（食品科学专业论文）超高压处理对猕猴桃果汁杀菌钝酶效果和品质的影响.pdf

摘要 摘要 选用热敏性果汁猕猴桃果汁为超高压处理对象，以温度、压力和时间为超高压 处理参数，对猕猴桃果汁的超高压处理杀菌钝酶效果和品质变化进行研究。 以菌落总数、霉菌酵母菌为指标，研究微生物在超高压处理后的变化规律，发现菌 落数随着压力的升高呈明显下降趋势，3 0 、4 0 0m p a 压力下猕猴桃果汁即可达到商业 无菌( g b l 9 2 9 7 2 0 0 3 ) ，说明超高压对细菌的致死效果显著。当协同处理温度为5 0 时， 经处理的猕猴桃果汁样品在4 贮藏3 0d 后，仍然满足商业无菌要求。 设计j 下交实验优化猕猴桃中过氧化物酶的提取工艺条件，最终提取工艺条件为缓冲 液p h 值7 5 、缓冲液浓度0 0 5m o l l 、n a c i 浓度1 0m o 儿、p v p p 添加量2 。 研究不同温度不同保压时间下压力对猕猴桃中过氧化物酶活力影响趋势，发现压力 对过氧化物酶活力有显著影响，较明显的失活过程主要发生在4 0 0m p a 以上的较高压力 处理阶段。钝化酶的效果随温度升高而明显增加。随着时间延长，酶活的降低就越明显。 但在1 5m i n 以后，下降趋势渐缓。部分条件超高压处理后出现过氧化物酶活力反弹现 象。真实的食品体系中复杂的食品成分对于过氧化物酶的酶活具有一定的保护作用。 采用响应面分析和支持向量回归分析方法建立了猕猴桃过氧化物酶的超高压钝化 动力学模型。经由响应面回归分析，采用b o x b e h n k e n 设计方法，对压力、温度和时间 三个因素分别以x l 、x 2 、x 3 表示，并以+ 1 、0 、一1 分别代表自变量的高、中、低水平， 得到相对残余酶活a t ( y ) 标准回归方程为：y = 0 。9 0 0 1 5 a 0 1 7 b 0 0 5 6 c 0 0 8 6 a 2 0 0 7 5 8 2 - 0 0 2 3 c 2 - 0 0 2 2 a b 0 0 2 5 a c 0 0 2 7 b c 。采用支持向量回归分析方法，使用m a t l a b 7 0 软件，以压力、时间、温度作x 轴归一化处理，以相对残留酶活为y 轴，得到x y 关系图。对响应面法和支持向量回归分析方法进行比较，发现，由于两种方法拟合极限 状态方程都存在偏差，故两种方法不可能得到精确解。但是结果误差较小，并且响应面 法的计算效率较高。但支持向量回归预测值更符合实际测试值，且其泛化适用能力要远 比响应面法好。在对超高压处理钝化过氧化物酶进行预测时，可以将两者结合进行分析。 猕猴桃过氧化物酶的最适p h 范围在6 0 8 5 之间，这一范围之外，在偏酸和偏碱的 两侧均迅速下降。可能是由于猕猴桃中存在多种同工酶，且各个同工酶的最适p h 值不 同，从而产生了较宽的最适p h 范围。n a t i v e p a g e 电泳发现未处理过氧化物酶样品中 存在两条同工酶酶带，在较低压力处理后活性上升，并且出现新的同工酶；在较高压力 处理后，新酶带消失，活性有所抑制。由s d s p a g e 电泳分析可知，不同压力大小处理 后的过氧化物酶的s d s p a g e 电泳谱图没有发生显著的变化，说明超高压对酶蛋白分子 的亚基不能产生明显的影响。采用d e a es e p h a r o s ef a s tf l o w 离子交换色谱分离，得到 酸性过氧化物酶( 记为组分1 ) 和碱性过氧化物酶( 记为组分2 ) 。并进一步通过s u p e r d e x 7 5 凝胶过滤色谱分离，得到过氧化物酶同工酶p o di 和p o di i ( 纯度分别为9 9 9 3 和 9 3 3 7 ) 。过氧化物酶同工酶i 和i i 的最适p h 值分别为6 0 和7 5 。超高压处理后酶活 力随压力变化曲线也不相同，说明两者的高压稳定性不同，从而为两者结合表现出的过 氧化物酶活力在高压下的不规律变化提供了新的依据。并且，c d 谱也显示了其二级结 江南人学博十学位论文 构构象单元含量在压力处理后发生了不同的变化。 超高压处理能够较好的保存果汁原有的感官性质，能够保持猕猴桃果汁中的天然营 养成分( 还原糖、v c 、氨基酸等) 。温度和压力协同处理后，果汁的褐变减轻。且随着 贮藏时间的延长，各样品色泽a e 值之间的差距逐渐缩小。鲜榨猕猴桃果汁的主要挥发 性风味物质分别是2 己烯醛( 6 9 3 5 ) 和己醛( 1 1 2 3 ) ，鲜榨猕猴桃果汁的挥发性组 分中最主要的是醛类化合物( 8 5 1 3 9 ) 。超高压处理后，猕猴桃果汁中醛类化合物含量 有所提高，说明高压中温协同处理对猕猴桃风味有加强作用。 高压和热协同处理不仅改变了果汁中粒子的形态，同时影响了网状结构的形成，使 得大分子之间、颗粒之间、大分子和颗粒之白j 的相互作用发生了变化。猕猴桃果汁体系 符合h e r s c h e l b u l k l e y 方程，表现出非牛顿流体特性。未经超高压处理的猕猴桃果汁， 属于假塑性流体。在经超高压处理后，逐渐显示出触变性，在高于4 0 0m p a 压力处理后 产生了触变环。