（制糖工程专业论文）酿酒酵母的重组及其消化道途径转基因过程研究.pdf

摘 要 摘 要 消化道途径非病毒基因治疗具有方便、安全和易于推广的特点，被认为是基 因治疗应用于临床的一种理想模式，具有巨大的市场前景。寻找可靠，实用，天 然的基因药物载体系统，研究其作用机制，是消化道途径非病毒基因治疗获得突 破性进展的关键。 为探索酿酒酵母作为基因运送载体以消化道途径转基因的可能性， 本研究采 用建立在通用载体质粒融合系统 ( u n i - v e c t o r p l a s m i d - f u s i o n s y s t e m , u p s )上的 e c h 。系统，分别构建了两种以绿色荧光蛋白 ( g f p )为报告基因的酿酒酵母附加 型 重组质粒。其中一种是 酿酒酵母 一 哺乳动物细胞穿梭质粒p y e s - c m v - g f p ，另 一种为酿酒酵母表达质粒 p y e s - g f p 。以 常规的醋酸铿化学法将所构建的重组质 粒对酿酒酵母细胞进行转化，在尿嗜陡缺陷型的培养平板上筛选出阳性转化子， 经鉴定获得分别携带p y e s - c m v - g f p , p y e s - g f p 的重组酿酒酵母。 经过不同 碳 源培养后发现:携带p y e s - c m v - g f p 的重组酿酒酵母没有g f p 基因的 表达;而 携带p y e s - g f p 的重组酿酒酵母经半乳糖诱导后表达g f p 。所构建的两种质粒经 酵母近 1 0 0代培养后仍未发生丢失，具有 良好的稳定性。以脂质体介导 p y e s - c m v - g f p对不同哺乳动物细胞的转染， g f p得到表达，证明酿酒酵母一 哺 乳动物细胞穿梭载体构建 成功;制备p y e s - g f p 在酿酒酵母细胞经诱导表达后转 录的 m r n a , r t - p c r鉴定后以脂质体介导其对不同动物细胞的转染，在不同时 间后均观测到 g f p的绿色荧光，证明重组酿酒酵母 m r n a对动物细胞具有种属 通用性。 以b a l b ( c小鼠为灌胃实验动物模型，通过 e l i s a实验检测动物体内抗 g f p 特异性抗体的产生， 采用免疫组化实验鉴定组织中g f p的表达。根据管饲材料不 同进行实验分组:第 i 组为空白对照组;第2组管饲酿酒酵母 i n v s c i ;第 3 组 管饲携带p y e s - c m v - g f p的重组酿酒酵母:第4 组管饲携带p y e s - g f p但未经 诱导表达的重组酿酒酵母， 第 5 组管饲经诱导表达g f p的重组酿酒酵母; 第6组 管饲经诱导表达 g f p并破壁除去 r n a的重组酿酒酵母。结果发现:在第 3组实 验小鼠外周血清及小肠提取液中产生了抗g f p的i g g , i g a抗体，且抗体水平与 l , 2对照组相比，存在显著性差异 ( p 0 . 0 5 ) 。同时，该组有小鼠小肠、肝和脾 组织的g f p免疫组化检测呈阳性，而 1 , 2 对照组小鼠各组织中g f p的表达呈阴 性。 说明: 重组酿酒酵母所携带的p y e s - c m v - g f p 在小鼠体内经转录、 翻译得到 表达。另外，第5 组小鼠外周血清及小肠提取液中抗g f p的i g g , i g a抗体水平 明显高于 1 , 4对照组 ( p 0 .0 5 ) . 同时，经免疫组化实验发现:与 l , 4和6对照组相比，只有第 5 组有小鼠的小肠 组织免疫组化检测呈阳性。 提示: 携带 p y e s - g f p 的重组酿酒酵母经诱导表达后， 华南理工大学工学博士学位论文 其中的m r n a可能进入小肠赫膜细胞，被识别并翻泽出g f p o 根据实验结果: 以酿酒酵母作为外源基因载体， 能够实现消化道途径转基因， 为以此进行深入的消化道途径基因治疗提供了新的技术平台，并为消化道途径基 因治疗药物的研究及开发提供了新思路。 关键词:基因治疗消化道途径基因运送载体酿酒酵母g f p abs tract ab s t r a c t n o n - v i r a l g e n e t h e r a p y t h r o u g h d i g e s t i v e t r a c t ( o r t h e n o n - v i r a l d i g e s t i v e - t r a c t - r o u t e g e n e t h e r a p y : n d g ) c a n b e a n e x p e d i e n t , s a f e r a n d p r a c t i c a l t e c h n o l o g y , e x h i b i t i n g g r e a t p o t e n t i a l b o t h i n c l i n i c a l p r o s p e c t s a n d i n t h e o r e t i c a l s t u d i e s . t h e c r i t i c a l s t e p i n n d g i s t o f i n d r e l i a b l e , f e a s i b l e a