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环介导等温扩增 LAMP 检测金黄色葡萄球菌 摘要 建立一种能够快速准确地检测金黄色葡萄球菌的LAMP方法 根据金黄色葡萄球菌的femA基因设计了引物 然后进行LAMP反应条件的优化 特异性和灵敏度的检测并与实际样品进行检出率的比较 LAMP方法特异性好 最佳反应温度为61 只对金黄色葡萄球菌进行扩增 灵敏度高 金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 9cfu mL时仍能检出 LAMP方法检测金黄色葡萄球菌特异性强 灵敏度高 时间短且操作简便 有望成为快速检测金黄色葡萄球菌的新方法 简介 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 是引起食物中毒的主要致病菌之一 也是引起奶牛患乳房炎的重要病原菌 在自然界中广泛存在 食品受污染的机会很多 近年来随着抗生素的大量使用 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 methicillin resistantStaphylococcusaureus MRSA 大量出现 金黄色葡萄球菌产生的肠毒素是引起食物中毒的主要原因 每年都有肠毒素中毒的报道 已经成为世界性的卫生问题 因此建立快速 简便地检测金黄色葡萄球菌的方法一直是研究的热点 目前 金黄色葡萄球菌的检测方法有很多 主要有分离培养法 琼脂扩散法 免疫学方法 基因芯片法 基因探针法 测试片法 PCR法等 环介导恒温扩增技术 loop mediatedisothermalamplification LAMP 是Notomi等2000年发明的一种新颖的扩增技术 其特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物 在DNA聚合酶 BstDNApolymerase 的作用下 恒温条件下进行核酸扩增 具有操作简单 特异性强特点 另外通过环引物的添加 大大加快了反应的速度 国外报道 LAMP被广泛食品等病原菌的检测中 如巴西芽生菌 锥虫病 沙门氏菌 虾中的白斑综合症病毒 志贺氏菌属和大肠杆菌 本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计一套LAMP引物 对金黄色葡萄球菌进行检测 优化反应条件 确定检测特异性 对lamp法与PCR法的灵敏度进行了对比 LAMP的技术原理 LAMP方法的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物 利用一种链置换DNA聚合酶 BstDNApolymerase 在恒温条件 60 65 保温几十分钟 即可完成核酸扩增反应 直接靠扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断是否发生反应 短时间扩增效率可达到10 9 10 10个拷贝 不需要模板的热变性 长时间温度循环 繁琐的电泳 紫外观察等过程 材料与方法 材料与仪器材料 金黄色葡萄球菌 Staphylococcusaureus 大肠杆菌 Escherichiacoli 铜绿假单胞菌 Pseudomonasaeruginosa 沙门氏菌 Salmonellaenterica 沙门氏菌 Salmonellasp 荧光假单胞菌 Pseudomonasfluorescence 恶臭假单胞菌 Pseudomonasputida 沙门氏菌 SalmonellaHJ 004 志贺菌 Shigellaspp 单增李斯特菌 Listeriammonocytogenes 大肠杆菌 Escherichiacoli ETEC 44247 6 15 16 EPEC 44706 111 58 单增李斯特菌 Listeriamonocytogenes 蜡状芽孢杆菌 Bacilluscereus 瑞士乳杆菌 Lactobacillushelveticus 乳酸乳球菌 Lactococcuslactis 嗜热链球菌 StreptococcusthermophilusKLDS 双歧杆菌 LactobacillusbifidusKLDS BstDNA聚合酶 NewEnglandBiolab DNAmarkerDL2000 仪器 DYY 10C型电泳仪UVP凝胶成像仪 2 实验方法 DNA模板的制备煮沸法将对数生长期的金黄色葡萄球菌等细菌培养物 取1mL于EP管中12000r min 离心5min收集菌体 加入TE Trinton200 L混匀后 于沸水中5min 后12000r min离心5min 取上面50 L作为LAMP扩增及PCR扩增反应的模板 另用试剂盒提取标准金黄色葡萄球菌DNA备用 引物的设计与合成根据金黄色葡萄球菌femA基因 应用PrimerExplorer3设计特异引物 包括两条外引物F3 B3 内引物FIP BIP LAMP反应及条件的优化 LAMP反应 