棉蚜化学感受蛋白AgosCSP2的基因克隆、时空表达动态及气味结合特征分析.pdf

棉蚜化学感受蛋白 agoscsp2 的基因克隆尧时空表达动态及 气味结合特征分析 李娜 1 2袁张帅2袁雒珺瑜2袁吕丽敏2袁崔金杰2 袁李国清1 1 南京农业大学植物保护学院 农作物生物灾害综合治理教育部重点实验室袁江苏 南京 210095曰2 中国农业科学院棉 花研究所 棉花生物学国家重点实验室袁河南 安阳 455000 摘要院化学感受蛋白是一类存在于昆虫化学感受器中的可溶性蛋白袁可能与昆虫识别外界化学信息有关遥 本研 究从棉蚜 转录组数据中克隆得到 1 条编码化学感受蛋白的 cdna 序列袁 命名为2 genbank 登录号 kc017751 遥使用 qrt pcr 技术对此化学感受蛋白 mrna 在棉蚜中的时空表达谱进行了分 析袁结果表明2 在多数类型棉蚜若虫中的表达量明显高于成虫中的表达量曰在寄主为棉花时的表达 量高于寄主为木槿时曰在无翅成蚜中足的表达量相对其他组织较高遥 荧光竞争性结合试验表明 agoscsp2 与 气味化合物的结合能力较弱遥推测该基因主要参与棉蚜若虫对寄主的适应过程袁具有嗅觉以外的生理功能遥试 验结果为进一步研究2 的功能奠定了基础遥 关键词院棉蚜曰化学感受蛋白曰表达谱曰原核表达曰纯化曰荧光竞争结合试验 中图分类号院s435 622文献标志码院a 文章编号院1002 7807渊2014冤03 0228 09 li na1 2 zhang shuai1 luo junyu2 lyu limin2 cui jinjie2 li guoqing1 1 210095 2 455000 chemosensory proteins csps which belongs to a class of small soluble polypeptides in insect chemical receptors may be related with the process of storing and releasing the chemical odors for insects in this study one full length cdna of chemosensory protein gene was cloned from named2 genbank accession no kc017751 the tem poral expression pattern of the gene was studied by qrt pcr analysis the results indicated that the expression levels in nymph were significantly higher than those in adult the2 was higher expressed in the host of cotton than that in the overwin tering host hibiscus and it was higher expressed in leg than that in other organizations the binding characteristics showed that agoscsp2 had low binding abilities with odorant ligands the result suggested that the2 gene most likely functioned in the process of cotton aphid nymph adaptation to host but not functioned as the chemosensory of the insect this experiment may be valuable for studying the role of2 inchemical sensors chemosensory protein expression profiles prokaryotic expression purification competitive binding experiment 收稿日期院2013 11 15作者简介院李娜渊1987 冤袁女袁硕士研究生袁lina19870604 曰 第一通讯作者袁男袁博士袁教 授袁liguoqing001234 曰 第二通讯作者袁男袁博士袁研究员袁cunjinjie 基金项目院野十二五冶国家科技支撑计划项目院棉花病虫害生态控制技术研究与集成示范渊2012bad19b05冤 棉蚜 属同翅目 homoptera 尧 蚜科 aphididae 尧蚜属 袁在世界各地均有分 布遥 棉蚜是我国棉花尧瓜类等作物的重要害虫袁并 能传播瓜类尧 番茄等多种蔬菜作物的病毒病害袁 