n d n a t u r a l g e n e d e l i v e r y v e h i c l e . i n t h i s s t u d y r e c o m b i n a n t y e a s t w a s u s e d a s g e n e d e l i v e r y v e h i c l e s t o g e t h e r w i t h t h e p l a s m i d s c o n s t r u c t e d a s d i f f e r e n t e x p r e s s i o n v e c t o r s . o n l y t h r o u g h e l u c i d a t i n g t h e m e c h a n i s m o f g e n e t r a n s f e r s y s t e m , c o u l d b r e a k t h r o u g h i n n d g b e m a d e . t o e x p l o r e t h e a p p l i c a b i l i t y o f t h e s . c e r e v i s i a e a s n d g g e n e d e l i v e r y v e h i c l e s , u n i - v e c t o r p l a s m i d - f u s i o n s y s t e m ( u p s ) h a s b e e n a p p l i e d , b y w h i c h g r e e n f l u o r e s c e n t p r o t e i n ( g f p ) e x p r e s s i o n p l a s m i d s w e r e c o n s t r u c t e d , n a m e l y t h e p y e s - c mv - g f p a n d p y e s - g f p . t h e p y e s - g f p p l a s m i d i s a n y e a s t e x p r e s s i o n p l a s m i d w h i l e t h e p y e s - c m v - g f p p l a s m i d w a s c o n s t r u c t e d t o b e a y e a s t - m a m m a l i a n s h u t t l e v e c t o r . e x p r e s s i o n p l a s m i d w e r e t r a n s f e r r e d i n t o y e a s t h o s t c e l l s b y c o n v e n t i o n a l l i t h i u m a c e t a t e p r o t o c o l s a n d b e i n g s e l e c t e d o n u r a c i l a t r o p h i c s e l e c t i o n m e d i a a n d p l a t e s . t h e p o s i t i v e c l o n e s w e r e i d e n t i f i e d a n d s c r e e n e d , p y e s - g f p a n d p y e s - c mv - g f p p l a s m i d s w e r e c o n f i r m e d r e s p e c t i v e l y . i t w a s f o u n d t h a t g f p w i l l n o t e x p r e s s e d i n t h e p y e s - c mv - g f p ( + ) s t r a i n o f y e a s t , w h i l e g f p c o u l d b e d e t e c t e d i n p y e s - g f p( + ) s t r a i n o f y e a s t o n l y a f t e r b e i n g i n d u c e d b y g a l a c t o s e . a f t e r o v e r 1 0 0 p a s s a g e s , b o t h s t r a i n s s h o w e d s t a b l e p l a s m i d i n h e r i t a n c e a n d c o n s i s t e n c e . t h e p l a s m i d s w e r e t r a n s f o r m e d i n t o e . c o l i a n d a m p l i f i e d , t h e p l a s m i d s w e r e p u r i f i e d t o b e u s e d i n l i p o s o