哈工大大一年度项目立项报告.doc

.编号：哈尔滨工业大学大一年度项目立项报告项目名称：关于利用拜氏梭菌制丁醇的培养基条件优化 项目负责人：xxx 学 号：xxxxxxxxxx联系电话：xxxxxxxxxxxxxxxxx电子邮箱：xxxxxxxxxxxxxxxxxx院系及专业：xxxxxxxxxxxxxxxxxxx指导教师：xxx职 称：xxx联系电话：xxxxxxxxxxx 电子邮箱：xxxxxxxxxxxx院系及专业：xxxxxxxxxxxxxxxxxxx哈尔滨工业大学基础学部制表填表日期：2016年11月05日一、项目团队成员姓名性别所在院系学号联系电话本人签字xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx二、指导教师意见 签 名： 年 月 日三、项目专家组意见 批准经费： 元 组长签名： （ 学部盖章 ） 年 月 日精选word范本！四、立项报告关于利用拜氏梭菌制丁醇的培养基条件优化（一）立项背景1.丁醇的广阔应用背景及制备现状丁醇作为一种重要的化工产品原料有着极其重要的地位，可用于传统的浓硫酸催化合成醋酸丁酯工业；与苯酐经硫酸催化制二甲苯二丁酯（DBP），作为增塑剂；与丙烯酸合成丙烯酸丁酯，作为一种重要的聚合单体，广泛应用于涂料、油墨、纺织、皮革、造纸、胶黏剂、橡胶、塑料等领域。丁醇还由于自身良好的物理化学性质应用于冶金工业作为TMK（测定金的显色剂）的理想溶解剂；在病理组织制片中起到脱水、透明的双重作用，可使组织完全脱水，不需要根据材料而变化，且组织不会变硬变脆或收缩，对医务人员无任何副作用，取代了常规的乙醇和二甲苯。此外，丁醇还由于高热值、挥发性小、腐蚀性小，可与汽油、柴油混合且不需要对车辆进行改造，可使用现有的石油供应和分销系统而成为仅次于乙醇第二大可再生能源1。因此使用丁醇作为新一代可再生能源能够降低国内对石油进口的依赖性，实现燃料类型多元化，缓解因石油引发的国际关系紧张等一系列因化石燃料短缺带来的国际性问题。工业上比较成熟的丁醇生产方法有3种：醇醛缩合法、羰基合成法和发酵法。其中醇醛缩合法和羰基合成法均属于化学合成法，二者都以石油为原材料，随着石油产量的降低以及中东国家对石油控制的加强，近几年这两种投资相对较大，而且对技术设备要求较高，已经不再适用。微生物发酵法以原料来源广泛、价格低廉、工艺设备简单、投资小、生产条件温和、不需贵重金属催化剂、安全性高、选择性好、副产物少，易于分离纯化、温室气体排放量少等优点逐步成为制丁醇的主要途径2。2.生物发酵法制丁醇工业的现状和问题目前生物发酵法仍然有着巨大的发展空间，丁醇的市场很大，但是产量却并不能满足需求。生物制丁醇工业还有巨大的改进和科学研究空间。只有进行进一步的科学研究才能发挥其成本低廉的优势，产生巨大的生产效益。生物法制丁醇现存的主要问题是产量低下、发酵周期长，发酵产物对菌种的毒性比较大，会在发酵过程中产生较大的毒性，导致菌种不能正常生长，最终影响到生产的周期和产量3-4。其次，在培养的过程中，培养基的成分以及含量会对发酵周期及产量产生影响，各种不同的化学因子以及化学因子的量会对培养基及结果有着或好或坏的影响5。通过培养基成分的优化研究是解决丁醇产量和周期问题的重要途径。3.课题研究意义通过研究生物发酵制丁醇时培养基各组分及其相互作用对丁醇产量的影响，以解决工业制丁醇时产量低下以及发酵周期过长的问题，对工业化生产丁醇有着重要意义。（二）项目研究内容及实施方案1.研究内容本研究拟根据文献确定采用葡萄糖为碳源时培养基组成中影响丁醇产量的7-8个显著因素及PB试验中相应的低水平值，利用Plackett-Burman试验确定3-4个p值0.1的最主要影响因素，再用最陡爬坡实验确定中心点，通过中心组合设计进一步优化试验并采用响应面分析法分析结果得出最优组合，通过验证以期使丁醇产量达到7g/L以上。本研究主要使用的实验设计及数据分析软件为Design-Expert8.0.6.1。2.实施方案确定试验设计方案：进行Plackett-burman（PB）实验：在研究微生物制丁醇的培养基条件优化时，影响因素往往种类繁多，且各组分间相互作用也错综复杂。因而，找到主要的影响因素就显得尤为重要。