（生物化学与分子生物学专业论文）黑曲霉外源蛋白表达分泌相关基因功能研究.pdf

摘要 丝状真菌由于其具有很强的外泌蛋白能力，f 具有与哺乳动物类似的翻译后加t 能力，已 被广泛应用于真核生物蛋白的生产。但是蛋白酶降解利分泌不足限制了外源蛋白的产最。为控 制蛋白酶降解，改善外源蚩白生产，本论文通过同源重组的方法分别阻断黑曲霉的j 个蛋白酶 基因d p p l v , d p p v ；j n p e p a c ，研究其对外源蛋白表达分泌的影响。d p p l v 和d p p v 是两种二肽蛋 白酶基因，其编码的蛋白酶d p p i v 和d p p v 从蛋白n 端切除不同的特异二肽。已有报道，米 曲霉和划曲霉中胞外蛋白的降解分别有d p p i v 和d p p v 参与。p e p a c 是从黑曲霉全基因组序列 中识别的与p e p a 同源的新基因，本论文试图通过阻断研究其编码的蛋白是否也为参与外源蛋 白降解的胞外酸性蛋白酶之一。另外，本论文通过同样的方法阻断黑曲霉的一个什露糖转移酶 基因m n n l o ，分析其对外源蛋白表达分泌的影响，并为进一步研究黑曲霉m n n l o 基因在糖蛋白 高甘露糖链合成中的作用奠定基础。 根据d p p l v d p p v 、p e p a c 和m n n l o 基因序列设计引物，p c r 扩增相应的基因片段，连接 到克隆载体p b s t 或p m w l ，基冈片段中间插入选择标记h p h 表达盒或a m d s 基冈，产生基囚 阻断质粒p b s a d p p l v - h p h 、p b s a d p p l v - a m d 、p b s a d p p v - h p h 、p b s a p e p a c h p h 和p m w l a m n n l 0 。 除p b s a d p p l v - a m d 外的其它四个阻断质粒经酶切产生被选择标记阻断的相应基冈片段后， 采用原生质体p e g 法转化己整入外源蚩白漆酶表达质粒的黑曲霉菌株g 1 c c 2 7 7 3 ，产生的转化 子经p c r 检测，筛选剑d p p l v 基冈阻断菌株a d p p l v # 1 7 、d p p v 基因阻断菌株a d p p v # 2 6 和m n n l o 基因阻断菌株a m n n l 0 # 2 。但p b s a p e p a c h p h 对黑曲霉g i c c 2 7 7 3 的转化，虽然得到2 8 6 个转 化子，未能筛选到个p e p a c 基因阻断的突变株。 本文还使用类似的方法把p b s a d p p l v - a m d 质粒转化d p p v 基因阻断菌株a d p p v # 2 6 ，获得 d p p v 、d p p l v 基囚双阻断菌株a d p p v a d p p l v # 2 - 3 。 测定这些阻断菌株外源蛋白漆酶的分泌活性，以分析对应基因的阻断对外源蛋白表达分泌 的影响。测定结果显示，d p p l v 、d p p v 和m n n l o 基冈的阻断都明显改善t p i 源蛋白漆酶的表达 分泌。在a d p p l v # 1 7 、a d p p v # 2 6 和a m n n l 0 # 2 中，漆酶分泌活性分别提高8 3 、1 7 4 和1 3 8 。往a d p p v a d p p l v # 2 3 中，d p p v , d p p i f 基冈般阻断进一步提高漆酶分泌活性，提高2 2 4 。 关键词：黑曲霉，蘑冈阻断，外源蛋白分泌 a b s t r a c t f il a m e n t o u sf u n g ia r ew i d e l yu s e di np r o d u c t i o no fe u k a r y o t i cp r o t e i nd u et ot h e i rf o l l o w i n g c h a r a c t e r i s t i c s ：h i g hs e c r e t o r yc a p a b i l i t y , p o s t - t r a n s l a t i o n a lm o d i f i c a t i o n ss i m i l a rt ot h a to fm a m m a l a n ds oo n h o w e v e rf o rp r o d u c t i o no fb e t e r o l o g o u sp r o t e i n s ，t h ey i e l d sa r es t i l lp o o r , p r o t e o l y t i c d e g r a d a t i o na n dl o ws e c r e t i o ne f f i c i e n c ya r et h em a j o rr e a s o n s t oc o n t r o lp r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o n t h u st oi m p r o v ee x p r