特别在华北及西北半干旱地区已成为农业上的 主要害虫遥 由于其生殖周期短尧繁殖量大袁一旦条 棉 花 学 报cotton science2014袁26渊3冤院228 236 3 期 件适宜袁在短期内便能暴发危害袁因此如何持续 有效控制棉蚜已成为一个非常重要的问题遥 昆虫化学感受蛋白 chemosensory proteins csps 又称感受器官蛋白 sensory appendage pro tein sap 或 os d 蛋白 olfactory specific d 袁广 泛分布于昆虫各种化学感受器袁能够结合运输脂 溶性信息化合物袁推测其在感受化学刺激中起着 重要的作用 1 遥 最早发现的昆虫 csps 是 os d 和 a l0袁 均 是 1994 年 从 黑 腹 果 蝇 触角中发现遥 随后袁在鳞翅目 2 3 尧直 翅目 4 5 尧膜翅目 6 7 等 6 目 14 科 20 多种昆虫中发 现 csps 的存在遥 csps 分子量较小袁 一般只有 10 15 kda袁多肽链全长 100 115 个氨基酸袁等 电点在 5 6遥 从目前的研究结果看袁 昆虫 csps 均为单体袁都没有翻译后修饰遥 它们的二级结构 主要由 琢 螺旋组成 8 袁4 个保守的半胱氨酸残基 cys29 cys36 和 cys55 cys58 两两相连形成 二硫键环 9 袁研究表明该环对蛋白结构的稳定性 并无作用袁但这是 csps 典型的结构特性遥 其 3d 结构可以分为 3 个家族袁都是由 琢 螺旋折叠成疏 水残基结合口袋组成遥 csp 在化学感受器官中广泛存在袁 例如触 角 10 尧下颚须 11 尧下唇须 12 尧喙 13 袁说明 csp 在昆虫 感受化学刺激过程中起重要的作用袁然而尚没有 直接证明 csp 执行化学感受刺激功能的证据遥相 对于气味结合蛋白袁化学感受蛋白可能在昆虫其 他生命活动中起着更加复杂的功能遥 因其不仅在 化学感受器官中发现袁 在非气味感受器官例如 足尧翅和雌虫性信息素腺 14 中也有发现袁说明化学 感受蛋白可能参与调节昆虫的生长发育尧繁殖等 诸多生命活动遥 例如5 在蜜蜂 卵中表达袁 研究表明其参与受精卵的发 育和幼虫表皮的形成 15 曰在美洲大蠊 中发现基因10 在新生足 中的表达量是正常足中的 30 倍袁 说明10 参与美洲大蠊足的再生 16 曰对刺舌蝇 取食血液的研究袁 表明 基因参与雌性个体寻找寄主进行取食过程 17 遥 本试验通过 rt pcr 渊real time polymerase chain reaction冤 技术袁 克隆得到 1 个棉蚜基 因袁命名为2遥 为了了解2 在棉 蚜不同形态 有翅或无翅 尧不同发育阶段 成虫或 若虫 以及不同时期 苗蚜尧伏蚜尧秋蚜及冬寄主木 槿上的蚜虫 的功能袁 采用 rt qpcr 技术对 2 在不同形态尧 不同时期的棉蚜中 mr na 的表达量进行了分析袁 同时对2 在 棉蚜不同组织中的表达量进行了分析遥 为了研究 agoscsp2 与气味物质的结合特征袁 在体外表达 和纯化得到大量重组 agoscsp2 蛋白的基础上袁 采用荧光竞争结合的方法测定了该蛋白与不同 结构气味物质的结合能力袁以期为探讨棉蚜化学 感受蛋白的生理功能提供依据遥 材料和方法 样品 棉蚜在中国农业科学院棉花研究所植物保 护研究室试验田采集袁在解剖镜下对棉蚜按照不 同形态院无翅若虫尧无翅成虫尧有翅若虫尧有翅成 虫袁不同时期院苗蚜尧伏蚜尧秋蚜以及冬寄主木槿 上 4 月份 的蚜虫进行分类遥 在此基础上将秋蚜 无翅成虫进行组织分离袁分为头 含触角 尧胸尧腹尧 足 4 部分遥 液氮速冻后置 80 备用遥 rna 的分离及 cdna 的合成 棉蚜整虫的总 rna 使用 invitrogen 公司的 trizol reagent 试剂盒提取袁棉蚜各组织的总 rna 使用 sv total rna isolation system promega us a 试剂盒提取遥通过 nanodrop2000c 紫外分光光 度计 thermo usa 和 1 琼脂糖电泳对提取的 rna 浓度和质量进行检测遥 按照 primescript rt reagent kit渊takara袁japan冤反转录试剂盒说明进 行 cdna 合成袁 80 保存备用袁 以此为 pcr 和 qrt pcr 模板遥 pcr 产物克隆尧鉴定及进化分析 已有的2 的基因序列与桃蚜化学感 受蛋白基因 1袁登录号 cai34909 1 序列相 似度高达 89 袁 因此参考桃蚜化学感受蛋白 cd na 序列设计引物遥 pcr 产物中与目标条带大小 一致的片段经电泳回收纯化后袁连接到 t easy 载 体上 按 kit 说明进行 袁 然后转化到大肠杆菌 dh5琢 中袁 挑取白色菌落袁 培养后提取质粒袁用 ri 酶切鉴定重组阳性克隆遥 挑选含有目的片 段的阳性克隆袁 进行测序遥 测序结果在 