m e m e d i a t e d g e n e t r a n s f e r i n t o d i f f e r e n t i n v i t r o c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l l i n e s . i t w a s f o u n d t h a t p y e s - c mv - g f p c o u l d b e e x p r e s s e d i n t h e m a m m a l i a n c e l l s . f u r t h e r s t u d i e s p u r i f i e d m r n a s f r o m t h e g a l a c t o s e i n d u c e d p y e s - g f p ( + ) y e a s t s t r a i n s , t h e s e m r n a s w e r e u s e d t o t r a n s f e c t c u l t u r e d m a m m a l i a n c e l l s . i t w a s f o u n d g f p c o u l d b e e x p r e s s e d a n d b e f u n c t i o n a l , d e m o n s t r a t e d b y t h e b r i g h t g r e e n f l u o r e s c e n t e m i s s i o n . t h e s e s t u d i e s i n d i c a t e d t h a t t h e e x p r e s s i o n p l a s m i d c o n s t r u c t i o n s w e r e s u c c e s s f u l a n d t h e m r n a s e x p r e s s e d f r o m y e a s t c o u l d a l s o b e t r a n s l a t e d i n t o f u n c t i o n a l p r o t e i n s i n t h e m a m m a l i a n c e l l s . a n i m a l s t u d i e s w e r e c o n d u c t e d b y u s i n g b a l b t c m i c e . e x p e r i m e n t a l a n i m a l s w e r e f e d w i t h y e a s t s b e a r i n g d i f f e r e n t p l a s m i d s . e n z y m e - l i n k e d i m m u n o s o r b e n t a s s a y ( e l i s a ) w e r e u s e d t o a s s a y w h e t h e r s p e c i f i c g f p a n t i b o d i e s c o u l d b e d e t e c t e d , w h i l e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y s t u d i e s w e r e u s e d t o l o c a t e g f p e x p r e s s i o n o f t i s s u e i n s i t u . s i x e x p e r i m e n t a l a n i m a l s w e r e g r o u p e d . g r o u p 1 w a s t h e b l a n k c o n t r o l , w i t h o u t x 华 南 理 工 大 学 工 学 博 士学 位 论 文 f e e d i n g w i t h a n y e x p e r i m e n t a l m a t e r i a l s , g r o u p 2 w a s t h e n e g a t i v e c o n t r o l , w i t h t h e m i c e f e d w i t h t h e h o s t y e a s t s t r a i n ( i n v s c i ) , w i t h o u t b e a r i n g a n y p l a s m i d c o n s t r u c t e d , g r o u p 3 w a s t h e e x p e r i m e n t a l g r o u p w i t h t h e m i c e f e d w i t h p y e s - c mv - g f p ( + ) y e a s t s , g r o u p 4 m i c e f e d w i t h p y e s - g f p( + ) y