e s s i o no f h e t e r o l o g o u sp r o t e i n ，t h r e ep r o t e a s eg e n e sd p p i v , d p p v a n d p e p a cw e r e s t u d y e dt ob ed i s r u p t e dt h r o u 曲g e n et a r g e t i n gt of u r t h e rs t u d yt h ei n f l u e n c eo ft h e i rd i s r u p t i o no n e x p r e s s i o no fh e t e r o l o g o u sp r o t e i ni nt h i sd i s s e r t a t i o n t h ed p p l va n dd p p vg e n e se n c o d et w ot y p e s o fd i p e p t i d y lp e p t i d a s e sw h i c hr e l e a s es p e c i f i cd i p e p t i d e sf r o mt h en - t e r m i n io fp o l y p e p t i d e s i tw a s r e p o r t e dt h a td p p i va n dd p p vp a r t i c i p a t e di nd e g r a d a t i o no f e x t m c e l l u l a rp r o t e i ni na o r y z a ea n da f u m i g a t u s t h ep e p a eg e n ew a sf o u n dt ob eah o m o l o go f p e p ag e n ea n dw a si d e n t i f i e dn e w l yf r o m t h eg e n o m i cs e q u e n c e so f an i g e r t h i sd i s s e r t a t i o nt r i e dt os t u d yw h e t h e rp e p a cw a sa l s oo n eo f t h e e x t r a c e l l u l a ra c i dp r o t e a s e si n v o l v e di np r o t e o l y t i cd e g r a d a t i o no fb e t e r o l o g o u sp r o t e i n i na d d i t i o n ， t h r o u g hg e n et a r g e t i n gt h em n n l og e n ew h i c he n c o d e do n et y p eo f m a n n o s y l t r a n s f e r a s ew a sd i s r u p t e d i no r d e rt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fi t sd i s r u p t i o no ne x p r e s s i o no f h e t e r o l o g o u sp r o t e i na n dt h ef u n c t i o n o f m n n l og e n ei nb i o s y n t h e s i so f h i g hm a l m a nc h a i no f g l u c o p r o t e i ni n an i g e r ： d n af r a g m e n t so fc o r r e s p o n d i n gg e n e sw e r ea m p l i f i e du s i n gt h ep r i m e r sd e s i g n e da c c o r d i n gt o t h es e q u e n c e so fd p p l v , d p p v , p e p a ca n dm n n l og e n ea n dl i g a t e dw i t hc l o n i n gv e c t o rp b s - to r p m w l t h e nh p he x p r e s s i o nu n i to ra m d sg e n ew e r ei n s e r t e di n t ot h em i d d l ep a r to fe a c hg e n et o g e n e r a t er e s p e c t i v eg e n ed i s r u p t i o np l a s m i d sp b s a d p p i v - h p h , p b s a d p p l v - a m d ，p b s a d p p v - h p h ， p b s a p e p a c - h p ha n dp m w t a m n n l 0 t h ed i s r u p t i o np l a s m i d sp b s a d p p l v - h p h ，p b s a d p p v - h p h ，p b s a p e p a c - h p ha n dp m w l a m n n l 0 w e r ed i g e s t e dw i t h r e s p e c t i v ec o r r e s p o n d i n gr e s t r i c t i o ne n z y m e sa n dt r a n s f o r m e di n t oa n i g e r g i c c 2 7 7 3s t r a i ni nw h i c hal a c c a s ee x p r e s s i o nv e c t o rh a db e e ni n t e g r a t e d t h eg e n e r a t i n g f f a n s f o r m a n t sw e r es c r e e n e df o rd i s r u p t i o ns t r a i nu s i n gp c rm e t h o d t h er e s u l t ss h o w e dt h a t a d p p l v # 1 7 ，a d p p v # 2 6a n da m n n l 0 # 2w e r ed i s r u p t i o ns t r a i n so fd p p l v , d p p va n dm n n l og e n e ， r e s p e c t i v e l y h o w e v e r ，n op e p a cd i s r u p t i o ns t r a i nc o u l db ef o u n dw h e r e a st o t a l2 8 6t r a n s f o r m a n t s f r o mt r a n s f o r m i o no f p b s a p e p a c - h p hw e r es c r e e n e d u s i n gs i m i l a rm e t h o d ，p b s a d p p l v - a m dw a st r a n s f o r m e di n t od p p vd i s r u p t i o ns t r a i na d p p v # 2 6 a n dt h ed p p l v a n dd p p v d o u b l ed i s r u p t i o ns t r a i na d p p v a d p p l v # 2 3w a sa c h i e v e d l a e e a s ea c t i v i t yw e r ea n a l y z e di nt h e s ed i s r u p t i o ns t r a i n st os t u d yt h ei n f l u e n c eo fe a c hg e n e d i s r u p t i o no ne x p r e s s i o no fh e t e r o l o g o u sp r o t e i n t h ed a t a o fe n z y m ea s s a ys h o w e dd i s r u p t i o no f d p p l v ，d p p va n dm n n l og e n ei m p r o v e de x p r e s s i o no fh e t e r o l o g o u sp r o t e i n a c e a s eb y8 3 i n a d p p l v # 1 7 ，b y1 7 4 i na d p p v # 2 6a n db y1 3 8 i na m n n l 0 # 2 t h ed o u b l ed i s r u p t i o no fd p p l v a n d d p p v f u r t h e r i m p r o v e de x p r e s s i o n o f h e t e r o l o g o u sp r o t e i nl a c c a s eb y 2 2 4 i n d p p v d p p i v # 2 3 k e yw o r d s ：a s p e r g i l l u sn i g e ，g e n ed i s r u p t i o n ，s e c r e t i o no f h e t e r o l o g o u sp r o t e i n i i l a n i g e r ，a s p e r g i l l u sn i g e r ； a n i d u l a n s ，a s p e r g i l l u sn i d u l