ncbi 李娜等院棉蚜化学感受蛋白2 的基因克隆尧时空表达动态及气味结合特征分析229 棉花学报26 卷 national center for biotechnology information 网 站 http www ncbi nlm nih gov 进行比对分析遥 使用软件 clustlx2 0 对 agoscsp2 氨基酸序列进 行同源性比对袁 比对结果使用软件 jalview2 4 0 进行编辑遥 利用 clustlx2 0 及 mega4 0 等软件采 用 neighbor joining method 法对包括 agoscsp2 在内的 41 种化学感受蛋白运算 1000 次袁构建系 统进化树遥 real time qpcr 测定和数据分析 利用探针法进行荧光定量试验袁taqman 探 针引物在生工生物技术有限公司 上海 设计并合 成 遥 内 参基 因 使用 本 实 验 室 筛 选 的 dimt dimethyladenosine transferase袁登录号 kf018923 和ppi peptidylprolylisomerase袁登录号kf018924 遥 设计的探针及引物序列如下院2 forward primer 5 cgttctactgactttgatcgtctga 3 曰2 reverse primer 5 ctgaagccct ttctttttcgaa 3 曰2 probe 5 fam tgccaaatacgacccaaccggaga bhq1 3 遥 内参基因院dimt forward primer 5 ttggtatg gcgtattcat 3 曰dimt reverse primer 5 cgt gttaagacagtggta 3 曰dimt probe 5 fam caactcagccactaacctaacatca bhq1 3 曰ppi forward primer 5 atcacatgggaca ttctat 3 曰ppi reverse primer 5 ttcactca tcaatttagcaata 3 曰ppi probe 5 fam cg tgaccatctaatcagtgaagttc bhq1 3 遥 采用三步法标准程序扩增院95 预变性 2 min曰95 30 s袁55 30 s袁72 30 s袁40 个循环遥 20 滋l 的反应体系院10伊buffer 含 mg2 缓冲液 2 滋l袁dntp 10 mmol 窑 l 1 2 滋l袁正向和反向引物各 1 滋l袁探针引物 0 5 滋l袁rtaq 5 u 窑 滋l 1 0 2 滋l袁最 后补水至 20 滋l袁 混匀尧 离心后用荧光定量 pcr 仪 mastercyclerep realplex袁eppendorf 进行扩增遥 每个样品 3 个生物学重复袁每个模板设 3 个技术 性重复遥 并设置阴性和空白对照袁分别以提取棉 蚜的 rna 和水为模板遥 数据结果采用相对定量 法 2 ct进行处理遥 蛋白的表达及纯化 使用表达引物进行克隆后 pcr 产物袁对表达 载体 pgex 4t 1 使用hi 进行单酶切袁 酶切 产物和克隆后 pcr 产物进行胶回收袁用 5伊in fu sion enzyme 连接酶 购自 clontech 公司 将 pcr 回收产物和原核表达载体 pgex 4t 1 连接遥构建 的重组质粒在 bl21渊de3冤大肠杆菌中诱导表达遥 挑取经鉴定的阳性克隆单菌落于 800 ml 的 lb 培养基袁 振荡培养至 od600达 0 5 0 8袁 加 iptg isopropyl 茁 d 1 thiogalactopyranoside袁异丙基 茁 d 硫代吡喃半乳糖苷 至终浓度为 1 mmol 窑 l 1袁 28 200 r 窑 min 1继续诱导 8 h遥 诱导后的菌体经 超声波破碎袁1 2伊104r 窑 min 1离心 10 min 后袁取上 清液用 gstrap ff 预装柱进行纯化袁用凝血酶切 除 gst glutathione s transferase袁谷胱甘肽 s 转 移酶 标签袁获得纯化后的重组蛋白 agoscsp2遥 荧光竞争结合试验 试验在日立 f 4500 荧光分光光度计 日本 上进行袁比色杯用 1 cm 宽的四通石英杯袁发射波 长为 337 nm袁狭缝宽度为 10 nm袁灵敏度设为 3遥 所选择的 85 种高纯度挥发性气味化合物购置于 sigma aldrich 公司渊表 1冤袁纯度在 90 以上袁其 中包括绿叶气味尧酮类尧酯类尧萜类尧烃类尧杂环 类尧 芳香族类尧 烯类和醚类 表 1 遥 荧光探针 1 npn n 苯基 1 萘胺 袁n phenyl 1 naphthy lamine 和气味物质溶于甲醇中袁使其终浓度为 1 mmol 窑 l 1袁作为工作液遥 以 1 npn 为探针袁 首先测定 agoscsp2 与 1 npn 