苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究ppt课件.ppt

苯唑西林耐药金黄色葡萄球分子流行病学调查及糖肽类抗生素对葡萄球菌体外活性研究 1 孙宏莉王辉陈民钧 研究背景 2 EvolutionofDrugResistanceinS aureus 3 S aureus Penicillin 1944 Penicillin resistantS aureus Methicillin 1962 Methicillin resistantS aureus MRSA Vancomycin resistantenterococci VRE Vancomycin 1990s 1997 VancomycinintermediateS aureus VISA 2002 Vancomycin resistantS aureus CDC MMWR2002 51 26 565 567 研究背景 苯唑西林耐药的金黄色葡萄球 MRSA 是引起医院感染的主要病因 常发生于免疫力低下的住院患者 世界首例MRSA 1961年 英国目前在许多国家仍在增长 4 研究背景 世界约100 000人 年感染MRSA国疾病控制和预防中心 CDC 统计 5 研究背景 6 欧洲部分国家MRSA发生率比较 TiemersmaEW etal MRSAinEurope1999 2002 EmerginginfetiousDiseases 2004 10 9 1627 1634 研究背景 1989 2001年美国ICU病房MRSA发病率 7 美国国家医院感染监测中心 NNIS 提供 研究背景 2001 2003年协和医院MRSA发生率比较 8 研究背景 内酰胺类抗生素对金黄色葡萄球菌的作用机制 青霉素结合蛋白 PBP 是参与细胞壁肽聚糖成分合成的酶 内酰胺类抗生素能与细菌胞膜的PBP结合使其失活 从而细胞壁合成受到抑制 导致细菌死亡 9 研究背景 对 内酰胺类抗生素 如苯唑西林 耐药机制 低水平耐药 产生过量的 内酰胺酶 PBPs过量表达 PBP与苯唑西林亲和力下降 高水平耐药 产生由mecA基因编码的PBP2a 可替代其它PBP合成细胞壁 但与 内酰胺类抗生素亲和力差 而产生耐药 对其它抗生素耐药机制 mecA基因位于一个可移动元件SCCmecDNA 该元件由不同的整合子 转座子等组成 分别编码不同抗生素的耐药基因 10 MRSA耐药机制 研究背景 MRSA治疗上的困难 多重耐药有效治疗药物 万古霉素 替考拉宁 利萘唑烷 链阳霉素 甲氧苄啶 磺胺甲恶唑 氯霉素等已出现对万古霉素敏感性下降的金黄色葡萄球菌 多为MRSA在住院患者间易传播 造成爆发流行 11 研究背景 MRSA耐药性及流行病学研究对于正确治疗其引起的感染 防止其播散有重要意义 12 研究意义 技术路线 13 从协和医院2002年住院患者分离212株MRSA 表型测定 MRSA的确证 苯唑西林 盐琼脂筛选法mecA femB双重PCR法 ICU RCU病房的MRSA耐药性检测回顾性分子流行病学调查 琼脂稀释法 抗生素纸片琼脂扩散法 脉冲场凝胶电泳 替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性 14 技术路线 为临床正确防治并减少MRSA的感染提供参考依据 同源性分析 跟踪爆发流行趋势 区分新生感染 复发感染 污染菌 病原菌 15 MRSA的筛选及耐药性检测 MRSA医院流行病学调查 MRSA感染病例临床资料分析 Part1 Part2 Part3 第一部分 MRSA的筛选及耐药性检测 16 17 MRSA的表型鉴定 MRSA的确证试验 平板 PCR MRSA耐药性检测 药敏结果数据分析及处理 一 MRSA的表型鉴定 待测菌株革兰氏染色触酶试验 阳性且呈双 链 葡萄状球菌 胶乳凝集试验 测凝集因子 蛋白A 疑难菌 API系统和VITEK系统鉴定苯唑西林药敏试验 抑菌圈直径 10mm 18 二 MRSA的确证试验 19 mecA femB双重PCR法 苯唑西林 盐琼脂筛选法 苯唑西林 盐琼脂筛选试验检测MRSA 方法 参照NCCLSM100 S13文件中的规定 待测新鲜菌悬液 0 5号比浊管浊度 点种于苯唑西林 盐琼脂筛选平皿 含4 NaCl 6 g ml苯唑西林的M H平皿 空气 35 孵育24 48小时生长菌落数 1检测结果 212株中有165株金葡菌在筛选平皿生长 20 MRSA检测 mecA femB双重PCR法检测MRSA 原理及方法 mecA 编码PBP2a 苯唑西林耐药的决定子 femB 