a n s ； 缩略词表 最c e r e v i s i a e ，s a c c h a r o m y c e sc e r e s i v i a e d p p , d i p e p t i a y lp e p t i d a s e ； p e 只p e p t i d a s e m n n ，m a n n o s y l t r a n s f e r a s e ； h g y , h y g r o m y c i n ； a m d s , a c e t a m i d a s eg e n e h p h ，h y g r o m y c i nbp h o s o p h o t r a n s f e r a s eg e n e ； p p c b c ，i s o p e n i c i l l i nns y n t h e t a s e ( p c b op r o m o t e r ； h 洲h y g r o m y c i nr e s i s t a n c e a m d + ，a c e t a m i d eu t i l i z a b l e ； p e g p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ； b p ，b a s ep a i r ( s ) 独创性声明 y7 7 3 9 6 5 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究：l 作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得巾国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：薛佑 帆如f 年占月少日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生签名： 导师签名 薛够 懂啦 时间： 矽f 年参月加目 时间：夕矿月纠f 中国农业大学硕上学位论文 第一章弓 言 第一章引言 1 丝状真菌外源蛋白表达系统简述 丝状真菌作为外源蛋白的表达系统具有优越丁大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 和酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e s i v 抽e ) 系统的独特优点。e e o l i 在高表达外源蛋白时容易产生包涵体， 且缺少一些真核细胞的翻译后修饰机制，酿酒酵母分泌蛋白的能力较弱，且往往产生过度糖基 化，因此表达高等真核生物基因时，产生有活性的蛋白质比较困难。丝状真菌则具有很强的外 泌蛋白能力，并能对合成的真核蛋白较止确地进行各种翻译后加工，包括肽链的剪切、糖基化 和二硫键形成等，且较酵母更类似于哺乳动物。此外，许多菌种如黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、 米曲霉( a s p e r g i l l u so r y z a e ) 已在食品加二中长期应用，被确认是安全的。同时，丝状真菌的发 酵t 艺及下游加工技术已很成熟，这些都有利于丝状真菌基因工程菌投入工业麻用。目前，曲 霉已被成功作为宿主生产了许多外源蛋白，如牛凝乳酶、鸡蛋清溶菌酶、人白细胞介素一6 、人 乳铁蛋白平奇异果甜蛋白等( d u n n c o l e m a nn se ta l , 1 9 9 1 ；t s u c h i y ake ta t , 1 9 9 4 ；d a v i dj je t a t , 1 9 9 3 ；h i n t z w ee t a l , 1 9 9 5 ；w a r d p pe l a l ，1 9 9 5 ；f a u s i “a , 1 9 9 8 ) 。 丝状真菌具有极强的外泌蛋白能力。已有报道，在发酵过程中水霉能分泌高达4 0 克每升的 纤维素酶，而曲霉能分泌3 0 克每升的葡萄糖淀粉酶( f i n k e l s t e i ne t a l ，1 9 8 9 ；d u r a n de t a t , 1 9 8 8 ) 。 尽管丝状真菌分泌内源蛋白的能力是振奋人心的，然而外源蛋白的生产水平通常很低，在每升 几十微克至1 5 0 毫克之间，远不如内源蛋白。当然也有少数例外如在泡盛曲霉( a s p e r g i l l u s a w a m o r i ) 中构建的人乳铁蛋白基因工程菌，其人乳铁蛋白的表达量达到2 克每升( w a r d p p e t a l ， 1 9 9 5 ) 。 目前，人们在构建丝状真菌外源蛋白基因工程菌时普遍采用增加基冈拷贝数、使用强启动 子、基冈融合等策略改善外源蛋白生产，取得了明显成效，如上面提到的以曲霉为宿土生产外 源蛋白的成功例子均采用了这些策略，但是成功的只是少数，丝状真菌自身蛋白酶对外源蛋白 的降解和外源蛋白分泌的不足仍然是外源蛋白产量低的主要原因，限制了丝状真菌表达系统在 外源蛋白生产中的应用。 2 丝状真菌外源蛋白表达系统蛋白酶降解问题 丝状真菌自身产生的蛋白酶对丁蛋白的生产是个极人的障碍。