的结合曲线遥 方法为将蛋白溶液加入 50 滋mol 窑 l 1的 tris hcl 缓冲液中袁 使其终浓度为 2 滋mol窑 l 1袁 按 2袁4袁6袁8袁10袁12袁16 和 20 滋mol窑 l 1 的浓度梯度加入 1 npn袁每次加入后反应 2 min袁 记录荧光发射情况遥 用 1 npn 的非线性回归曲 线袁使用 prism4 0 graphpad software inc 软件计 算值遥 利用竞争结合试验测定气味物质和 agosc sp2 的结合能力遥在竞争结合试验中袁重组蛋白和 1 npn 的终浓度均为 2 滋mol 窑 l 1袁 反应时间为 2 min袁记录荧光值 初始荧光值 遥 然后将被测气味 化合物按终浓度为 2袁4袁8袁12袁20袁28袁44 和 60 滋mol 窑 l 1的浓度梯度加入到 1 npn 和蛋白的混 合液中袁每次加入后反应 2 min袁记录荧光值遥 对 于相对荧光值降到 70 以下的气味物质袁再进行 2 次重复试验袁以 3 次重复计算有关参数遥计算荧 230 3 期 光值降低到初始荧光值一半时气味物质的浓度袁 即 50值袁利用公式 50 1 咱1 npn暂 1 npn 袁 其中 1 npn 为该气味浓度时未结合 1 npn 的浓 度袁 1 npn为 agoscsp2 与 1 npn 的结合常数遥 结果与分析 2 基因的全长序列以及进化分析 利用与桃蚜化学感受蛋白同源性高的特点袁 设计引物得到2 基因的全长序列遥 该序 列全长 405 bp袁编码 134 个氨基酸 aa 袁命名为 2 genbank 登录号为 kc017751 袁该基 因编码的氨基酸序列前端包含长 20 个氨基酸的 疏水性信号肽 http www cbs dtu dk services sig nalp 袁 而且具有保守的 4 个半胱氨酸位点 渊图 1冤袁 在蛋白属性预测网站 http www expasy org tools pitool html 预测蛋白分子量为 15 44 kda遥 以上特征均符合昆虫 csp 氨基酸序列的一 般特征遥 从与其他昆虫的 csp 氨基酸比对结果 渊图 1冤可以看出袁 agoscsp2 与 mperos d1 的氨基酸 序列一致性最高袁为 89 遥 系统进化树上这 2 种 蛋白也聚为一类渊图 2冤袁揭示了这 2 种昆虫在进 化上的关系较近遥 进化树分析结果表明 2 与蚜科昆虫同源性较高袁 而与属于其他科化 学感受蛋白的基因的距离相对较远渊图 2冤袁这与 昆虫的形态学分类相一致遥 2 表达谱分析 利用 rt qpcr 检测了 agoscsp2 在不同类 型尧不同发育阶段棉蚜中的转录水平 图 3 袁可以 看出袁2 在不同类型棉蚜中都表达袁但相 对表达量有差异遥2 在越冬寄主木槿树 上的棉蚜相对表达量较其他寄主上低遥 在多数类 型棉蚜中袁2 在成虫和若虫中的 mrna 表达水平具有明显的规律袁即在若虫中表达量高 于成虫袁这在伏蚜和秋蚜中表现较突出袁仅在无 翅苗蚜中成虫表达量高于若虫遥 在伏蚜和秋蚜的 无翅成虫中袁2 在不同组织均有表达袁在 足的表达量高于其他组织袁其次为头 含触角 尧胸 部尧腹部 图 4 遥 蛋白表达与纯化 含有 pgex agoscsp2 的 bl21 de3 菌经 iptg 诱导后袁 可产生 40 kda 左右的特异蛋白质 条带袁 而诱导含有表达载体 pgex 4t 1 的 bl21 de3 菌液袁 在相应位置没有产生特异的条带遥 sds page 电泳检测表明 agoscsp2 在上清液和 包涵体中均有表达袁上清液中表达量可以满足纯 化需要 图 5 遥 为了避免 gst 标签对 agoscsp2 结合特性产生影响袁 该标签用凝血酶进行切除遥 对纯化后切除标签的重组蛋白进行 sds page 电泳检测后发现袁 约在 13 kda 处出现预期的单 一蛋白条带 图 5 袁能够满足下一步试验需要遥 荧光竞争结合试验 使用 graphpad prism 软件绘制出荧光配基 1 npn 与重组蛋白 agoscsp2 的结合特性图袁可 以看出随着 1 npn 浓度的增加荧光强度逐渐趋 于平稳袁说明 1 npn 与 agoscsp2 是单结合位点 黑色方框表示预测的信号肽袁黑色五角星标记表示 4 个保守的半胱氨酸遥 the predicted signal peptide are boxed and the four conserved cysteins are marked by five pointed star 图 12 1 134 cdna 与其他 csp 序列同源性对比 fig 1alignment of amino acid sequences of the two2 1 134 with other csp 李娜等院棉蚜化学感受蛋白2 的基因克隆尧时空表达动态及气味结合特征分析231 棉花学报26 卷 图 