动态流变特性研究表明，压力处理对于猕猴桃果汁体系有明显的增加黏 性并降低弹性的作用。同时，处理温度也会影响高压处理对猕猴桃果汁流变特性作用的 效果。猕猴桃果汁中的大分子在经过压力温度协同处理后，同时存在聚合和解聚两种现 象。升高温度可以加速以上两个过程。 关键词：超高压猕猴桃杀菌钝酶品质 i l a b s t r a c t a b s t r a c t t h ee f f e c t so fh i g hp r e s s u r ea n dh e a tt r e a t m e n t so ns t e r i l i z a t i o n ，e n z y m ei n a c t i v a t i o na n d q u a l i t yo f k i w i f r u i tj u i c ew e r ei n v e s t i g a t e d p r e s s u r el e v e l sr a n g i n gf r o m2 0 0t o6 0 0m p aa n d t e m p e r a t u r e sv a r y i n gf r o m10t o5 0 w e r ea p p l i e df o ru pt o3 0m i n r e s u l t ss h o wt h a tt o t a ln u m b e ro fb a c t e r i ad e c l i n e dw i t hp r e s s u r ea n dt e m p e r a t u r e i n c r e a s e da n da r r i v e dc o m m e r c i a la s e p s i su n d e r4 0 0m p aa t3 0 a f t e r3 0 一d a ys t o r a g e p e r i o da t4 ，k i w i f r u i tj u i c ew a ss t i l ls a f ew h i l e5 0 w a su s e da st r e a t e dt e m p e r a t u r e c o m b i n e dh i g hp r e s s u r et r e a t m e n t r e s u l t sr e v e a l e dt h a t ，a te a c ht e m p e r a t u r e ，a ni n c r e a s ei np r e s s u r el e v e lr e s u l t si nad e c r e a s e o fe n z y m ea c t i v i t y p r e s s u r e sh i g h e rt h a n4 0 0m p ac o u l db ec o m b i n e dw i t hm i l dh e a t ( 0 0 5 ) u n d e r t r e a t m e n ta t2 0 0m p af r o m10t o2 0m i n ，w h e r e a sa t4 0 0a n d6 0 0m p a , t h ea c t i v i t yd e c r e a s e d w i t hr e g a r dt ot h a to b s e r v e da t2 0 0m p a p o da c t i v i t ya t3 0 w a sh i g h e ra f t e rt r e a t m e n ta t 2 0 0m p af o r15r a i na n dt h ea c t i v i t yd e c r e a s e df o l l o w i n gl o n g e re x p o s u r et i m ei n t e r v a l s t h es l o p eo fp o di nk i w i f r u i tj u i c ea t3 0 w a ss l i 曲t l yd e c r e a s e dc o m p a r e dw i t ht h a ti na m o d e ls y s t e m r e a lf o o ds y s t e m ss h o wap r o t e c t i v ee f f e c to ff o o di n g r e d i e n t sa tp r e s s u r e s a p p l i e df o rp o d i n a c t i v a t i o n e f f e c to ft h r e em a i nf a c t o r s ( p r e s s u r e ，t e m p e r a t u r ea n d t i m e ) i n l l i g hp r e s s u r et r e a t m e n tw a si n v e s t i g a t e d ，a n da l le x p e r i m e n