配置反应体系为25 L 包括 018mmol LFIP 018mmol LBIP 012mmol LF3 012mmol LB3 116mmol LdNTPs 018mmol Lbetaine 4mmol LMgSO4 20mmol LTris HCl pH818 10mmol LKCl 10mmol L NH4 2SO4 2 LDNA模板 混匀 95 5min 然后冰浴5min 加入8UBstDNA聚合酶 于65 扩增1h 80 灭活10min 产物于210 琼脂糖凝胶电泳检测 反应条件的优化 分别改变反应温度 Mg2 浓度LAMP扩增 电泳观察扩增产物 确定最适的反应条件 特异性实验 用建立的LAMP方法扩增大肠杆菌 沙门氏菌等其他18株菌株 电泳观察扩增产物 验证方法的特异性 灵敏度实验 取过夜培养的金黄色葡萄球菌培养液 以10倍比进行稀释至10 1 10 9 取各稀释度菌液1mL进行平板计数 同时 取各稀释度菌液1mL 用煮沸法提取DNA 取2 L上清液作为模板进行LAMP扩增 原料乳样品的检测 采用建立的LAMP方法对从农场采的原料乳进行实际检测 同时采用金黄色葡萄球菌国标GB T4789110 2003对样品进行检测 两种方法进行对比 确定LAMP直接检测乳品中金黄色葡萄球菌的特异性 灵敏度 结果与分析1 LAMP方法反应条件的优化 反应温度BstDNA聚合酶的最适反映温度为65 选择57 59 61 63 65 五个不同的反应温度 结果如图1 在同样的反应体系条件下 61 时扩增的效果更好 因此最适LAMP反应温度为61 图1反应温度对LAMP反应的影响M DL2000DNAMarker 1 57 2 59 3 61 4 63 5 65 图2Mg2 浓度对LAMP反应的影响M DL2000DNAMarker 1 1mmol L 2 2mmol L 3 3mmol L 4 4mmol L 5 5mmol L Mg2 浓度的影响选择以不同浓度的Mg2 梯度来优化LAMP反应体系中的Mg2 浓度 结果如图2 同等条件下为6mmol L时 扩增最为明显 因此本实验LAMP反应体系的Mg2 浓度为6mmol L 图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果 2 特异性本研究建立的方法对金黄色葡萄球菌 大肠杆菌 沙门氏菌等其他菌株进行LAMP扩增反应 结果如图5所示 金黄色葡萄球菌有条带出现 其他菌株未出现条带 表明LAMP扩增反应特异性强 图3与图4金黄色葡萄球菌LAMP与PCR检测的灵敏性实验与PCR检测的灵敏性实验1 10 1 2 10 2 3 10 3 4 10 4 5 10 5 6 10 6 7 10 7 8 10 8 9 10 9 3 LAMP灵敏度实验及PCR检测当菌液稀释10 8时 LAMP扩增产物 而当稀释10 4到PCR已无扩增条带 说明LAMP扩增灵敏度高于PCR扩增 由平板计数计算表明 金黄色葡萄球菌的检测灵敏度为8 9cfu mL时仍能检出 4 对样品的检测结果采自奶场的125份样品进行了检测 结果表明 LAMP检测出阳性样品81份 GB T4789 10 2003检测出阳性样品84份 LAMP阳性检出率为96 43 图5金黄色葡萄球菌LAMP特异性的检测结果 M DL2000DNAMarker 1 金黄色葡萄球菌ATCC25923 2 沙门氏菌CGMCC111552 3 沙门氏菌ATCC13067 4 沙门氏菌HJ 004 5 ETEC 44247 6 15 16 6 EPEC 44706 111 58 7 荧光假单胞菌CGMCC111802 8 恶臭假单胞菌CGMCC111819 9 铜绿假单胞菌ATCC27853 10 志贺菌HJ 14 11 单增李斯特菌CMCC54002 12 单增李斯特菌HJ 35 13 大肠杆菌ATCC25922 14 大肠杆菌O157 H7 15 蜡样芽孢杆菌KLDS71 16 瑞士乳酸杆菌KLDS 8 17 乳酸乳球菌KLDS 36 18 嗜热链球菌KLDS 19 双岐乳杆菌KLDS N 阴性对照 结论 金黄色葡萄球菌是引起奶牛乳房炎的重要致病菌之一 给奶业生产带来严重的影响 LAMP技术根据靶序列上的6个特定区域设计引物 在具有链置换活性的DNA聚合酶作用下 恒温进行扩增 环引物的设计大大提高了反应的速度 由于反应过程中 核算合成时 从dNTPs析出的焦磷酸根离子与反应体系中的镁离子结核 产生大量的焦磷酸酶使反应呈现混浊 可通过肉眼观察反应是否进行 本研究针对金黄色葡萄球菌的femA基因设计合成了LAMP引物进行扩增 并对各反应条件进行优化 对大肠杆菌等实验结果显示特异性强 本研究对金黄色葡萄球菌的检测限8 9cfu mL 比PCR的检测灵敏度高 另外 由于本文采用煮沸法提取模板DNA 使PCR灵敏度有些降低 总之 LAMP方法是一种特异性强 灵敏度高 方便快捷的检测方法 为金黄色葡萄球菌的检测提供了新的方法 具有很高的使用价值 谢谢欣赏 后面内容直接删除就行资料可以编辑修改使用资料可以编辑修改使用 主要经营 网络软件设计