2agoscsp2 与其他昆虫化学感受蛋白系统发育分析 fig 2phylogenetic tree of amino acid sequences of csp2 fromand other insects ncbi blastx using the neighbor joining method m院苗蚜曰f院伏蚜曰q院秋蚜曰j院冬寄主木槿上的蚜虫曰柱 上不同字母表示2 表达量的差异显著 检验袁 0 05 遥 m theat seeding stage f the at summer stage q theat autumn stage j thein the overwintering host hibis cus different letters above bars indicate significant differ ence in expression level of2 test 0 05 图 32 在棉蚜不同发育阶段尧不同形态以及不 同时期的表达水平 fig 3relative mrna expression levels of the 2 at different developmental stages different forms and in various times 内参选用 dimt 和 ppi曰h院头 含触角 袁t院胸部袁ab院 腹部袁l院足曰柱上不同字母表示2 表达量的差异 显著 检验袁 0 05 遥 the relative expression levels were normalized by dimt and ppi h head t thorax ab abdomen l leg different letters above bars indicate significant difference in expression level of2 test 0 05 图 42 在秋蚜无翅成虫不同组织的表达量 fig 4relative mrna expression levels of the 2 in different tissues of the apterous adult aphid at autumn 无翅成虫 有翅成虫 无翅若虫 有翅若虫 不同时期 different times 10 8 6 4 2 0 mfqj 5 4 3 2 1 0 htabl 不同组织 different tissues 232 3 期李娜等院棉蚜化学感受蛋白2 的基因克隆尧时空表达动态及气味结合特征分析 图 6 遥 通过计算得出 1 npn 与 agoscsp2 的结 合常数为 20 84 滋mol 窑 l 1遥 荧光竞争结合试验结 果表明 agoscsp2 与丁酸反 2 己烯酯尧 甲酸丁 酯尧乙酸丁酯尧3 己烯醛尧琢 紫罗兰醇及吲哚有一 定的结合能力袁 但在配基浓度为 60 滋mol 窑 l 1时 还不能有效竞争 50 的荧光量袁 经计算 agosc sp2 与它们之间的结合常数分别为 58 4 滋mol窑 l 1袁61 1 滋mol窑 l 1袁79 3 滋mol窑 l 1袁86 5 滋mol窑 l 1袁 100 2 滋mol 窑 l 1袁126 8 滋mol 窑 l 1 表 2袁图 7 遥 讨论 昆虫化学感受蛋白执行不同的生理功能 18 袁 已有的研究结果表明化学感受蛋白主要涉及 3 种功能院 1 化学刺激感受袁 2 传导环境化学因子 刺激信息袁 3 参与调节生长发育 19 遥 不同的化学 感受蛋白结构也存在差异袁并且结构与功能密切 相关遥 蚂蚁类的化学感受蛋白 3d 结构分为 3 个 家族院典型的由 6 个 琢 螺旋构成袁具有结合气味 的功能曰第二类由 5 个 琢 螺旋构成袁在种间是高 度保守的袁可能涉及结合气味以外的一些生理功 能曰第三类为膜翅目特有袁相较于典型的 csp袁其 疏水腔较小袁只能结合小分子的配体 20 遥 鉴于昆虫化学感受蛋白在昆虫嗅觉中的作 用为此类蛋白的主要功能袁本研究测定了 agosc sp2与气味化合物的结合能力遥 化学感受蛋白结 合气味结合能力的测定有多种方法袁包括同位素 标记尧荧光结合试验 fluorescent binding assays 尧 冷结合方法 cold binding assays 和挥发气味结合 法 volatile odorant binding assay 遥 昆虫中首个气 味结合蛋白的发现是利用同位素标记气味化合 物筛选可结合蛋白的方法获得的 21 遥随后袁发展出 利用同位素标记气味分子测定气味结合蛋白与 图 6荧光配基 1 npn 与重组蛋白 agoscsp2 的结合 特性 fig 6binding of fluorescent ligand 1 npn with recombinant agoscsp2 protien 图 7agoscsp2 蛋白与配基的竞争性结合 