e a s t w i t h o u t g a l a c t o s e i n d u c e m e n t , g r o u p 5 m i c e f e d w i t h g a l a c t o s e i n d u c e d p y e s - g f p ( + ) y e a s t , g r o u p 6 m i c e f e d w i t h g a l a c t o s e i n d u c e d p y e s - g f p ( + ) y e a s t s , b u t w i t h b r e a c h e d c e l l w a l l s a n d t r e a t e d w i t h r n a s e a . t h e r e s u l t s d e m o n s t r a t e d t h a t i n g r o u p 3 , t h e g f p a n t i b o d i e s ( i g g , i g a ) w e r e e l e v a t e d i n p e r i p h e r a l s e r u m a s w e l t a s i n t e s t i n a l j u i c e , w h i c h s h o w e d s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e ( p 0 . 0 5 ) w h e n c o m p a r e d w i t h g r o u p 1 a n d 2 . h i s t o - i m m u n o c h e m i s t r y a s s a y s a l s o f o u n d t h a t g f p w e r e e x p r e s s e d i n t h e i n t e s t i n e , l i v e r a n d s p l e e n o f t h e g r o u p 3 e x p e r i m e n t a l a n i m a l , w h i l e s h o w i n g n e g a t i v e i n g r o u p 1 a n d 2 c o n t r o l s . t h e s e r e s u l t s i n d i c a t e d t h a t r e c o m b i n a n t p y e s - c mv - g f p h a s b e e n s u c c e s s f u l l y t r a n s f e r r e d t h r o u g h t h e d i g e s t i v e t r a c t , e x p r e s s e d i n s i t u t h e f u n c t i o n g f p p r o d u c t s . s t u d y o f t h e g r o u p 5 m i c e a l s o s h o w e d e l e v a t e d g f p a n t i b o d i e s i n t h e p e r i p h e r a l s e r u m a n d i n t e s t i n a l j u i c e , s i g n i f i c a n t d i f f e r e n c e c a n b e d e t e c t e d w h e n c o m p a r e d w i t h e x p e r i m e n t a l d a t a f r o m g r o u p i a n d 4 ( p 0 . 0 5 ) . f u r t h e r m o r e , o n l y g r o u p 5 s h o w e d d i s t i n g u i s h e d p o s i t i v e h i s t o i m m u n o c h e m i s t r y i n t h e i n t e s t i n a l t i s s u e s a m o n g t h e g r o u p 1 ,4 , 5 a n d 6 . t h i s i n d i c a t e d t h a t t h e m e c h a n i s m o f i n t e s t i n a l g e n e t r a n s f e r m a y r e l y m o r e s i g n i f i c a n t l y o n t h e e x p r e s s e d m r n a s , a s c o m p a r e d w i t h g f p p r o t e i n a n d g f p g e n e . o u r s t u d y d e m o n s t r a t e d w i t h e x p e r i m e n t a l d a t a , s