t sw e r ed e s i g n e dw i t hr s ma n d s v m p o l y a c r y l a r n i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ( n a t i v ep a g e ) a n da c t i v i t yd e t e c t i o nw e r ec a r r i e do u t o nt h ep a r t i a l l yp u r i f i e de n z y m eb e f o r ea n da f t e rt r e a t m e n t a tt h eb e g i n n i n g ，t w os m i n i n g b a n d sw e r eo b s e r v e do nt h eu n t r e a t e de n z y m e 1 1 1 i s s u g g e s t e dt h a tt h e r em a yb et w o i s o e n z y m e s a f t e r15m i no ft r e a t m e n ta t2 0 0m p aa t3 0 an e wb a n dw a so b s e r v e d a i l b o n d sd i s a p p e a r e da sp r e s s u r ei n c r e a s e da t6 0 0m p a p u r i f i e dp o di s o e n y m eia n di i c h a n g e dd i f f e r e n t l y a f t e rh i g hp r e s s u r e f r o mt h i so b s e r v a t i o n ，t h e r em a yb es e v e r a l i s o e n z y m e st h a th a v ed i f f e r e n tr e s i s t a n c et oh i 曲p r e s s u r e s t h e r ew e r en os i g n i f i c a n td i f f e r e n c eo np h ，b r i xa n dc o n d u c t i v i t ya f t e rt r e a t m e n t ，w h i l e l i t t l ed i f f e r e n c eo nc o n t e n to fv c ，a m i n oa c i da n dc o l o r a n dt h ee f f e c to fp r e s s u r ei sl e s st h a n t e m p e r a t u r e t h em a i na r o m a t i cc o m p o u n d so fk i w i f r u i tj u i c ew a s2 - h e x e n a l ( 6 9 3 5 ) a n d h e x a n a l ( 11 2 3 ) a n dt h em a i nc o m p o n e n tw a sa l d e h y d ec o m p o u n d s ( 8 5 13 9 ) n l eh i 曲 p r e s s u r et r e a t m e n te n h a n c e dt h ef l a v o r so fk i w i f r u i tj u i c es i n c et h ea l d e h y d ec o n t e n t s i n c r e a s e da f t e rt r e a t m e n t 1 1 1 江南人学博+ 学位论文 t h ee f f e c to fh i g hp r e s s u r et r e a t m e n to nr h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so fk i w i f r u i tj u i c ew a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t ss h o wt h a tk i w i f r u i tju i c es a m p l e sb e h a v e d l i k ep e s u d o p l a s t i c n o n - n e w t o n i a nf l u i d sa n dw e r ec o i n c i d e n tw i t hh e r s c h e l b u l k l e ym o d e lu n d e ra l lc o n d i t i o n s k i w i f r u i tj u i c ed i s p l a y e dt h i x