鸽禽Ⅰ型副粘病毒分离株生物学特性测定.pdf

副粘病毒 鸽禽i 型副粘病毒分离株生物学特性测定 邹永新 余双祥 刘思伽 李剑荣 黄爱芳 沙才华 罗映霞 广东省家禽科学研究所 广州市 5 1 0 2 4 0 鸽禽i 型副粘病毒 a v i a n p a r a m y x o v i r u s t y p e i p a p mv i 感染 因其病原及症状均与鸡 新城疫 n d 十分相似 通常又称之为鸽新城疫 或 鸽瘟 是鸽的一种急性烈性传染病 自2 0 世纪7 0 年 代末在伊拉克首次报道疫情以来 欧洲 北美洲以及 日 本 香港 东南亚等许多国家和地区先后都有本病 的发生和流行的报道 1 9 8 5 年 我国深圳及珠海拱 北动检所先后从进口种鸽中发现本病 并分离到病 毒 随后 疫情逐渐扩大 我国华南 华东 华北地区 大部分省区都已有本病的报道 给养鸽业造成严重 的经济损失 我们于1 9 9 7 年到现在从广东的深圳 东莞 肇庆 茂名 佛山 广州市郊及山东 福建 四川 等地的发病鸽群中分离并鉴定到 2 3 株禽i 型副粘 病毒 并对其中6 株病毒进行生物学特性研究 1 材料与方法 1 1 试验材料 1 1 1病料 来自山东 福建 四川及广东的深圳 东 莞 肇庆 茂名 佛山 广州市郊的养鸽场 户 不同龄 期的病死鸽 1 1 2实验动物 s p f鸡胚 非免疫鸡胚和鸡 由广 东永顺生物制品有限公司提供 实验鸡只饲养于严 格消毒和管理的环境中 实验鸽 由广东省家禽科学 研究所实验基地提供未免疫鸽 p a p mv i h i 效 价为 0 1 1 3抗原与抗体 鸡 n d l a s o t a株病毒 抗鸡 n d v ai h5 a i h9 a i h7 和 e d s v阳性抗 体 购自 哈尔滨兽医 研究所 鸽抗p 1 9 9 9 0 2 1 高免 血清 由广东省家禽科学研究所提供 1 1 4细胞及细胞培养基 鸡胚原代细胞 犊牛血 清 由广东省家禽科学研究所提供 细胞洗涤液 为 p h 7 2 之h a n k 平衡盐溶液 细胞培养液 以0 5 水解乳蛋白h a n k s平衡盐溶液为基础在生长 液中加 1 0 犊牛血清 维持液中含5 犊牛血清 1 2 试验方法 1 2 1流行病学调查 对病死鸽和表现有拉绿色稀 粪及扭头等神经症状鸽群进行流行病学调查 临诊 症状和剖检病变观察 1 2 2细菌学检查 无菌取病死鸽的肝 脑 心血等 病料作常规细菌分离 1 2 3 病毒分离 常规选取病死鸽的肝 胰 脾脏等 组织病料 按常规制成1 3 悬液 4 0 0 0 转 分离心2 0 分钟 然后过滤除菌 经绒毛尿囊腔接种 9 n天龄 非免疫鸡胚 1 0 只 每胚 0 2 m 1 另取2只接等量生 理盐水作对照 然后继续孵育 2 4 小时前死亡者废 弃 收集在接种后4 8 1 2 0 小时内死亡胚的尿囊液 取第 1 代尿囊液 1 0 倍稀释后 按以上方法连续传 5 代 分别收取各代死亡胚的尿囊液 并检测其对鸡红 细胞的凝集作用 1 2 4 病毒初步鉴定 1 2 4 1 病毒血凝价 h a 测定 用常规微量法血凝 试验 测定鸡胚尿囊液的h a效价 1 2 4 2 血凝抑制 h i 试验按常规h i 方法测 定 以分离毒鸡胚尿囊液和鸡n d l a s o t a 株病毒与 鸽抗 p 1 9 9 9 0 2 1高免血清 抗鸡 n d v a l h5 a i h 9 a i h 7 和e d s v阳性抗体进行交叉 h i 试验 其h i 价结果判定以5 0 完全抑制血凝的最 高稀释度为终点 以x l o g 2 表示 每次测定均重复一 次 取平均值 1 2 5 病毒的纯化 将 1 2 2中分离并经h a试验 测定具有 h a效价 的尿囊液倍比稀释 分别接种到鸡胚原代细胞上 3 7 感作 2 小时 用h a n k 平衡盐溶液洗 2 次 加 人细胞培养液 3 7 1c 培养 逐日观察 待 7 5 以上细 胞出现病变时收获 1 2 6 病毒电镜观察 按常规悬滴法将尿囊液以3 0 o 磷钨酸染色 i mi n 在电镜下观察 1 2 7动物试验 1 2 7 1 人工感染鸽试验 以0 l m l 的分离毒株的 原代种毒液对1 0 只1 月龄未免疫的鸽肌肉注射 滴 鼻和点眼感染 观察 2 0 天 记录发病和死亡情况 未 一5 3 7 一 