u p p o r t i n g t h e r e c o m b i n a n t s . c e r e v i s i a e c a n b e u s e f u l i n g e n e t h e r a p y d e l i v e r y c a r r i e r s , p r o m o t e e x p r e s s e d f u n c t i o n a l g e n e s i n v i v o . t h e e x p e r i m e n t a l r e s u l t s m a y s h e d l i g h t o n f u r t h e r i n i t i a t i v e s e s t a b l i s h i n g n e w n d g t e c h n o l o g y p l a t f o r m. k e y w o r d s : g e n e t h e r a p y , d i g e s t i v e t r a c t r o u t e , g e n e d e l i v e r y v e h i c l e , s . c e r e v i s i a e , gf p 双 华南理工大学 学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研 究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文 不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写的成果作品。对本文的研 究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完 全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作 者 签 名 : 7 下 ， 日期:) 4 a ; 年 ; 月 多 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版， 允许论文被查阅和借阅。本人授权华南理工大学可以将本学位论文的 全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密口，在 - 一 多解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密口。 ( 请在以上相应方框内打 “, / ) 作者签名: 7 4 17 ” 师 签 “ :b n 日 期 ，” 。 年 月夕 日 日 期 : a . 3 月 7 日 英文缩写i 4表 英文缩写词表 英文缩写 aa al a , a a m p a r g , r a s p , d c y s , c dab dms o dna dt t eb e dt a e li s a g g l y , g 卜 g hi s , h h r huve c i l e a ka n a k b kda l lb l e u , i l y s , k ma me t , m mg m i n 英文全称 a mi n o a c i d a l a mi n e a m p i c i l l i n a r g t mn e a s p a r t i c a c i d c y s t e i n e s - d i a m i n o b e n z i d i n e t e t r a h y d r o n a t e ( c h 3 ) 2 s o d i m e t h y l s u l f o x i d d i t h y l r i b o n u c l e i c a c i d di t h i o t h e i t o l e t h i d i u m b r o mi d e e t h y l e n e d i a mi n e t e t r a a c e t i c a c i d e n z y m e - l i n k e d i m m u n s o r b e n t g r a m g l y c i n e mi c r o g r a m h i s t i d i n e h o u r h u ma n u mb i l i c a l v e i n e n d o t h e l i a l c e l l i s o l e u c i n e k a n a m y c i n k i l o b a s e s k i l d a l t o n l i t e r l u r i a - b e r t a n i me d i u m l e u c i n e l y s i n e m i l l i a mp e r e me t h i o n i n e m i l l i g r a m mi n u t e 中文全称 氨基酸 丙氨酸 氨节青霉素 精氨酸 天冬氨酸 半脆氨酸 联苯二胺 二甲基亚飒 脱氧核糖核酸 二琉基苏糖醇 滨化乙锭 乙二胺四乙酸 酶联免疫反应 克 甘氨酸 微克 组氨酸 