某些葡萄球菌属染色体辅助基因 编码细胞壁合成所需的一种重要酶 21 MRSA检测 mecA femB双重PCR法检测MRSA 原理及方法 mecA femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达 MRSAMSSAMRSCoNMSSCoNmecA femB 注 MRSA 苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌 MRSCoN 苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌MSSA 苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌 MSSCoN 苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌 JCM May2002 P 1821 1823 22 MRSA检测 mecA femB双重PCR法检测MRSA 原理及方法 PCR扩增mecA和femB基因所用引物 引物名引物序列扩增片段长度MecA15 GTAGAAATGACTGAACGTCCGATAA 3 310bpMecA25 CCAATTCCACATTGTTTCGGTCTAA 3 FemB15 TTACAGAGTTAACTGTTACC 3 651bpFemB25 ATACAAATCCAGCACGCTCT 3 PCR产物310bp 651b处出现荧光条带为阳性 EurJClinMicrobiolInfectDis 1999 18 643 647 23 MRSA检测 mecA femB双重PCR法检测MRSA 结果 165株筛选平皿确证的MRSA经双重PCR法进一步确证 均为MRSA M marker 1 6 PCRproducsofMRSA 7 ATCC25923 MSSA 24 MRSA检测 M1234567 三 MRSA的耐药性检测 方法 抗生素纸片琼脂扩散法 万古霉素 替考拉宁 复方新诺明 四环素琼脂稀释法 万古霉素 替考拉宁 苯唑西林 庆大霉素 左氧氟沙星 红霉素 氯霉素参照NCCLSM100 S13文件 待测菌悬液 0 5号比浊管浊度药敏培养基 M H平皿培养条件 35 空气 孵育24小时判读结果 按NCCLSM100 S13文件规定的标准数据分析及处理 WHONET 5 3软件 25 MRSA检测 MRSA的耐药性检测 结果1 26 165种MRSA对9种抗生素的药敏结果 抗生素R I S MIC50MIC90MIC值范围 苯唑西林10000646432 64替考拉宁00100220 5 8万古霉素001000 510 25 2庆大霉素1000025651232 512红霉素93 91 84 2128128125 128氯霉素0 60 698 8884 64左氧氟沙星98 21 8016324 128甲氧苄啶3 60 695 8 磺胺甲恶唑四环素96 31 22 5 耐药性检测 MRSA的耐药性检测 结果2 27 MIC法测定的万古霉素和替考拉宁对165株MRSA的MICs的散点图 耐药性检测 第二部分 MRSA医院流行病学调查 ICU RCU病房 28 29 脉冲场凝胶电泳 PFGE 耐药表型和基因型比较 一 MRSA的脉冲场凝胶电泳 原理 30 PFGE MRSA的脉冲场凝胶电泳 结果分型2 31 123456789M1011121314 2002年ICU及RCU病房MRSA主要流行株 A1亚型 1 14lanes A1亚型 共55株 M laddermarker PFGE MRSA的脉冲场凝胶电泳 结果判读 32 PFGE CDCTenover 等人推荐的方法判读 突变位点数酶切后DNA片断区别亲缘关系基因分型 0无区别同型12 3条亲缘关系密切同型但不同亚型24 6条可能存在亲缘关系同型但不同亚型 3 7条无亲缘关系不同型 1 TenoverFC JCM 1995 33 2233 2239 MRSA的脉冲场凝胶电泳 结果分型1 5种 A A1 A2 B B1 B2 B3 C D E型 33 ICU及RCU病房65株MRSA的PFGE图谱 MA1A2B1B1B2B2B3DDCEM PFGE MRSA部分病例调查结果 三 A1亚型爆发流行株 55 65株 分离时间遍布2002全年 34 临床资料 二 MRSA的耐药表型和基因型比较 35 不同基因型 不同克隆来源 相同耐药谱 表型与基因型 36 序号病房分离时间标本类型耐药谱PFGE分型 1RCU2002 2 1痰OGLERA12ICU2002 