与内源蛋白相比较，对外源 蛋白生产的影响更大。这些蛋白酶或是位于细胞内或是分泌到胞外，能迅速降解多种外源蛋白。 因此t 蛋白酶降解成为丝状真菌表达系统生产外源蛋向时所面临的主要问题之一。 中国农业人学硕士学位论文第一章引言 2 1 蛋白酶谱及蛋白酶对蛋白的降解研究 丝状真菌曲霉属的各个种的蛋白酶谱筹别很大并且具有种的特异性，埘黑曲霉的蛋白酶谱 分析表明其主要产酸性蛋白酶。目前，已从黑曲霉的培养上清中纯化山四种酸性蛋白酶，包括 两种天冬氨酸蛋白酶p e p a 、p e p b 和两种丝氢酸羧肽酶p e p f ( o rc p d i i ) 、p e p g ( o rc p d i ) ( k r i s h n a ne ta l , 1 9 8 6 ；k r i s h n a ne la h1 9 8 6 ；t z f l c a h a s h ie ta l , 1 9 9 1 ：b e r k ae ta 1 1 9 9 0 ；d a ld e g a ne l a l ，1 9 9 2 ) ，这正是以黑曲霉为宿主时内源和外源蛋白遭受降解的主要原因。编码这些蛋白酶的 基因以及另一个编码胞外s u b f i l i s i n 相似蛋向酶p e p d 的基因都已克隆( b e r k ae t a t , 1 9 9 0 ；l n o u ee l a l , 1 9 9 1 ：v a i ld e nh o m b e r g he ta t , 1 9 9 4 ；j a r a ie ta t , 1 9 9 4 a ) 。此外，与酵母囊泡蛋白酶极其类似的 三种蛋白酶的基因p e p e ，p e p c ，e p y 也已克隆( j a r me ta l ，1 9 9 4 b ；f r e d e r i c ke ta l ，1 9 9 3 ；y a v e re ta l ， 1 9 9 5 ) ，推测它们可能与蛋白的非特异降解相关。v a nd e n h o m b e r g h 等( 1 9 9 7 ) 以牛血清白蛋白 为底物分析了各蛋白酶在总蛋白酶谱中所占的比例，其中p e p a 和p e p b 分别占胞外酸性蛋白 酶的8 4 h6 ，p e p e 占胞内蛋白酶活性的6 8 。近几年在黑曲霉中义有多个蛋白酶基因被克 隆，包括一个二肽蛋白酶基因d p p l v ( o r d a p b ) ( j a l v i n ge l a l ，2 0 0 5 ) ，一个k e x i n 相似成熟酶基 闪k e x b ( j a l v i n g e a l ，2 0 0 0 ) 四个氨肽酶基因( 赖氨酸，精氨酸氨肽酶基因a s p a 、丙氨酸，精氨 酸氨肽酶基因a s p b ，苯丙氨酸氨肽酶基因a s p c 和脯氨酸氨肽酶基因p a p a ) ( b a s t e ne t a l ，2 0 0 1 b ； b a s l e np ta l ，2 0 0 1 a ；b a s t e ne ta l ，2 0 0 3 ；b a s t e ne ta l ，2 0 0 5 ) 。在泡盛曲霉中，b e r k a 等( 1 9 9 0 ) 证明p e 队的破坏可使其对胞外蛋白的降解减少到野生株的2 0 ，黑曲霉中有类似报道( m a t t e m e t a l , 1 9 9 2 ) 。v a nd e n h o m b e r g h 等( 1 9 9 7 ) 进行了体外降解实验确定培养滤液中蛋白酶对敏感蛋 白果胶降解酶p e l b 降解的影响，结果表明，在p e p a ，p e p b 和p e p e 基因分_ ；被阻断的菌株中， 培养滤液对p e l b 的降解都减少了，证明黑曲霉中这三个基因编码的蛋白酶都与p e l b 的降解 相关。另外，他们还构建了双基因和三基因阻断株，在三基因阻断株中p e l b 降解仪为野生株 中的0 0 1 0 0 0 2 。这些研究表明，以曲霉为宿主生产外源蛋白时存在严重的蛋白酶降解问题。 目的蛋白不仅由于共分泌的蛋白酶降解而且还会受胞内蛋白酶的作用( g o u k ae ta l ，1 9 9 6 b ) 以 及从自溶的苗丝中释放至培养液的蛋白酶的作用( c a r r e z de l a t , 1 9 9 0 ) 。 2 2 克服蛋白酶降解提高外源蛋白产量的策略 2 2 1 优化培养条件 黑曲霉分泌的大量胞外蛋向酶主要是酸性蚩白酶，并且受低p h 诱导( d e n i s o n ，2 0 0 0 ) 。所以， 工艺上保持较高p h 值可抑制蛋白酶分泌，降低外源蛋白降解( f a u s ie l a t , 1 9 9 8 ) 。o d o n n e l l 等 ( 2 0 0 1 ) 报道，与在p h 3 条件下生长相比，黑曲霉在p h 6 条件下生长时，胞外酸性蛋白酶活性下 降剑1 5 ，绿色荧光蛋白g f p 的产量提高十倍。 2 2 2 使用蛋白酶缺陷受体 蛋白酶基冈的阻断或敲除是控制蛋白酶降解、改善丝状真菌表达系统的有效方案。目前， 丝状真菌许多蚩白酶基因已被克隆并用于构建特定蛋白酶缺陷的菌株。