o t r o p yw h e np r e s s u r eu pt o4 0 0m p a t h ev a l u eo fg ”i n c r e a s e d w h i l eg d e c r e a s e da f t e rh i g hp r e s s u r et r e a t m e n t ，w h i c hi n d i c a t e dt h ee n h a n c e m e n to f v i s c o s i t ya n dr e d u c eo ff l e x i b i l i t y a n dt h ed i f f e r e n c ea f f e c t e dt h er h e o l o g i c a lp r o p e r t i e so f k i w i f r u i tj u i c ea f t e rh i g hp r e s s u r et r e a t m e n t t h ep a r t i c l es i z ed i s t r i b u t i o no fk i w i f r u i tj u i c e w a sc h a n g e da f t e rh i g hp r e s s u r et r e a t m e n t k e y w o r d s ：h i g hp r e s s u r e ，k i w i f r u i t ，s t e r i l i z a t i o n ，e n z y m ei n a c t i v a t i o n ，q u a l i t y i v 独创，陛声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注乖致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名：植 日 期： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名： 导师签名： 日期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1 超高压加工技术的概念与分类 1 1 1 超高压加工技术的概念 超高压加工技术( u l t r ah i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n g ，u h p p ) ，可简称为高压加工技术 ( h i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n g ，h p ) ，或者静水压技术( h i g hh y d r o s t a t i cp r e s s u r e ，h h p ) 。 食品超高压技术就是将食品原料包装后密封于超高压容器中( 通常以水或者其他流 体介质作为压力传递的介质) ，在高静水压( 一般不小于1 0 0m p a ，常用的压力范围是 1 0 0 一1 0 0 0 m p a ) 和一定的温度( 通常为常温或较低温度) 下加工适当的时间，使食品 中的酶、蛋白质和淀粉等生物大分子改变活性、变性或糊化，同时杀灭细菌等微生物， 以达到杀菌、钝酶和改善食品功能性质的一种新型食品加工技术【卜2 】。 1 1 2 超高压加工技术的发展历史 超高压技术可追溯到1 8 世纪，在1 8 世纪末，p e r k i n s 进行了一项实验，用来确定水 的可压缩系数。在这项实验中，他采用了一个火炮炮筒作为压力容器，实验时的压力达 到了2 0 0 m p a 。 在1 8 6 9 年到1 8 9 4 年期间，a m a g a t 和c a i l l e t e 进行了一系列的超高压技术的研究， 这些工作奠定了超高压技术的科学研究基础，他们所做实验的压力是3 0 0m p a 。1 8 8 4 年， c e r t e s ，r e g n a r ，e i s c h e r 等人研究确认了超高压力下深海中有各种各样生存的微生物。 1 8 8 7 年，g e o l o g es p r i n g 在研究早期地下矿物的形成过程中，所进行的实验压力为6 0 0 m p a 。1 8 9 9 年，当时美国化学家首次发现的超高压能延长牛奶的保存期。1 9 1 4 年，美 国物理学家e w b r i d g m a n 提出蛋白质在5 0 0m p a 下凝固，在7 0 0m p a 下变成硬的凝胶 状【3 】。1 9 世纪后半叶，开发了能产生1 0 0 - 3 0 0m p 压力的水压机，并应用到了科学领域中。 1 8 9 7 年b u c h n e 利用水压机加压处理的酵母压榨液中发现了细胞内的物质，宣告了物理化 学的开始。而开创现代超高压技术研究先河的则是美国物理学家p w b f i d g m a n ，他于 1 9 0 6 年对固体压缩性、熔化现象、力学性质、相变、电阻变化等宏观物理行为的超高压 效应进行系统研究。