而Plackett-burman（PB）是基于非完全平衡块原理，它试图用最少的试验次数达到使因素的主效果得到尽可能准确的估计，适用于从众多考察因素中快速有效地筛选出最为重要的几个因素，供进一步研究。试验中每个因素取高低两个水平，低水平为原始培养条件，高水平约取低水平的1.25倍。对实验结果进行分析，得出各因素的可信度水平。一般选择可信度大于90以上的因素作为重要因素6。最陡爬坡试验：CCD试验得到的拟合方程只是能考察紧接邻域并将其充分近似的情形，在其他区域拟合方程与被近似的函数方程毫无相似之处。所以，只有先逼近最佳值区域才能建立有效的响应面拟合方程。按着Plackett-burman筛选出来的结果确定对象最陡爬坡法以响应值变化的梯度方向为爬坡方向，根据各因素响应值的大小、正负确定步长与方向，能经济、快速的逼近最佳值区域，确定下一步的RSM中心点7。Central Composite Design（CCD）试验：一般的试验设计与优化方法，都未能给出直观的图形，因而也不能凭直觉观察其最优化点，虽然能找出最优值，但难以直观地判别优化区域为此响应面分析法（也称响应曲面法）应运而生。响应面分析也是一种最优化方法，运用图形技术将这种函数关系显示出来，以供我们凭借直觉的观察来选择试验设计中的最优化条件8。它有两种方法，一种为响应面分析法中的中心组合设计（CCD），另一种为Box-Benhnken(BB)实验。而CCD比BB实验能更好的拟合相应曲面。因为CCD的设计过程中，有很多点会超出原定的水平，CCD适用于多因素多水平实验，有连续变量存在；BBD适用于因素水平较少（因素一般少于5个，水平为3个）。所以用CCD可以有效并准确的在中心点附近确定各因素的五个不同水平并进行CCD实验设计，响应面分析确定最佳浓度组合并根据回归方程得到预期丁醇产量。运用Design-Expert软件整合求解：Design-Expert软件是一个很方便的进行响应面优化分析的商业软件，在Design-Expert软件中，有一个专门的模块是针对响应曲面法（RSM）。其可以很好的进行二次多项式类的曲面分析，一些操作比另一种软件SAS更为方便，其三维做图的效果比SAS更为直观。响应面分析的优化结果，可以由软件自动获得，而无需将曲面方程使用MATLAB之类数学工具的进行求解。确定影响因素碳源：单一还原糖利用率最高的为葡萄糖，但考虑到工业上常以糖蜜、野生植物、淀粉质和纸浆废液为原料制丁醇9，木糖在木质纤维素资源水解产物中含量仅次于葡萄糖，又由于碳代谢抑制作用（CCR）的存在木糖的利用成为发酵过程中的限制因素10。但考虑到实验量本实验拟以葡萄糖为单一碳源进行实验11。氮源：氮源分为蛋白质类和非蛋白质类，蛋白质类氮源大部分都是粉状或膏状物质会增加制备培养基和调节pH难度12，所以选择非蛋白质类氮源(NH4)2SO4。无机盐：细菌生长繁殖需要多种无机盐离子，如Mg2+可作为己糖磷酸化酶、异柠檬酸脱氢酶、核酸聚合酶的活性中心组分，同时可以维持细胞膜内外两侧的pH，减少高浓度丁醇对细胞的毒害作用；P元素可作为核酸、核蛋白、磷脂、辅酶及ATP等高等分子成分，同时HPO42-H2PO4-可作为缓冲系统调节培养基pH；K+会影响细胞膜两侧pH；Fe2+可控制细胞内氧化还原电位，并调节和维持细胞的渗透压平衡；当(NH4)2SO4位氮源时，由于NH4+被吸收，导致培养基pH下降，需要在培养基中加入CaCO3作为缓冲物质13。故本实验拟采用MgSO47H2O、K2HPO43H4O、FeSO47H2O和CaCO3作为无机盐类影响因素。生长因子：生长因子是一些细菌生长所必须而自身不能合成的物质，通常为有机化合物，包括B族维生素、某些氨基酸、嘌呤及嘧啶等。少数细菌还需要特殊的生长因子，故常在培养基中加入动物血清、酵母浸液、肝浸液及鸡蛋等。丙酮丁醇梭菌以生物素和对氨基苯甲酸作为生长因子。本实验拟选择生物素和对氨基苯甲酸作为生长因子类影响因素。确定实验条件及方法菌种：ABE发酵工业菌种是梭状芽胞杆菌，近年来研究表明产溶剂梭菌归为4个种，一种是丙酮丁醇梭菌，以淀粉质为原料，主要发酵玉米和谷类等，其他3种是以糖为原料，它们是拜氏梭菌、糖丁酸梭菌和糖乙酸多丁醇梭菌14。