b e r k a 等( 1 9 9 0 ) 克隆 了编码内源a s p e r g i l l u s i n a ( p e p a ) 的基因，并且通过同源重组方式阻断了生产株中的该基冈， 2 中国农业大学顾士学位论文 第一章引言 使得牛凝乳酶的表达分泌水平显著提高。m o r a l e j o 等( 2 0 0 0 ) 将2 0 0 b p 的片段通过p c r 重组插 入p e p a 基因中，获得一泡盛曲霉蛋白酶缺陷株，井以此为宿主，使奇异果甜蚩白的产量由原 来的5 - 1 5 r n g l 增加为8 0 1 0 5 m g l 。m o r a l e j o 等( 2 0 0 2 ) 又报道，泡盛曲霉p e p b 基因阻断使 外源奇异果甜蛋白的产量提高4 5 至1 2 5 。随着构巢曲霉叫s p e r g i l l u sn i d u l a n s ) 、烟曲霉 ( a s p e r g i l l u sf u m i g a t u s ) 和黑曲霉的基冈组测序的完成，更多的蛋白酶基因将被鉴定和研究并 用于蛋白酶缺陷受体的构建，从而更有效的克服蛋白酶降解问题。 通过诱变方法，也已经分离到丝状真菌部分蛋自酶缺陷株( m a t t e mi ee t o 1 9 9 2 ；3 e r k a r m e l a t , 1 9 9 0 ) 。刘丽等( 2 0 0 2 ) 崩i i v 诱变黑曲霉，获得部分酸性蛋白酶缺陷株，用作基因工程受体 株。在黑曲霉中猪的磷脂酶a 2 和人白细胞介素6 的产量由于诱变导致a s p e r g i l l u s i n 的缺少而 明显增加( r o b e , se la , 1 9 9 2 ；b r o e k h u u s e ne ta t , 1 9 9 3 ) 。m a l l e m 等( 1 9 9 2 ) 用诱变处理筛选到 一株酸性、中性、碱性蛋白酶几乎完全缺陷的黑曲霉，以此为宿主表达鸡脂肪酶，其分泌量比 诱变前宿主的分泌量有大幅度提高。 3 丝状真菌蛋白分泌途径研究 随着对丝状真菌表达系统的不断研究，人们意识到，除了蛋白酶降解外，外源蛋白产量不 高的主要障碍可能在分泌途径。蛋白分泌途径是涉及多个细胞器的复杂过程，任何一步都有可 能成为外源蛋白表达分泌的限制步骤( b a r t k e v i c i u t ee ta l ，2 0 0 4 ) 如，转位、折叠、加t 、糖 基化、转运以及细胞壁对外源蛋白的通透性等。因此，国际上许多实验室已开始将目光转向丝 状真菌分泌机制的研究。目前对丝状真菌的分泌机制了解很少，丝状真菌仍是“高分泌能力的 黑盒子( p e b e r d y ，1 9 9 4 ) ”。初步研究结果显示，丝状真菌分泌机制与酵母甚至哺乳动物非常相 似因而现时的研究均主要参照真核生物特别是酵母中已有的知识进行。在基础研究的同时人 们尝试对丝状真菌分泌途径进行改造以提高外源蛋白生产。 3 1 蛋白分泌途径及其在丝状真菌中的研究 3 1 1 靶向内质网 蛋白质靶向内质网( e r ) 有两种途径，一种为信号识别颗粒蛋白s r p 依赖途径，即蛋白质翻 译与进入内质网同时进行的途径，通过转位，进入膜结合的囊泡，再由囊泡运输或在胞内定位 或与脂膜融合。在此过程中，发生信号肽切除，蛋自折叠，二硫键形成，糖基化以及前导肽切 除。另一种为非s r p 依赖途径，翻译后蛋白靶向内质网，此过程涉及到分子伴侣b i p 。有报道 信号肽的疏水性决定了每种蛋白的靶向路线0 q g e l a t , 1 9 9 6 ) ，即信号肽序列疏水性弱的蛋白通过 非s r p 依赖途径，而信号肽疏水性强时，两条路线都可行。尽管靶向路线也许具有普遍性，但 是否这两种e r 靶向机制在丝状真菌中也存在尚待证明，然而已知黑曲霉中存在s c e r e v i s i a e 信 号识别颗粒蛋白s r p 5 4 的一个类似蛋白( t h o m p s o ne t a l ，1 9 9 5 ) ，并且许多丝状真菌都含有与 s c e r e v i s i a e 相类似的k a r 2 b i p ( h i j a r r u b i ae ta t , 1 9 9 7 ；k a s u y ae la l , 1 9 9 9 ；t e c h e le la t , 1 9 9 8 ；v a i l g e m e r e ne la t , 1 9 9 7 ) ，提示两种路线可能也存在于丝状真菌中。 中国农业大学硕士学位论文第一章引言 3 , 1 。2 内质网中蛋白的成熟 分泌蛋白以一种延伸的构象进入e r 后，必需经正确折叠才能成熟为有功能的蛋白，这一 过程需要体内分子伴侣和折叠酶的协助。其中折叠酶催化缓慢的，经常作为限速的共价变化， 例如二硫键形成和脯氨酸异构化这种变化对获得有功能的构象是重要的，分子伴侣则不作为 催化剂，而是作为辅助蛋白暂时地与未成熟蛋白非共价结合以防止错误的蛋白问的相互作用， 促进正确折叠。伴侣蛋白和折叠酶包括：b i p 、蛋白质二硫键异构酶p d i 、肽酰脯氨基异构酶 p p l a s e 、钙联蛋白c a l n e x i n 和钙网蛋白( 可溶的c a l n e x i n 的类似物) 等。 