8 1痰OGLERA13ICU2002 10 3痰OGLERA14ICU2002 10 8痰OGLERA15ICU2002 10 14痰OGLERA16ICU2002 1 2血液OGLERA17ICU2002 1 8痰OGLERA18ICU2002 2 4痰OGLERA19ICU2002 4 8痰OGLERA110ICU2002 4 10导管OGLERA111ICU2002 10 3痰OGLERA212RCU2002 10 3痰OGLERB113RCU2002 1 14痰OGLERB114RCU2002 6 2痰OGLERB215RCU2002 12 2痰OGLERB216ICU2002 2 5腹水OGLERB317RCU2002 5 10导尿管OGLERC18RCU2002 11 10痰OGLERD19ICU2002 7 4痰OGLERD20ICU2002 3 2痰OGLERE 表型与基因型 注 O 苯唑西林 G 庆大霉素 L 左氧氟沙星 E 红霉素 R 四环素 MRSA的脉冲场凝胶电泳 结果小结 ICU和RCU病房2002全年都在流行着A1亚型MRSA 耐药谱分型与PFGE分型可不一致 37 第三部分 临床资料分析 38 本研究MRSA为多重耐药 基因分型同源性高 造成治疗困难 为找到合理使用抗生素策略及爆发流行源头和传播途径 对部分病例进行了回顾性调查分析 结果发现 39 临床资料 MRSA部分病例调查结果 一 调查项目调查结果疾病严重感染12 30 癌症7 30 多器官功能衰竭6 30 心 肺 肾衰各1 30年龄20岁以下1 35 20 40岁4 35 40 70岁21 35 70岁以上9 35标本来源痰51 65 血液4 65 导尿管3 65 支气管刷 洁尿各2 65 其它3 65器械治疗呼吸机17 30 置管18 30 大手术11 30 40 临床资料 MRSA部分病例调查结果 二 调查项目调查结果抗菌素使用史25 30住院期间使用过第三 四代头孢菌素 氟喹诺酮类 碳青霉烯类等广谱抗生素 改用万古霉素或替考拉宁后转归MRSA所致感染好转者占23 29 未好转者6 29同一患者不同分离株时间间隔8 65采集到不止一株MRSA 间隔至少二周 其中一位长达半年 MRSA分离时间2002年1月 12月间无明显波动 41 临床资料 第四部分 替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌 42 的体外活性检测 替考拉宁和万古霉素对葡萄球体外活性检测 方法 43 测定替考拉宁和万古霉素的MIC及抑菌圈直径 琼脂稀释法 K B法 不同种葡萄球菌 MRSA 溶血葡萄球菌 表皮葡萄球菌 不同接种浓度菌液 104cfu 106cfu 活性区别 对MIC结果的影响 琼脂稀释法与抗生素纸片扩散法药敏结果的相关性 替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌体外活性检测 结果1 不同接种浓度菌液对二种抗生素外活性影响二种抗生素对不同葡萄球菌的活性区别 44 替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测 结果2 TEC VAN对葡萄球菌的MIC法与纸片扩散法之间的相关性 45 替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外活性检测 结果小结 46 讨论 47 MRSA引起的医院感染与治疗 一 是医院感染主要病因 常发生抵抗力低下的住院患者 可引起住院患者的长期感染 不易消除 爆发流行主要途径 共用的医疗器械 如呼吸机 MRSA携带者 患者 医护人员等 48 讨论 MRSA引起的医院感染与治疗 二 抗生素选择压力下的后果 使用或改用合理抗生素治疗 多数病人迅速好转 抗生素治疗无效组 病人身体状况太差 药物很难到达有效部位或到达有效部位的抗生素浓度不足 不能完全杀灭耐药菌 49 讨论 替考拉宁和万古霉素对葡萄球菌的体外抗菌活性 替考拉宁受多种因素影响 在琼脂中扩散系数接种菌量以K B法检测的替考拉宁耐药菌株 应进一步测定其MIC 通常敏感株 金黄色葡萄球菌不稳定敏感株 凝固酶阴性葡萄球菌 如溶血葡萄球菌 细胞膜39kD的蛋白质 阻碍替考拉宁与靶位的结合 万古霉素对葡萄球菌活性较稳定 但对肠球菌活性较差 50 讨论 结论 51 MRSA耐药性特点 万古霉素和替考拉宁高敏100 复方新诺明和氯霉素敏感率较高 其它所测抗生素多重高耐 2002年ICU RCU病房发生了A1基因型MRSA流行 MRSA流行