1 9 1 2 年b r i d g m a n 报告了超高压下的水的状态图，确立了超高压物 理学，1 9 1 4 年报告了超高压力下的卵白的凝固现象。这样，超高压的研究，在物理学、 物理化学、海洋微生物之类的广泛领域中被推进并发展起来。 随着人们对超高压技术了解的深入，超高压技术在食品工业中的应用也越来越广 泛。1 8 9 9 年化学家美国b e r t 、h i t e 就证明了牛奶、果蔬和其他食品和饮料中的微生物对 压力敏感【4 巧j ，并证明高压处理能延长食品的货架期；物理学家b r i d g m e n 从1 9 0 6 年开 始对物质的宏观物理行为的高压效应进行了系统的研究【3 】；2 0 世纪5 0 年代j o h n s o n 发 江南人学博十学位论文 现麻醉后的蝌蚪经大约l o m p a 的压力处理后可以复苏1 6 7 】。超高压技术作为能确保高质 量食品生产的非热保臧技术已被关注、研究了很多年。但由于超高压技术上的难题，这 一研究成果并没有被实际应用。直到1 9 8 6 年，同本京都大学林立丸教授提出超高压在 食品工业上的应用，并使超高压技术成为一种可行的商业加工手段，于1 9 9 0 年，丌发 了世界第一高压食品果酱1 8 1 ；除r 本外，美国、巴西、韩国和欧洲的许多国家都先 后对高压食品加工原理、方法和技术细节及应用前景进行了广泛的研究，研究的深度和 广度不断扩大，并已丌始向市场提供高压食品；在欧洲，法国是第一个将高压食品商业 化的欧洲国家，开发了水果和熟食等高压产品。我国许多学者也注意到国外超高压农产 品的发展趋势，国内许多单位丌展了食品高压技术的研究，己取得不少的成果。 1 1 3 超高1 压h a _ t - 技术的原理 超高压加工是一个物理过程，高压处理过程中，物料在液体介质中体积被压缩，超 高压产生的极高的静压不仅会影响细胞的形态，还能使形成的生物高分子立体结构的氢 键、离子键和疏水键等非共价键发生变化，使蛋白质凝固、淀粉等变性，酶失活或激活， 细菌等微生物被杀死，也可用来改善食品的组织结构或生成新型食品【9 , 1 0 】。 在这一加工过程中遵循下列两个基本原理： 第一个原理是l ec h a t e l i e r 原理【l 。l ec h a t e l i e r 原理是指反应平衡将朝着减小系统 外加作用力影响的方向移动。这意味着超高压处理将促使反应朝着体积减小的方向移 动，包括化学反应平衡以及分子构象的可能变化。 第二个原理是帕斯卡原理。它对于理解超高压的影响非常重要，根据帕斯卡原理， 在食品超高压加工过程中，液体压力可以瞬间均匀地传递到整个样品。帕斯卡原理的应 用与样品的尺寸和体积无关，这也表明在超高压加工过程中，整个食品样品将受到均一 的处理，压力传递速度快，不存在压力梯度，这不仅使得超高压处理过程较为简单，而 且能耗也较少。而热处理为了达到样品中心预定的温度，将可能导致加热点和表面的过 热。 食品主要是由蛋白质、淀粉、脂质、酶、核酸、水分等组成的多种物质的立体结构。 在超高压下，食品中的小分子( 如水分子) 之间的距离要缩小，而蛋白质等大分子组成 的物质还仍保持球状，这时水分子等小分子就要产生渗透和填充效果，进入并黏附在蛋 白质等大分子集团内的氨基酸周围，使蛋白质等的食品中生物大分子链在加工压力下， 由超高压降为常压后被拉长，而导致其全部或部分立体结构被破坏，这样便改变了蛋白 质的性质( 简称为“变性”) 。超高压同样能导致酶全部或部分立体结构被破坏，这样便 使酶失去活性( 简称为“失活”) 。 微生物也是由蛋白质组成的，由于在超高压下蛋白质会变性，致使微生物内部组织 被破坏而死亡，另外，在超高压下，食品中某些物质的分子会穿透组成微生物的细胞膜， 可致使微生物的细胞膜遭受损坏，甚至被彻底破坏，因此，这就可以达到灭菌消毒的作 用( 简称为“灭菌”) 。 2 第一章绪论 超高压对细菌孢子的影响主要是在压力被释放的瞬间，此时被加压的液体以极高的 绝热速率运动，对细胞组织产生很大的冲击。根据这种观点，加压与卸压不断交替进行 对孢子的杀灭效果远比纯粹的超高压处理并辅以适当加热或延长保压时问要好的多。 此外，食品中的糖类、盐粒子浓度、含水量、食物组分和p h 等因素都不同程度的 影响微生物的生存繁殖，所以高压与其中的一些条件如p h 值、温度、化学添加剂和气 调等适当结合起来可以获得更好的灭菌效果，特别是对于孢子的杀灭，同时，这样也可 以获得更好的保质保鲜效果。 1 1 4 超高压加工技术的特点 u h p 处理基本上是一种物理过程，其主要特蒯1 2 j ： ( 1 ) 超高压处理最大程度地保留了食品的风味和营养成分( 表1 1 ) 。超高压处理不 会破坏食品色、香、味等风味成分，处理后食品仍保持原有的生鲜风味和营养成分。 ( 2 ) 超高压处理后，蛋白质的变性及淀粉的糊化状态与加热处理有所不同，从而可 以获得新型物性的食品。 ( 3 ) 超高压处理可用于半调理食品加工。超高压处理可以保持食品的原有风味，为冷 杀菌，这种食品可简单加热后食用，有利于扩大半调理食品市场。 ( 4 ) 超高压处理安全性好，能耗少。超高压处理只是液体的压缩过程，安全可靠； 达到一定压力后，保持压力无需再提供能量，因而能量消耗少。 ( 5 ) 超高压食品处理技术适用范围广( 见表1 2 ) ，具有很好的开发推广前景。 因此，超高压食品加工技术以其独特的领先优势在食品各领域中保持了良好的发展 势头。 表i - i 超高压法与加热法的比较 t a b i - ic o m p a r i s o nb e t w e e nm e t h o d so fh i g hp r e s s u r ea n dh e a t m i n gt r e a t m e n t 江南人学博十学位论文 表1 - 2 超高压处理技术的应用方面及实例 t a b 1 - 2a p p l i c a t i o n so fu l t r ah i g hp r e s s u r ep r o c e s s i n ga n de x a m p l e s 应川方面实例 食品的杀菌和灭酶 蛋白质改性 淀粉改性 脂质改性 高压速冻 控制反应 其他 果蔬汁的低温杀菌、灭酶 1 3 - 1 5 】，果酱1 6 , 1 7 】、乳制品【1 8 】、啤酒【1 9 】、 海产品1 2 0 】等的灭菌。 肉质嫩化川或改善肉蛋白的凝胶性【2 2 1 陈米改良【2 3 】 巧克力加j l ：【2 4 1 豆腐【2 5 】、蔬菜和肉制品的速冻 控制美拉德褐变反应【2 8 】， 加速水解反应【2 9 3 0 1 等 有机成分的提取【3 、杀灭病毒【3 2 1 、天然产物有效成分提取等 1 1 5 超高压加工设备简介 同本在高压设备的制造方面居世界领先地位。制造高压设备的主要同本公司是k o b e 钢铁公司和同立制铁公司。用于食品加工的第一台高压设备是有三菱重工( r 本东京) 制造的。该公司生产的高压容器的容积为0 6 2 1 0l ，最高工作压力为4 0 0 7 0 0m p a 。一 般来说，减少高压容器的容积，可以提高其最大工作压力。 超高压装置的主要部分是高压容器和加减压装置，其次是一些辅助设施。超高压装 置的特点是承受的压力高( 1 0 0 1 0 0 0m p a ) ，循环载荷次数多( 连续工作，通常为2 5 次1 1 ) ， 因此超高压容器设计必须要求容器及密封结构材质有足够的力学强度、高的断裂韧性、 低的回火脆性和时效脆性、一定的抗应力腐蚀及腐蚀疲劳性能、效率性；可快装快拆、 密封效果好；高压容器是整个装置的核心，工作条件苛刻，要求严格，为保证安全生产 其容积不宜过大，一般为1 5 0l 。 密封问题是超高压容器设计所考虑的关键问题。超高压容器的密封结构是整个超高 压设备的一个重要组成部分，食品加压装置的有效运行取决于密封结构的合理设计。根 据食品加工的特点要求密封结构具有快装快拆、快启、次数频繁、密封可靠、装拆维护 方便等特点。密封结构可分三类：强制密封、半自紧密封和自紧密封。由于前二种密封 需要很大的预紧力且结构笨重，因此超高压密封现多采用自紧密封【3 4 1 。 4 第一章绪论 1 2 超高压杀菌研究进展 1 2 1 超高压杀菌机理 超高压灭菌的基本原理就是压力对微生物的致死作用，超高压导致微生物的形态结 构、生物化学反应、基因机制以及细胞壁膜发生多方面的变化，从而影响微生物原有的 生理活动机能，甚至使微生物原有功能破坏或发生不可逆变化1 35 。极高的静压会改变细 胞的形裂珀j ，包括细胞外形变长、胞壁脱离细胞质膜、无膜结构细胞壁变厚。高压对细 胞膜、细胞壁都有影响，在压力作用下，细胞膜双层结构的容积随着每一磷脂分子横切 面积的缩小而收缩。3 0 0 4 0 0m p a 下，啤酒酵母的核膜和线粒体外膜受至破坏，加压的 细胞膜常常表现出通透性的变化，压力引起的细胞膜功能劣化将导致氨基酸摄取受抑 制。2 0 4 0m p a 的压力能使较大的细胞因受应力作用细胞壁机械断裂而松解，2 0 0m p a 的压力下，细胞壁遭到破坏。 1 2 2 超高压杀茵研究进展 研究发现，酵母菌、霉菌的耐压性比革兰氏阴性菌的耐压性要低，而革兰氏阴性菌 耐压性又比革兰氏阳性菌的耐压性要低【3 7 - 3 9 1 。病毒一般在很高的压力下才能灭活。芽抱 相对比较耐压，尤其是革兰氏阳性菌中的芽抱杆菌属和梭状芽抱杆菌属的芽孢最为耐 压。对一般微生物的营养细胞，通常只需室温、4 5 0m p a 以下的压力，而杀死芽孢则要 相应提高压力和压力处理时间或结合其他处理方式才能实现【4 0 小】。 影响微生物的耐压性还与其化学组分和食品组成有关【4 5 舶】。研究发现，细菌在蛋白 质和盐分浓度高时，其耐压性高，并随营养成分丰富耐压性有增高的趋势( 如大肠杆菌 和葡萄球菌随着食盐浓度上升其灭菌效果下降) 。一般来说，蛋白质和油脂含量高的食 品灭菌效果差。加压的压力越高，则需加压处理的时间就越短。加压的时间越长，则处 理的效果越好。 1 3 超高压钝酶研究进展 酶是一种特殊的蛋白质，超高压对酶蛋白的结构( 构象) 的改变或破坏肯定会影响 到酶的活性。在应用到饮料、水果、肉类以及乳品的加工中时，主要利用高压介质( 一 般为水) 的高挤压力作用，杀灭食品中的微生物，钝化酶或使其部分失活，从而延长食 品的贮藏期，并保持食品中原有营养成分与风味。