b i p 是位于内质网腔内的分子伴侣，参与蛋白质生成的若干个过程( h a a s ，1 9 9 4 ) ，包括参与 新生肽链的e r 转位，蛋白折叠，蛋白在e r 中的装配以及非成熟构象蚩白的降解。酵母中此 蛋白由k a r 2 编码( n i e h o l s o ne l a , 1 9 9 0 ；n o r m i n g t o ne 1 日1 9 8 9 ；r o s ee t a l , 1 9 8 9 ) 。在若干丝状真 菌中也已经克隆到类似k a r 2 的基冈o i j a r r u b i ae t a t , 1 9 9 7 ；k a s u y ae t 口 1 9 9 9 ；t e c h e le t a l ，1 9 9 8 ； v a n g e m e r e ne l a t , 1 9 9 7 ) 。根据泡盛曲霉的b p 基因显示了与一个酵母t s k a r 2 突变的互3 i b ( s a g t ， 2 0 0 0 ) ，表明其与酵母k a r 2 有类似功能。丝状真菌在正常生长条件下，如其它有机体一样，6 咖 基因有一个基础的表达水平，而表达重组胞外蛋白的曲霉中可观察到蛐，m r n a 水平的增加 ( p u n te t a t , 1 9 9 8 ；s a g te t a t , 1 9 9 8 ) 。如在表达鸡蛋清溶菌酶的黑曲霉中，6 毋m r n a 水平增加了2 倍0 、g i a me ta t , 2 0 0 0 ) ，然而在表达人白细胞介素6 时，b i p 水平却并未改变( p u n te la t , 1 9 9 8 ) 。 尽管b i p 诱导与过量表达蚩自的特性问尚没有找到明确的关系，b i p 诱导与分泌效率的相关性 也还不清楚，但从现有的资料可以推测蛋白质的过量产生可能引起非折叠蛋白量的增加，从而 导致b i p 的过量表达。 蛋白质二硫键异构酶p d i 在蛋白质成熟过程中催化二硫键形成和异构化( f e r r a r ia n ds o l i n g ， 1 9 9 9 ；g i l b e r t , 1 9 9 7 ；w a n g , 1 9 9 8 ) 。p d i 也具有辅助蛋白折叠的分子伴侣功能( k l a p p ae ta t , 1 9 9 8 ； w a n g ，1 9 9 8 ) 。p d i 编码基因在黑曲霉( n g i a me t a l , 1 9 9 7 ；m a l p r i c h te t a l , 1 9 9 6 ) 和米曲霉( h j o f t ， 1 9 9 5 ；l e ee ta t , 1 9 9 6 ) 己克隆到。黑曲霉中p d i 的两种相关基因t g a 和p r p a 也已克隆并阐明 了特一 生( l a b o i s s i e r ee t a l , 1 9 9 5 ) ，外源蛋白超表达时，r i g a 和p r p a 基因表达会有所提高( j e e n e se l a t , 1 9 9 7 ；n g i a me ta l , 2 0 0 0 ) 。 肽酰脯氨基异构酶p p l a s e 催化脯氨酸残基n 一端c 缸和t r a n s 肽键的异构化( g o t h e la n d m a r a h i e l ，1 9 9 9 ) ，具有与免疫抑制药物结合的特性，并且依照这种特性可分为两个家族：一个是 c y c l o p h i l i n 家族，结合环孢菌素a ；另一个是f k 结合蛋白家族。p p l a s e 是遍在的蛋白，已知能 加速体外蛋白的折叠( k o p se t a t , 1 9 9 8 ) ，并且可同其它折叠酶和分子伴侣相互作用( s c h o o b r u n n e r a n ds c h m i d 。1 9 9 2 ) 。然而，它们在体内蛋白折叠中的作用尚未阐明。在丝状真菌中亦发现两种 p p l a s e ，如粗糙脉孢菌( n e u r o s p o r ac r a s s c t ) e r 中的f k b p ( s o l s c h e i da n dt r o p s c h u g ，2 0 0 0 ) ，而 c y c l o p h i l i n 基冈c y p b 的类似基因已从构巢曲霉o o s e p he t a t , 1 9 9 9 ) h 黑曲霉( d e r k x ，2 0 0 0 ) 中克隆 到。 钙联蛋白和钙网蛋白是类似凝集素的分子伴侣，它们特异地与部分剪切的单糖基化的n 连接寡糖结合，通过自身的循环过程，促进糖蛋白的正确折叠，是糖蛋白成熟和质的控制系统 的必需组成部分( j a k o ba n d b u r d a ，1 9 9 9 ；p a r o d i ，1 9 9 9 ) 。丝状真菌中，c a l n e x i n 类似物已从黑曲霉 中克隆，在粗糙脉孢菌( n e l s o ne l a h1 9 9 7 ) ，构巢曲霉( r o ee t a l ，1 9 9 9 ) 中也鉴定了c a l n e x i n 类似 物。 