中国畜牧兽医学会禽病学分会第十四次学术研讨会论文集 发病鸽则采血检测抗体 1 2 7 2人工感染鸡试验 以0 1 m 1 的分离毒株的 原代种毒液对1 0 只1 月龄非免疫鸡肌肉注射 滴鼻 和点眼 观察2 0 天 记录发病和死亡情况 未发病鸡 则采血检测抗体 1 2 8病毒毒力测定 1 2 8 1 i c p i 测定参照a l l a n 等的方法进行 1 2 8 2 i v p i 测定 参照a l l a n 等的方法进行 1 2 8 3 e i d s l d md t测定 参照h a n s o n等的 方法进行 2试验结果 2 1 流行病学调查 调查结果表明 本病毒能在鸽群 中迅速传播 新疫场多呈急性爆发性流行 肉鸽 信 鸽和赛鸽等各类鸽均可发生 各龄期的鸽都有易感 性 但临诊发病多见于3 年龄以下的鸽 以乳鸽最敏 感 发病率和死亡率高 达5 0 0 0 8 0 以上 有些甚 至高达9 5 以上 老疫场则表现为种鸽散发 多见 乳鸽发病 本病不是大批在短期内迅速死亡 而是每 天小批不断有病鸽死亡 发病后未死亡者均因消瘦 和神经症状而成为残次鸽 被迫淘汰 流行期可长达 天 临诊症状以腹泻和神经症状为主 剖检以皮 下 特别是颈部皮下 消化道和脑部充血出血为主 要特征 2 2细菌分离培养 接种的马丁肉汤 血斜面培养 3 天均未见细菌生长 2 3病毒分离结果 从以上地区发病鸽群中分离出 2 3 株p a p mv i 病毒 从中选出6 株病毒 命名 为 p 1 9 9 9 0 2 1 p 2 0 0 0 0 一 p 2 0 0 1 0 3 5 p 2 0 0 2 0 一 p 2 0 0 3 0 1 s p 2 0 0 4 0 1 3 作进一步生物学试验 初次分离只出现胚 体发生病变而鸡胚尿囊液无血凝价 在传3 4 代以 后 鸡胚出现规律性死亡 鸡胚尿囊液血凝价逐渐升 高 2 4病毒的初步鉴定 2 4 1 病毒血凝价 h a 测定对鸡胚分离物尿囊液 进行血凝性测定 其h a效价在3 8 1 o g 2 2 4 2血凝抑制 h i 试验 应用各分离毒株鸡胚尿 囊液和鸡n d l a s o t a 株病毒与鸽抗 p 1 9 9 9 0 2 高免血 清 抗鸡 n d v a i 一h5 a i 一h9 a i 一h7和 e d s v阳性抗体进行交叉h i 试验 可见 分离毒株 的血凝特性能被鸡抗n d高免血清所抑制 但不能 被a i h 5 a i h 9 a i h 7 和e d s v阳性抗体所 抑制 分离毒株与n d l a s o t a能够发生高度交叉血 凝抑制 同一份鸡抗n d v血清或鸽抗p 1 9 9 9 0 2 1 血清 对分离毒株与n d l a s o t a的血凝抑制效价存在差 异 效价相差2 个滴度 其中分离毒株或 n d l a s o t a 与同源血清反应的滴度 较之与非同源血清抗体反 应高 可高出2 3 个滴度 2 5 病毒的纯化 鸡胚分离毒第3 代接种鸡胚原代细 胞单层后 4 4 4 8 h出现细胞病变 形成多核巨细 胞 空斑试验结果表明 分离毒于接种5 d 后形成3 种大小不等的空斑 随着时间的延长 空斑日渐增 大 最后连成一片 于 接种7 d 后测量空 斑大 小为 大 斑 2 0 2 6 m m 中斑 1 5 1 9 m m 小斑 0 7 一1 o m m 将有细胞病变的最高倍数稀释度病毒液收 获 重复接种鸡胚原代细胞单层2 3 次 纯化的病 毒用9 1 1 天龄s p f鸡胚增殖 收获尿囊液分装后 作为原代种毒 一7 0 保存 2 6电镜观察 在电镜下鸡胚分离毒为有纤突的病 毒粒子 直径均为1 0 0 2 0 0 n m 2 7 动物回归实验结果 经发病的非免疫鸽 共 6 0 只 2 4 小时一第 6 天出现症状 第 5 天开始死亡 在2 0 天内共死亡2 4 只 8 只出现扭头等神经症状 检测未死亡鸽的血清对 n d v的h i 效价 平均在 4 5 1 o g 2 之间 表明鸽均有感染分离毒 发病率达 1 0 0 致死率为4 0 0 o a经攻毒的非免疫鸡 均无病 症 测其h i 效价 平均在3 6 l o g 2 之间 表明鸡均 有感染病毒 但未表现临诊症状 对照组的鸡 鸽均 生长良好 2 8 病毒毒力测定 2 8 1 i c p i 测定结果 6 株分离毒i c