fig 7competitive binding of 1 npn in agoscsp2 by ligands 方框代表目标条带曰m院蛋白质分子量标准曰 和 分 别代表含有 pgex 4t 1 agoscsp2 的 bl21 菌体经 iptg 诱导前和诱导后曰p院用凝血酶切除 gst 标签后的纯 蛋白曰g院gst 标签曰s院 诱导后的上清液曰b院 诱导后包涵 体遥 target bands were marked in the boxes m molecular marker and bacterial cells before and after induction by iptg respectively p purified protein after gst tag cleav age by thrombin g thrombin cleaved gst s supernatant b inclusion body 图 5agoscsp2 表达及纯化产物 sds page 电泳 fig 5sds page analyses showing the expression and purification of the recombinant agoscsp2 kdam p gsb 250 130 100 70 55 35 25 15 10 1 npn 浓度 1 npn concentration 滋mol 窑 l 1 051015 4000 3000 2000 1000 0 233 棉花学报26 卷 气味化合物结合能力的方法 22 遥 但是这种方法成 本较高袁且操作不安全袁测定的结合常数值误差 较大 23 遥目前袁荧光结合方法和冷结合方法被广泛 应用于研究化学感受蛋白与气味化合物的结合 能力遥 这 2 种方法具有操作方便尧成本比较低和 重复性好的优点遥 本试验采用的是荧光结合试验 表 185 种气味标样及其纯度 table 1purity of 85 standard chemical compounds 编号 number 标样 standard chemical compounds 1苯甲醛 benzaldehyde 2苯乙醛 phenylacetaldehyde 3苯乙醇 phenethyl alcohol 4苯甲醇 benzyl alcohol 5乙酸苄酯 benzyl acetate 6乙酸苯乙酯 phenethyl acetate 7邻胺基苯甲酸甲酯 methyl anthranilate 8乙苯 ethylbenzene 9己醛 hexanal 101 己醇 1 hexanol 113 己烯醛 cis 3 hexenal 122 己烯醛 trans 2 hexenal 133 己烯醇 cis 3 hexen 1 ol 143 己酮 3 hexanone 152 己酮 2 hexanone 163 己醇 3 hexanol 172 己烯醇 cis 2 hexen 1 ol 18香叶醇 geraniol 19氧化柠檬烯 limonene oxide 20茁 环柠檬醛 beta cyclocitra 21香芹酮 carvone 22大马烯酮 damascenone 23香叶基丙酮 geranylacetone 24里那醇 linalool 25茁 石竹烯 beta caryophyllene 26法呢烯 farnesene 27橙花叔醇 trans nerolidol 28琢 水芹烯 alpha phellandrene 29琢 蒎烯 alpha pinene 30莰烯 camphene 31茁 蒎烯 beta pinene 32柠檬烯 r limonene 33月桂烯 myrcene 34乙酸香叶酯 geranyl acetate 35桉树脑 eucalyptol 36吲哚 indole 37萘 naphthalene 386 甲基 5 庚烯 2 酮 6 methyl 5 hepten 2 one 39十三烷 tridecane 40十四烷 tetradecane 412 庚酮 2 heptanone 422 乙基 1 葵醇 2 hexyl 1 decanol 433 己烯基乙酸酯 cis 3 hexenyl acetate 纯度 purity 琢 紫罗兰醇 alpha ionol95 茁 紫罗兰酮 beta ionone97 丁酸乙酯 ethyl butyrate96 丁酸反 2 己烯酯 trans 2 hexenyl butyrate 逸98 丁酸己酯 hexyl butyrate98 乙酸庚酯 heptyl acetate96 甲酸丁酯 butyl formate逸90 乙酸己酯 caproyl acetate逸98 水杨酸甲酯 methyl salicylate逸99 乙酸丁酯 butyl acetate逸90 正辛醛 octyl