小时 人胚胎脐静脉内皮细胞 异亮氨酸 卡那霉素 碱基数 千道尔顿 升 l b培养基 亮氨酸 赖氨酸 毫安 蛋氨酸 毫克 分钟 x1 t 华南理工大学工学博士学位论文 ml m w od op d p bs p cr p e g p h p r o , p r p m s ds s e c s e r , s s - 2 0 0 g- 2 5 t tbs tr i s t r p , t y r , v mi l l i me t e r m o l e c u l a r w e i g h t o p t i c a l d e n s i t y o - p h e n y l e n e d i a m i n e p h o s p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n p o l y e t h y l e n e g l y c o l p o w e r o f h y d r o g e n p r o l i n e r o t o r p e r mi n u t e s a i u m d a e c y l s u l p h a t e s e c o n d s e r i n e s e p h a c r y l s - 2 0 0 h r s e p h a d e x g - 2 5 t r i s - b u f f e r e d s a l i n e t r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n t r y p t o p h a n t y r o s i n e v o l t 毫升 分子量 光密度值 邻苯二胺 p b s 缓冲液 多聚酶链反应 聚乙二醇 酸碱值 脯氨酸 转速/ 分钟 十二烷基磺酸钠 秒钟 丝氨酸 聚丙烯酞胺葡聚糖 葡聚糖凝胶 t r i s 缓冲液 三 ( 轻甲基)氨基甲烷 色氨酸 酪氨酸 电压 x2 1 1 第 一章绪 论 第一章绪论 2 0世纪 9 0年代，随着医学分子生物学及遗传学研究的深入，许多疾病的发 病机制在基因水平上得以阐明，从而导致基因治疗发展速度大大加快。人类基因 组研究计划的完成，各种有关分子生物学技术的日趋完善，使得基因治疗成为生 物学和临床科学领域里的热门研究课题之一，并为人类带来了全新的医学概念和 手 段 ，1，2 ，。 1 . 1 基因治疗及基因治疗药物 1 . 1 . 1基因治疗的概念与分类 基因治疗的本意是指将正常有功能的基因替代和修正缺陷基因，从而达到治 疗疾病的目的。随着研究的深入进行，基因治疗的概念及其探索应用的范围均己 被扩大。现在认为，凡是将新的遗传物质转移到某个体内并使其获得治疗效果的 方法均属于基因治疗川 。主要包括两方面，一是基因矫正或置换，即将基因的异 常序列进行校正和精确的原位修复，如囊性纤维变性、血友病的纂因治疗;二是 基因添加和增补 ( 亦称基因增强治疗) ， 即不去除异常基因， 而是通过有治疗意义 的外源基因作定点整合或导入，使得其表达正常产物以补偿缺陷基因的功能，如 调理性细胞因子基因等。 根据基因治疗靶细胞的不同，基因治疗可分为生殖细胞( g e r m c e l l s ) 基因治疗 和体细胞 ( s o m a t i c c e l l s )基因治疗。 生殖细胞基因治疗，是试图用正常基因导入有相应基因缺陷的性细胞以纠正 该缺陷基因。从理论上讲遗传病彻底的基因治疗靶向细胞应该是生殖细胞，这样 可以把正常基因遗传给子代，但在生殖的生物学机制尚未完全了解的情况下，一 旦发生差错将带来严重后果，且涉及伦理学问题，不易被人们所接受。 体细胞基因治疗，是把相应的功能基因导入病人的体细胞，使之合成出蛋白 质，由于该蛋白质的药理或生理功能的发挥， 而达到治疗疾病的目的。简单地讲， 可理解为无数的微型药厂 ( 基因 ) 建于体内。它在相当程度上淡化了经典遗传学 的概念。只要了解某种基因的功能，便可用于导入有此类功能缺陷的病人体内， 从而达到治病的目的。体细胞基因治疗，是当前基因治疗研究的主流。现今，一 般而言的基因治疗都是指体细胞水平上的基因治疗。尽管采用体细胞基因治疗只 能治愈被治疗的病人本身，而不能改变病人己有某基因或某些基因缺陷的遗传背 景。也就是说，如果是按孟德尔规律遗传的疾病，则其后代中亦必然要分离出有 此疾病的病人。但由于运用体细胞基因治疗具有良好的可操作性，因而在这一技 术路线下所进行的探索仍具有积极的意义41 。 就基因治疗的技术方法来讲，基因治疗可分为离体法 ( e x v i v o )和直接体内 华南理工大学工学博士学位论文 法 ( i n v i v o ) e i . e x v i v o ，即先分离和培养受体细胞，在体外将外源基因导入载体细胞，然后 将基因转染后的细胞回输给受者，使携有外源基因的载体细胞在体内表达治疗产 物以达到治疗目的。具体选择何种类型的细胞用于基因治疗，应根据疾病本身的 发病特点和位置、 选用的目的基因及其表达载体、 基因转染方式等具体情况而定。 ! n v i v o ，即将外源性基因直接导入受者体内有关的组织器官或细胞内以达到 治疗目的。如瘤体内注射、肌肉注射、静脉注射、器官内灌输、皮下包埋等。 