目前生产用的菌种都是经过选育驯化得来的，提高了丁醇的比例，也提高了转化率，并且选育出适合废渣、废液等特定原料的菌种15。本实验采用实验室提供菌种拜氏梭菌F-6。温度：最适培养温度37，最适发酵温度37，从总溶剂转化率综合考虑最适温度为37。pH：菌体生长最适pH为5.5-7.0，发酵最适pH为5.0，当pH低于4.0或高于8.0时不利于发酵。发酵分成两个阶段，有产酸和产溶剂两步16。产酸期，发酵前期菌体快速生长，大量分解利用碳源，产生乙酸和丁酸，同时释放H2和CO2，发酵液的pH逐渐降低。菌体的生长速度减慢，开始进入稳定期。产溶剂期，发酵液的pH降低到4.3左右就不再下降而是逐渐上升，与此同时溶剂也开始积累，并且由产酸期向产溶剂期转变，然而这一转变机制尚未研究清楚。在这一阶段乙酸和丁酸不再大量积累而是被还原成ABE。若发酵过程中pH最低小于3.3就可能染菌或酸败17。综合考虑初始pH以7.0最佳18。菌种活化及保藏：每次实验开始时活化一次，进行厌氧瓶发酵，菌种保藏将采用简单保藏，置于4-6摄氏度冰箱内保藏12个月。发酵方式：批次发酵接种量：1%产物预处理：发酵液中杂质较多，在做气相色谱分析以前要进行预处理，以防色谱柱堵塞。发酵液12000r/min离心l0min，取上清液19。检测方法和数据分析：使用气相色谱分析产物丁醇的浓度并采用外标法。使Design-Expert8.0软件处理实验数据。实验流程PB实验：根据培养基的组成选取碳源中的葡萄糖，氮源中的(NH4)2SO4，无机盐中的MgSO47H2O、K2HPO43H2O、FeSO47H2O和CaCO3，生长因子中的生物素和对氨基苯甲酸为初期影响因素并查阅相关文献确定每个影响因素的最适值，以此值作为PB实验的低水平值，1.5倍左右为高水平值进行PB实验，并设置两个虚拟变量以消除实验时其他因素带来的误差。根据实验结果得到关于产量的一次方程，确定3-4个主要影响因素；最陡爬坡实验：根据具体情况确定爬坡实验的方向和步长，进行实验并根据结果确定RSM中心点；CCD实验：在中心点附近确定各因素的五个不同水平并进行CCD实验设计，对得到的实验结果进行回归拟合得到关于产量的二次方程，通过响应面分析确定最佳浓度组合并根据方程得到预期丁醇产量。检验实验：根据RSM试验结果进行三组平行实验，检测丁醇的平均浓度，与预期结果比较检验方程。（三）进度安排1.查阅文献：2016年11月-2017年2月2.学习基本操作：2016年11月下半月-2016年12月3.进行前期实验：2017年3月4.进行后期实验：2017年4月-2017年5月5.项目总结与结题：2017年6月（四）中期及结题预期目标1.中期预期目标：1) 查阅文献并设计实验熟悉实验流程并掌握实验操作2) 学会使用Design-Expert8.0软件。2.结题预期目标： 3) 通过培养基优化使丁醇产量达到7.0g/L以上，达到项目实验目的；4) 通过年度项目使每个成员了解进行科学研究时的大致流程并具备一定的查找资料的能力，全面提高本小组成员的科研素质；5) 学会PB、CCD等实验设计方法，了解实验设计对实验的重要性，并学会一款专业实验设计软件的使用。（五）经费使用计划1.资料费、打印费：200元2.交通费：300元3.耗材费：500元总计：1000元（六）主要参考文献1申利英. 汽爆玉米秸秆发酵制取生物丁醇的试验研究D.郑州大学,2012.2葛慧,陆文钦,郭志强. 新型能源纤维素丁醇产业化发展现状及前景分析J. 中国生物工程杂志,2016,02:115-121.3汪江林. 探析高产丁醇菌种的选育及代谢副产物对丁醇发酵的影响J. 科技与创新,2016,03:124.4庞宗文,俸雪,吴三星,陆薇. 以新鲜马铃薯为原料发酵丙酮丁醇的研究J. 可再生能源,2012,11:83-86+92.5刘力强,杨丽萍,李立强,米造吉,谢萍,黄品奇,王正品. 生物丁醇燃料产业化制造中的问题及发展趋势J. 生物产业技术,2008,05:36-44.6曹小红,蔡萍,李凡,王春玲,鲁梅芳. 利用响应面法优化Bacillus natto TK-1产脂肽发酵培养基J. 中国生物工程杂志,2007,04:59-65.7李伟佳,陈春燕,崔海娣,张俊青,应超,肖泽仪,汤晓玉. 丙酮丁醇梭菌发酵条件优化研究J. 中国酿造,2013,0