aldehyde99 己酸叶醇酯 cis 3 hexenyl hexanoate98 十一 碳 烷 undecane96 十二烷 dodecane逸99 癸醛 decanal96 乙酸壬酯 nonyl acetate逸95 樟脑 camphor逸96 苯甲酸乙酯 ethyl benzoate99 反 2 己烯乙酯 e2 hexenyl acetate96 乙酸苄酯 acetate逸98 乙酸异戊酯 isoamyl acetate99 80 顺 3 丁酸己烯酯 z3 hexenyl butyrate逸90 乙酸戊酯 pentyl acetate99 丙酸乙酯 ethyl propionate99 80 2 十三烷酮 2 tridecanone98 1 氨基蒽 1 aminoanthracene96 法呢醇 farnesol逸95 罗勒烯 ocimene99 2 庚醇 2 heptanol96 月桂醛 十二醛 dodecyl aldehyde逸98 2 十五烷酮 2 pentadecanone逸95 正十四烷 tetradecane95 苯乙酮 acetophenone97 乙酸辛酯 ococtyl acetate逸98 乙酸叶醇酯 cis 3 hexenyl acetate逸95 雪松醇 cedrol96 正十八烷 octadecane98 正十七烷 heptadecane97 异丙基苯 cumene98 正十三烷 tridecane98 芳樟醇 linalool96 trans 石竹烯 trans caryophyllene逸95 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 编号 number 标样 standard chemical compounds 纯度 purity 逸95 95 97 97 97 99 逸99 99 80 98 99 97 逸95 98 97 97 97 95 逸97 97 逸90 97 98 96 逸90 逸80 97 逸95 99 80 98 95 97 5 97 99 99 99 99 85 98 97 98 逸95 逸98 逸98 234 3 期李娜等院棉蚜化学感受蛋白2 的基因克隆尧时空表达动态及气味结合特征分析 的方法遥 在荧光结合试验中袁可以使用蛋白内源 荧光与外源荧光作为报告因子遥 内源荧光要求肽 链中结合位点含色氨酸 trp 尧脯氨酸 pro 尧酪氨 酸 tyr 这些发射荧光的氨基酸曰外源荧光常用的 荧光配基有 1 ama 1 aminoanthracene 袁1 npn 和bis ans 1 anilinonaphthalene 8 sulphonic acid 遥 由于在 agoscsp2 肽链中未发现结合位点 含有內源荧光氨基酸位点袁因此本试验采用外源 荧光配基 1 npn 作为荧光探针遥 荧光竞争结合试验结果表明袁agoscsp2 能 与丁酸反 2 己烯酯尧琢 紫罗兰醇尧 乙酸丁酯尧甲 酸丁酯尧 吲哚尧3 己烯醛结合袁 但值均在 50 滋mol 窑 l 1以上遥 一般认为袁化学感受蛋白对配体 的结合力指标 值 在 20 滋mol 窑 l 1以上时袁结合 能力就比较弱遥 组织表达谱分析也表明袁该基因 在嗅觉器官触角中的表达量并不特异地高于其 他组织遥 推测2 参与棉蚜嗅觉识别的作 用有限袁很可能具有嗅觉识别以外的生理功能遥 棉蚜为转主为害昆虫袁 以受精卵在石榴尧花 椒尧木槿和鼠李属几种植物枝条上越冬遥 春季孵 化后袁全为孤雌蚜袁营孤雌卵胎生袁第 1 2 代无 翅遥 第 3 代出现有翅型袁迁往夏寄主棉花和瓜类 上袁而无翅型继续留在越冬植物上遥 迁往棉花和 瓜类上棉蚜孤雌卵胎生 20 多代袁大都为无翅型袁 每隔 1 月左右发生 1 次袁 有翅型在田间扩散为 害遥 本研究发现2 在越冬寄主木槿树上 的棉蚜中的表达量低于在棉花上棉蚜中的表达 量袁而且伏蚜和秋蚜中表达量较高袁推测该基因 与棉蚜的寄主适应性有关遥 而2 在多数 类型棉蚜若虫中相对表达量高于成虫袁又暗示该 基因可能主要参与棉蚜若虫对寄主的适应过程遥 在伏蚜和秋蚜无翅成虫中袁2 在足的表 达量高于其他组织袁 也说明2 可能具有 嗅觉以外的生理功能遥 参考文献院 1 jacquin joly e merlin c insect olfactory receptors contribu tions of molecular biology to chemical ecology j journal of chemical ecology 2004 30 12 2359 2397 2 picimbon j f dietrich k angeli s et al purification and molec ular cloning of chemosensory proteins from j archives