另外，从基因治疗的原理和机制而言，基因治疗又包括抑癌基因治疗、反义 基因治疗、自杀基因治疗、共刺激分子基因治疗、核酸疫苗等b 1 . 1 . 2基因治疗药物 由基因治疗的方式可以看出，当采用间接体内法即离体法 ( e x v i v o )进行基 因治疗时，由于病人的体细胞是在体外被基因修饰后再输送回机体内，对于病人 来讲发挥疗效的直接物质是细胞。而采用直接体内法 ( i n v i v o )进行基因治疗， 目的基因通过改良的基因表达载体，像药物一样直接被送入在体内，此时，能够 有效表达并发挥治疗作用的基因被称为基因治疗药物川。 需要说明的是，基因治疗药物与核昔类药物不同” ，前者是以基因治病，实 际上指的是把功能基因导入病人体内使之表达，并因表达产物蛋白质发挥 了 功能以使疾病得以治疗。这就是说，用基因治病，实际上是用导入体内的基因的 产物一蛋白质来治病，而后者指的是用核普类化合物治疗疾病。 1 . 2基因治疗的发展及研究现状 1 9 8 9 年美国r o s e n b e r g 等经美国食品和药物管理局f d a批准， 进行了标志基 因转移到人体的首次临床试验, 5 名进行性转移的黑色素病患者接受了这项实验。 研究者们将n e o抗性基因转移到肿瘤浸润性的淋巴细胞中，再移植到晚期肿瘤患 者体内，以便跟踪这些细胞在癌症患者体内的分布情况。这虽然不能说是严格的 基因治疗临床试验， 但正是该项实施的成功， 使基因治疗逐渐普遍开展起来。 1 9 9 0 年 1 1 月美国n i h的b l e a s e , c u l v e r 和 a n d e r s o n 进行了首例人体基因治疗的临床 实验，并取得了巨大的成功。患者是一个4岁的腺奋脱氨酶 ( a d a) 缺乏症女孩， 工作人员通过反转录病毒将 a d a基因转移到取出的患者淋巴细胞中，而后再输 回患者体内，结果患者的免疫功能明显提高。 这是人类医学上的一次革命，由此， 全世界范围内掀起了基因治疗研究的热潮。截至 2 0 0 1 年 2月，世界范围内已有 5 3 2 个临床方案被实施，累计3 4 3 6 人接受了基因转移实验9 ) 1 . 2 . 1 多种疾病的基因治疗 第 一 章绪 论 目前，基因治疗的范围己从过去罕见的单基因疾病扩大至常见的单基因疾病 和多基因疾病。基因治疗不仅涉及遗传性疾病，而且涉及恶性肿瘤、心脑血管疾 病、自身免疫病、内分泌疾病、中枢神经系统疾病等多基因疾病以及传染性疾病 特别是爱滋病等 to 遗传性疾病的基因治疗 多数属于单基因缺陷所引起的疾病的基因治疗。主要 有血友病、免疫缺陷病如腺昔酸脱氨酶 ( a d a)缺陷症、尿素循环障碍如鸟氨酸 转氨甲酞酶 ( o t )缺陷症、血液疾病等。f a n g等以腺病毒为载体，靶向肝细胞 对苯丙氨酸轻化酶 ( p a h )缺陷症小鼠模型进行了研究，结果表明小鼠的伤寒表 型症状得到明显改善 川 。而 l i n等则通过反转录病毒转基因的方式，研究了典型 苯酮尿症状病童t 淋巴细胞中苯丙氨酸轻化酶 ( p a h)活性的改变状况似 、 恶性肿瘤的基因治疗己进行了大量的预备性实验，美国科学家构建了重组的 t i l ( 肿瘤浸润淋巴细胞 ) ， 能表达 1 4 0 倍于正常水平的t n f并应用于黑色素瘤的 临床治疗 1 3 , 14 1 。另外，用表达 i l - 2 . i f n - 2和 i l - i的t i l治疗神经母细胞瘤及白 血病等的研究工作也己见报道“ ” 。还有应用反转录病毒将毒素基因 ( 蓖麻毒素和 脊髓灰质炎病毒素中所含的一种蛋白酶的基因) 导入癌细胞内， 只在靶细胞内表达 毒素并发挥杀伤作用，但对其他细胞毒性较低【 ifi / 对于艾滋病等传染类基因疾病，s a n 等， 1, 1 用重组反转录病毒将 c d 4分子的基 因导入 c d 4 十 t淋巴细胞，试图抑制艾滋病病毒 h i v以获得细胞内的免疫效果。 类似的方法还被用于治疗人乳头瘤病毒、巨细胞病毒及肝炎病毒的感染。此外， 有研究表明，将一段酶序列基因插入受感染细胞，所表达的酶可催化无活性的药 物原体转化为有毒性作用的形式，从而选择性地杀伤受感染细胞以避免毒性对全 身的作用” 。 还有将编码可使艾滋病毒h i v r n a降解的核酶基因转染人淋巴细胞， 从而抑制 h i v的传播【 1 8 1 。又有研究 m 将 h i v l t r 3 . s 寡腺营酸合成酶杂合基因 转染 h e l a - t 4 + 细胞。结果表明:经修饰的带有 c d 4受体的细胞具有抗 h i v感染 的作用。 1 . 2 .2多种药物的基因治疗 随着对基因治疗机制本身的不断深入探讨，用于基因治疗的药物形式也不断 创新。基于三链 d n a形成脱氧寡核营酸 ( t f o) 的反基因技术能够通过阻止基因 转录和 d n a复制而达到治疗目的1 1 ) . c o h e n等【， ， ， 曾用此技术抑制淋巴瘤的 b c l - 2 基因，而n o o n b e r g 等2 2 1 以 此对乳腺癌的h e r 2 基因进行了 相应的探索。 基因治疗从传统意义上的 d n a治疗扩展至 r n a水平2 3 1 。反义寡核营酸经退 火形成特定的互补 m r n a序列，以阻滞转译并可能诱导 m r n a的降解。