p i 分别为 1 5 8 1 5 6 1 4 3 0 6 4 0 8 4 0 9 5 2 8 2 i v p i 测定结果 6株分离毒 i v p i 分别为 2 2 1 2 3 0 1 9 5 0 1 0 0 8 5 1 1 0 2 8 3 e i d l d md t测定结果6 株分离毒e i d s o 分别为 1 0 s a 4 0 2 m l 1 0 s z 0 2 m 1 1 0 7 8 0 0 2 m l 1 0 0 2 m l 1 0 0 0 0 2 m l 1 0 8 7 0 0 2 m1 l d分别为1 03 1 0 3 1 0 1 0 1 0 4 1 0 md t 分别为9 6 h 9 6 h 1 0 6 h 9 8 4 h 1 0 2 h 9 8 h 3小结与讨论 3 1 经流行病学调查 临诊症状 剖检病变观察 结 一5 3 8 一 副粘病毒 合从病死鸽中分离到病毒 其具有血凝特性 且能被 抗n d v阳性血清抑制 病毒的电镜观察及动物回 归试验 可以判定分离病毒为p a p mv i 与以往 报道的关于p a p mv i 对鸡和鸽致病性不同是相 一致的 3 2根据分离毒株与l a s o t a 毒株的交叉血凝抑制试 验 分离毒株或 n d l a s o t a 与同源血清反应的滴度 较之与非同源血清抗体反应高 可高出2 3 个滴 度 这可能是导致现场应用鸡n d疫苗免疫鸽保护 效率不高的主要原因 但可用鸡抗l a s o t a 血清检测 p a p mv一i 3 3 据o i e推荐的病毒毒力鉴定的判定标准 i c p i 值0 2 0 5 为温和型 可见本研究分离的6 株p a p mv i 均属温和型 这与有关学者对p a p mv i 分离株毒力测定结果基本相符 3 4据报道p a p mv i 的基因型属于基因v i 型 本分离株是否属于基因v i 型有待于进一步研究 至目 前p a p mv i 感染仍是鸽最重要的传染病 在全国许多地区均有流行 应引起高度重视 3 5 在防制方面 疫苗的免疫接种是防制本病的重 要手段和最有效的方法 目前尚无商品性p a p mv i 灭活 弱毒活 疫苗 因此不少地方采用鸡 n d 疫苗进行免疫 对鸡n d疫苗的免疫效果现仍存在 着不同的看法和争论 现场应用的效果也并不一致 免疫鸽仍时有本病的发生 究其原因 很可能是与鸽 群感染的毒株不同有关 有报道认为 应用以p a p mv 1 同源病毒制备的灭活疫苗能为免疫鸽提 供更为坚强而持久的免疫保护 与此同时 做好其他 疾病的常规免疫预防工作也很重要 如鸽痘 毛滴虫 病 念珠菌病 沙门氏杆菌病及大肠杆菌病等 若发 生疫情 除紧急免疫接种外 一些中草药制剂 结合 抗生素的适当应用 均有良好的辅助治疗作用和控 制细菌性病原继发感染 促进鸽群的康复 参考文献 略 几株野生鸟类来源的 i 型禽副粘病毒分子生物学特征的研究 数艳华 任涛 孔令辰 华南农业大学兽医学院禽病学教研室 农业部养禽与禽病防治重点开放实验室 广东广州 5 1 0 6 4 0 摘要 参考g e n b a n k 中的i 型禽副枯病毒 a v i a n p a r a m y x o v i r u s a p mv 1 序列 在f基因的3 端相对保守区设 计1 对引物 利用r t p c r方法对华南农业大学兽医学院禽病学教研室近两年来从广州和深圳两个地区分离的4 种鸟类来 源共1 0 株 i 型禽副粘病毒毒株的f基因进行了扩增 其扩增长度约为4 5 0 6 p 测序结果表明 广州株与n d v的基因n型有高 度的同源性 1 个深圳株与w型有较高的同源性 其氨荃酸序列均符合f蛋白 裂解位点区 1 1 2 1 1 7 强毒株的氨基酸序列特 征 其它4 个深圳株均与基因i 型有很高的同源性 其氛基酸序列均符合f蛋白裂解位点区 1 1 2 1 1 7 弱毒株的氨基酸序列 特征 关健词 i 型禽副粘病毒 f基因 序列分析 基因型 禽i 型副粘病毒 a v i a n p a r a m y x o v i r u s t y p e i a p mv 1 属于副粘病毒科 p a r a m y x o v i r i d a e 副 粘 病 毒 亚 科 腮 腺 炎 病 毒 属 r u b u l a v i r u s 它包括 9 个