of insect biochemistry and physiology 2000 44 3 120 129 3 robertson h m martos r sears c r et al diversity of odourant binding proteins revealed by an expressed sequence tag project on malemoth antennae j insect molecular biol ogy 1999 8 501 518 4 ban l scaloni a brandazza a et al chemosensory proteins of j insect molecular biology 2003 12 125 134 5 angeli s ceron f scaloni a et al purification structural char acterization cloning and immunocytochemical localization of chemoreception proteins from j euro pean journal of biochemistry 1999 262 745 754 6 briand l nespoulous c huet j c et al characterization of a chemosensoryprotein asp3c from honeybee l as a broodpheromone carrier j european journal of biochem istry 2002 269 4586 4596 7 ishida y chiang v leal w s protein that makes sense in the argentine ant j naturwissenschaften 2002 89 505 507 8 mosbah a campanacci v lartigur a et al solution structure of a chemosensory protein from the moth j biochemical journal 2003 369 39 44 9 刘金香 钟国华 谢建军 等 昆虫化学蛋白研究进展 j 昆虫 学报 2005 48 3 418 426 liu jinxiang zhong guohua xie jianjun et al recent advances in chemosensory proteins of insects j acta entomologica sini ca 2005 48 3 418 426 表 2气味标准化合物结合参数 table 2the binding parameters of odorant chemicals 编号 no 化合物 chemical抑制中浓度 50 滋mol 窑 l 1 结合常数 滋mol 窑 l 1 1丁酸反 2 己烯酯 trans 2 hexenylbutyrate61 3358 4 2琢 紫罗兰醇 alpha ionol105 55100 2 3乙酸丁酯 butyl acetate83 0779 3 4甲酸丁酯 butyl formate64 0061 1 5吲哚 nerolidol132 72126 8 63 己烯醛 cis 3 hexenal90 0686 5 235 棉花学报26 卷 10 gu shaohua wang songying zhang xueying et al functional characterizations of chemosensory proteins of the alfalfa plant bugindicate their involvement in host recognition j plos one 2013 7 8 e42871 11 maleszka r stange g molecular cloning by a novel approach of a cdna encoding a putative olfactory protein in the labial palps of the moth j gene 1997 202 39 43 12 jin x brandazza a navarrini a et al expression and im munolocalisation of odorant binding and chemosensory proteins in locusts j cellular and molecular life science 2005 62 1156 1166 13 meillour