寡核昔 酸以体外或者体内的方式被引入靶细胞而抑制基因的表达。将抗 h b v聚-a信 号的 a s g f -缀合反义寡核营酸转染入稳定产生乙型肝炎的 h u h 7 肝癌细胞株， 剧 华南理工大学工学博士学位论文 烈阻滞病毒的表达(2 4 1 。 反义寡核昔酸也被用于肝炎动物模型( 鸭肝炎d h b v模型， 土拔鼠肝炎wh v模型) ，并证实能抑制病毒基因的表达12 5 1 。近来，有研究者为了 在细胞内大量产生核酶，构建了一种自我分裂的多聚体核酶。在细胞内产生许多 核酶拷贝， 裂解相应的病毒r n a ， 核酶对核酸酶攻击的抵抗力是通过合成与r n a 核酶类似的修改脱氧核糖核普酸来达成。这一 d n a 核糖核酸酶能有效地裂解 h b v r n a靶序列2 6 1 除此之外，有治疗作用的目的基因的m r n a也己用作体内、体外基因治疗的 研究12 7 1 。其出发点在于针对许多疾病尤其是肿瘤，当基因治疗的靶细胞为支气管 上皮细胞、肝细胞、血管内皮细胞以及肌肉细胞时，由于此类细胞通常是静止期 或有丝分裂后期细胞，其没有细胞循环过程中核膜上膜孔的形成，这就为 d n a 进入细胞核 ( 特别是以非病毒载体方式运送 d n a) 进行相应的转录带来困难，从 而影响最终目标蛋白质的翻译。甚至有研究不得不借助极端的方法，如部分肝脏 切除以刺激靶细胞的分化程度2 8 1采用mr n a为治疗基因物质，因为能够在胞质 中直接表达，从而避免了核膜造成的障碍。 n a i r , s . k等(2 4 1 从肿瘤细胞或活组织分 离出m r n a ，以其对自身提呈抗原的树突细胞进行转染，最终表达出了初始癌胚 抗原 ( c e a)- t淋巴细胞特异性细胞毒素。另外，由于m r n a种属间的通用性， 有利于不同来源的m r n a用于基因治疗。t h i e r r y b e t t i n g e r 等1 30 1 采用体外转录的 方式，以 g f p为报告基因，研究了 m r n a在人脐静脉内皮细胞 ( h u v e c) ,鼠 黑色素瘤细胞 b 1 6 - f 1 0 、人海拉细胞 ( 子宫颈癌组织细胞株 h e l a ) ,鼠成纤维细 胞r a t 1 等不同细胞系中的表达状况。 探讨了不同转染试剂对转染效果的影响，并 以蜂毒素肤介导并提高了m r n a的转染效率。 q i u p 等3 1 1 将完整的、 未降解的r n a 样品加到含有金微粒的0 . 2 5 m c a c l : 和 1 2 5 %p e g中， 最后制备成r n a金微粒的 1 0 0 %乙醇悬浮液。实验结果表明，在体外单层和悬浮培养的细胞、体内大鼠的肝 组织、小鼠的肝和表皮组织中，分别检测到三种报告基因的r n a转录本的表达。 经人al 抗胰蛋白酶mr n a的再次加强剂量的轰击后，可以产生连续、强烈的抗 体反应，从而证明了m r n a转染细胞并进行基因治疗的可行性。 1 . 2 . 3多种途径的基因治疗 在探讨不同疾病的发病机制、尝试不同基因药物，进行基因治疗的同时，有 研究者对基因治疗的新方法，新途径进行了大胆的探索。 一 种独 特的 技术 路线称为“ 生血 管的 移植物” ( v a s c u l a r i z i n g i m p l a n t ， 也叫 半生物体)的方法(8 1 。主要使用肝素结合生长因子一 1 ( h b g f - 1 ) ，将其吸附在胶原 蛋白上，经手术植入腹壁，生出血管，表达所携带基因的产物。该方法将可能用 于缺乏某种天然物质 ( 如第 v 工 i i因子 ) 的患者或需要持续释放某种治疗物质的 患者身上。其作用类似植入人工泵，但功能更多，生血管移植物还可由机体的自 第 一章绪 论 然机制进行维持。 斯坦福大学研究组采用转座子作为基因载体，在患有血友病的小鼠模型上， 将来自鱼的一种编码转座酶的基因与宿主染色体上的凝血因子 i x基因相连接， 使小鼠的血液凝结状况大大改善3 2 1 y i n 等3 3 1 采用电转化的方式， 将人胰岛素前体裸 d n a直接转入了链丝菌素介 导的糖尿病小鼠模型的骨骼肌细胞，而h i d e k i 等3 4 1将表达人胰岛素的组织培养细 胞植入患糖尿病小鼠的腹腔内，结果植入的细胞存活并分泌胰岛素，使小鼠血糖 水平明显下降。 美国科学家0 5 3 使用两头带气囊的导管，将携带半乳糖昔酶基因的重组反转录 病毒载体 或使用脂质体包装该基因) ，经手术转染 1 0头猪的动脉内壁，结果仅 在动脉内壁转染部位的内皮细胞中有 0 一 半乳糖普酶的表达，时间长达 1 0日至 2 1 周， 而猪的其他脏器无此酶的表达。 这一方法对于将 t p a 等植入动脉壁以防治 栓塞可能有重要意义。 也有研究者开始尝试通过直接注射的方式将质粒 d n a送入体内，从而获得 基因表达。k u s a k a b e等3 6 1 将脂质体包裹的d n a疫苗和 i l - 1 2及 g m- c s p表达质 粒共同进行鼻内接种，结果表明:能够诱导高水平的h i v特异的 c t l反应，并 且其介导的迟发型超敏反应的强度也开始增加。另有报道将基因序列经多种磷酸 钙沉淀后，直接注射到新生大鼠腹腔内，使目的基因获得表达(3 1 1赵连三等3 8 1 将 h b v表面抗原主蛋白 ( h b s a g )编码基因s 插