但是，前人研究发现超高压虽然有钝 化酶的作用，但效果不如热加工法，有时采用很高的压力也不能使一些耐压酶如过氧化 物酶、多酚氧化酶等完全失活，导致加工食品在贮藏过程中产生酶促变质；较低压力下， 有时还会出现酶活上升的现象，食品变质更快。这些问题已逐渐引起人们的重视并开展 了一系列的研究【4 。 江南人学博十学位论文 1 3 1 超高压钝酶的作用机理 超高压对酶的作用效果可分两方面【4 8 】：( 1 ) 较低的压力能激活一些酶；( 2 ) 非常高的 压力可导致酶失活。 超高压对酶活性的影响主要是通过改变酶与底物的构象与性质而起作用的【4 乒5 0 】。研 究者从不同的角度进行了探讨，有人用锁和钥匙的关系来解释超高压对酶促反应的影 响，认为超高压处理使酶和底物的分子构象发生改变最后的导致酶促反应的变化，这些 变化有的是促进酶促反应，也有的是抑制催化反应。酶的生物活性产生于活性中心，活 性中心是由分子的三维结构产生的，即使是一个微小的变化也能导致活力丧失，并改变 酶的功能性质。蛋白质的二级和三级结构的改变与体积变化有关，因此会受到高压的影 响。一般来说，超高压对蛋白质的一级结构没有影响，对二级结构有稳定作用，对三级、 四级结构影响较大。超高压处理可以引起蛋白质的变性，即超高压对维持酶空间结构的 盐键、氢键、疏水键等起破坏作用。肽键伸展成不规则线状多肽，活性部位不复存在， 酶也就失去了催化活性，即酶失活的机理是超高压对酶蛋白高分子的次级键的破坏作用 【5 l - 5 5 】 0 除构型变化，酶激活主要是由于压力产生的凝聚作用。在完整的组织中酶和基质经 常被隔离开，应用较低的高压可以破坏这种隔离，使膜破坏而使酶和基质相互接触，这 种相互接触引起的酶反应可被压力加速或减速，这取决于酶催化反应得反应容积。超高 压有利于体积减小的反应而抑制体积增加反应得发生【5 6 1 。 超高压对酶的活力的抑制是一个渐变的过程，每种酶都存在最低失活压力，低于这 个压力，酶的活性中心结构可逆恢复，酶活力不受影响；当压力超过这个值时( 在特定 时间内) 酶失活速度会加速直到完全失活。 1 3 2 超高压作用下酶的失活类型和影响因素 酶在不同条件下失活情况不一样。m i y a y u a n 7 】等根据酶活性的损失和恢复，将酶的 压力失活模式分为4 类：( 1 ) 完全不可逆失活；( 2 ) 完全可逆失活；( 3 ) 不完全可逆失 活；( 4 ) 不完全不可逆失活。酶在高压处理过程中具体以何种形式发生变化则受到到多 种因素的影响。 超高压作用下影响酶活变化的因素主要有三类 4 9 , 5 0 , 5 8 - 6 0 】：( 1 ) 超高压作用因素，包 括压力值、加压时间以及加压方式( 连续加压、间歇加压) ；( 2 ) 酶自身因素，包括 酶的种类和来源； ( 3 ) 协同因素，包括酶所处介质的温度、p h 值以及介质内所含的物 质。 b a s a l 5 9 1 和r a s t o g i 【6 0 l 研究认为，由于不同的食品具有不同的p h 值、化学成分，不 仅同种酶字不同食品中所表现的耐压特性有很大差异，而且食品原料中天然酶与接种的 同种酶的耐压能力都有很大差别。采用商品酶或纯酶在选择基质上进行研究具有明显的 局限性，与食品中自生酶( 内源酶) 的超高压特性有很大的区别。 对于一些酶又存在一个最高压力，比它更高的压力，并不会导致额外酶的失活，一 6 第一章绪论 般认为是出酶的一小部分不可逆失活而转化为非常耐压的部分，当压力解除后耐压的一 部分恢复原来状态，而不可逆失活的保持不变。已有研究表明，应用循环压力处理可以 改善酶的失活，即经过多次超高压处理与相同时间长度的一次性超高压处理酶所保持的 活力要低。 1 3 3 超高压钝酶研究现状 食品中几种常见的酶的耐压性从大至u i j , 的顺序一次为：过氧化物酶、多酚氧化酶、 过氧化氢酶、磷酸酯酶、脂酶。果胶酯酶、乳过氧化物酶和脂肪氧化酶。研究发现过氧 化物酶显示出最高的耐压性，可作为超高压加工的指标酶。表1 3 总结了近年过氧化物 酶高压失活的研究结果。 表1 - 3 超高压作用下过氧化物酶酶活的变化 t a b 1 - 3c h a n g e so fp o da f t e rh i g hp r e s s u r et r e a t m e n t 7 江南人学博十学何论文 1 3 4 超高压钝酶动力学研究 根据前人的研究成果，恒温和恒压条件下，酶灭活时问可以分为第n 级，第l 级和部 分转化动力学模型，温度和压力的确定取决于失活速率常数 7 0 】。如下为温度压力灭活 酶的动力学模型： 第n 级失活模型a = 【+ ( n - 1 ) k t 巾 第1 级失活模型a a o e x p ( k t ) 部分转化模型a = a o o + ( a o + a 。) e x p ( 一k t ) 取决于压力的k 值： e y f i n g 理论：k = k a t m e x p - v a ( p - p 陀f 瓜t ) 】 取决于温度的k 值： a r r h e n i u s 理论：k = k ，e e e x p - e 。