4 中国农业人学硕上学位论文笫一章引言 3 1 3 内质网后路线一高尔基体及后高尔基体 在寅核生物的分泌途径中，正确折叠的蛋白质从e r 苹巴向高尔基体，尽管丝状真菌中用电 子显微镜未观察到典型的高尔基体复合物( m e l l m a na n ds i m o n s ，1 9 9 2 ) ，但在丝状真菌中却存 在与高尔基体相似的功能作用，并且在某些丝状真菌中观察到类似高尔基体的结构。在丝状真 菌中也发现了位于真核细胞高尔基体的肽酶k e x 2 p 活性，且在黑曲霉中克隆到了类似k e x 2 p 的k e x l 3 的基因( j a l v i n g e t a l , 2 0 0 0 ) 。此外在高尔基体中发生的n - ，o - 糖基化，几乎普遍存 在于丝状真菌的胞外蛋白中。蛋白通过高尔基体后，或靶向质膜亦或到液泡。在酵母中有两种 不同的液泡运行路线：羧肽酶y ( c p y ) 路线，这种路线通过中问细胞器，即前液泡装置；另 一种是直接路线，分拣信号在两种路线的确定中起决定作用( p i p e re ta l ，1 9 9 7 ) 。在构巢曲霉 和e s p o r o t r i e h i o i d e s 的序列库中已检索到液泡分拣蛋白的类似蛋白。此外，在黑曲霉中，当糖 化酶信号肽被液泡蛋白酶p e p e 前原肽替代后可观察到糖化酶的胞内滞留( p u n t “a u n p u b l i s h e d ) 。蛋白到达质膜后还需通过最后一道屏障细胞壁最终分泌到胞外。 3 2 丝状真菌分泌途径改造尝试 外源蛋白翻译厉如不能进行正确折叠和组装，将在内质网中积累最终导向内质网相关降 解通路而被降解( a r c h e re t d 1 9 9 2 ；g o u k a e t a f ，1 9 9 6 ) 。蛋白的止确折叠和组装需要分子伴侣蛋 白和折叠酶的参与。人们尝试通过过表达单个折叠酶和分子伴侣来提高宿主细胞折叠和组装能 力以改善丝状真菌外源蛋白生产，获得了一些成功的例子。c o n e s a 等( 2 0 0 2 ) 在黑曲霉中，过 表达内质网分子伴侣蛋白钙联蛋白c a l n e x i n ，使p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 锰过氧化物酶的产 量提高5 倍。m o r a l e j o 等( 2 0 0 1 ) 报道，二硫键异构酶p d i a 的过表达使泡盛曲霉生产奇异果 甜蛋白的能力提高5 倍，且相对于脚明基因单拷贝的菌株p d i a 活性在2 - 4 倍时，奇异果甜蛋 白产量最高。 当未折叠蛋白在内质网过载时，一个称为未折叠蛋白反应( u p r ) 的信号转导通路被激活。 未折叠蛋白反应诱导定位于内质网内的分子伴侣和折叠酶基因( k a u f m a r t , 1 9 9 9 ；p a t i la n d w a l t e r ，2 0 0 0 和许多参与分泌功能的基因( t r a v e r se ta ，2 0 0 0 ) 的表达。v a l k o n e n 等( 2 0 0 3 ) 通过过表达转录因子h a c a 使黑曲霉中u p r 通路被组成性诱导，这种诱导使t r a m e t e sv e r s i c o l o r 漆酶表达分泌提高7 倍，牛凝乳酶提高2 8 倍。 随着对丝状真菌分泌途径研究的不断深入，“黑盒子”的秘密将不断被揭示，分泌途径障碍 的最终突破将使丝状真菌外源蛋白表达水平获得突破性提高。 4 丝状真菌外源蛋白表达系统蛋白糖基化 丝状真菌分泌的许多蛋白都是糖基化的，既包括酶也包括常见于菌丝表面可能起黏附作用 的以及参与细胞问相互作用的其它蛋白。目前，关于丝状真菌糖蛋白糖链的结构和组分以及糖 基化的生化信息、遗传控制等都了解很少，只能简单概括为包括n 和o 连接形式，糖链不均 一且一般情况下以甘露糖较为丰富。丝状真菌在n 连接结构中以高甘露糖型( m a n ，g l c n a e 2 ) 为主( a r c h e r “日，1 9 9 7 ) ，并且不倾向于如同某些酵母菌株那样被过度甘露糖基化( m a n 最高 可达2 0 0 ) ( o r l e a n ，1 9 9 7 ) 。u p s h a l l 等( 1 9 8 7 ) 报道构巢曲霉表达的血纤维蛋自溶解酶原似乎 与哺乳类蛋白同等程度糖基化。在个别情况下，在丝状真菌中同样产生过度糖基化，如重组的 毛霉天冬氨酸蛋白酶在构巢曲霉和黑曲霉中表达时被过度糖基化。异常的过糖基化使药用蛋白 具有免疫原性或使用时在血液中很快被清除。n 一连接甘露聚糖在丝状真菌中居优势，也有在聚 糖分子上连接有半乳糖残基、磷酸基、磺酸基和简单的n 乙酰葡糖胺基的报道( m a r a se ta l ， 1 9 9 9 b ) ，另一些更复杂的典型哺乳动物糖蛋白的糖链结构( 复杂型和杂合型) 在丝状真菌中却 没发现，可能因为丝状真菌中缺少高等真核生物含有的某些糖基转移酶，当正确糖基化对某些 哺乳动物蚩白活性有重要影响时，丝状真菌系统的应用就受到了限制。为此，已有报道将丝状 真菌所不具备的糖基化转移酶基因引入丝状真菌，例如哺乳动物的n 乙酰葡糖胺转移酶l 已在 构巢曲霉中成功表达( k a