存时间。但其确切的机制尚不清楚，有待于进一步研究。1. bobrow bj,clark ll, ewy ga, etc. minimally interrupted 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