( 1 t 一1 厂r r e f ) r 】 式中：a _ t 时问内酶活力； a 旷- 0 时刻酶活力； a 。平衡时酶浓度； e a 活化能( k j m 0 1 ) ； k 温度t 和压力p 的失活速率常数m i n 以( 假定n = 1 ) ； k 。协r 瑚度t 在大气压下的失活速率常数m i n 以( 假定n = 1 ) ； k 代r _ 压力p 和参照温度下的失活速率常数m i n _ ( 假定n = 1 ) ； n 反应级数； 卜时间( m i n ) ： p 一一压力( m p a ) ； 卜绝对温度( k ) ； p 陀r - 参照压力0 1 ( m p a ) ； t 化r - 绝对参考温度( k ) ： r 气体常数8 31 4 ( j m o l k ) ； v a 活化体积( c m 3 m 0 1 ) 近年来人们对于食品中品质酶在超高压下的动力学研究中发现，各类酶的高压灭活 模型主要符合一级反应动力学模型，且p l n ( a a o ) = k t ，恒温恒压下k 的获得均采用e 妒n g 模型和a r r h e n i u s 模型【7 1 仍】。当k 值获得后，可以计算常用的两个工艺参数：d p ( 恒定压 力下，使酶活降低9 0 所需要的加压时间) ，z ( 包括z p ( 一定温度下，单位时间内使 酶活降低9 0 所需的压力值) 、z t ( 一定压力下，单位时间内使酶活降低9 0 所需的温 度值) ) 。因此，当食品中各类食品品质酶的超高压加工动力学模型被准确建立起来后， 对于指导生产及继后进一步的研究有着积极的作用。 8 第一章绪论 1 4 超高压技术在果蔬加工中应用 超高压技术在食品工业中最成功的应用就是果蔬产品的加工，主要用于该类产品的 杀菌作业。超高压加工技术的出现使果蔬加工产品质量更好、更安全、货架期更长。水 果加工过程中频繁使用高温会使产品产生烹调味，从而失去它们本身的质地、颜色和天 然的特性。b u t z 7 4 j 等人证明了高压处理不会使果蔬中的有益成分丢失。而采用超高压这 种非热力加工技术，即可给消费者提供几乎新鲜的水果产品又同时能钝化病原菌及酵 母。h o r i e 曾报道，经过超高压处理的草莓酱可保留9 5 的氨基酸，在口感和风味上明 显优于经加热处理的果酱【7 引。b o y t o n i 。7 6 】等人将切片芒果真空包装后，于3 0 0m p a 和6 0 0 m p a 处理后置于3 下贮藏，在贮藏期间鲜芒果的风味下降、异味增加，但色泽、质 构及其他感官指标基本没有变化，经9 周的贮藏后，微生物指标分别为1 0 2c f u m l 和 1 0 3c f u m l 。压力处理鲜芒果，风味只轻微降低，异味和甜度略有增加。潘见等发现在 温度为2 9 ，压力为3 5 0m p a 下，草莓汁中大肠菌群对压力非常敏感，保压3m i n 即 可全部杀灭；霉菌和酵母菌较大肠菌群耐压，压力为3 5 0m p a ，保压1 0m i n 可全部杀灭。 果汁中虽然含多种耐压菌，但经5 0 0m p a 保压处理，菌落总数还可降至3 0c f u m l ，达到 了国家食品卫生标准要求。而早在1 9 9 0 年4 月，只本就推出了不用加热的果浆，首次 作为加压食品出售。由于高压促进了果实、砂糖及果胶混合物的凝胶化，糖液向果肉内 浸透，并可同时灭菌。实际生产时，在室温下，加压到4 0 0 9 0 0m p a 的压力，保持1 0 3 0 m i n 即可得到这些产品。感官评价结果，加压处理的果浆比加热法味道更好【7 7 】。 一般鲜榨果汁是指新鲜水果经清洗榨汁后采用非热力巴氏杀菌处理，将致病菌至少 减少到5 个对数值以下，且在不添加防腐剂及一定贮藏条件保质期内产品质量，即色、 香、味和营养成分应保持完好的果汁才可称之为鲜榨果汁。 生产鲜榨果汁至少应具备4 个条件：( 1 ) 采用非热杀菌技术，如超高压、辐射、 紫外线、冷冻、高频超高压电场杀菌技术等；( 2 ) 控制酶活力及抑制残余微生物繁殖 生长的贮藏条件，一般酸性果汁采用0 5 贮藏即可控制过氧化物酶、果胶酶、多酚氧 化酶并抑制酵母和霉菌的生长；( 3 ) 无菌灌装技术或超净灌装技术；( 4 ) 快速的酶活 力和微生物检测及控制技术。 美国、同本等国已将超高压技术应用到鲜榨苹果汁、柑橘汁等的生产中，而目前国 内还没有实现真正意义上的鲜榨果蔬汁商业化生产，无论是冷灌装的果蔬汁，还是添加 防腐剂后冷藏的果蔬汁，都不能说是真正的“鲜榨”。 1 5 存在的问题 超高压食品加工技术的研究，是食品加工中一个崭新的研究领域。发达国家在这领 域的研究不断推向深入并已取得定成果。我国由于起步较晚，与国际水平相比，我国 在这方面还存在较大的差距。 9 江南人学博十学何论文 发达国家其研究的范围受西方饮食文化的影响，而对一些东方特有食品的超高压加 工则鲜有涉及。我国有着丰富的农产品资源，针对超高压技术在农产品加工中的应用也 进行了很多研究，取得了一定成果，然而，要走向工业化，尚待继续探索的课题众多， 例如： 1 ) 此前的大部分研究都集中于在特定基质上接种特定微生物和酶上。由于食品化 学成分千差万别，影响超高压处理效果，故需丌展针对实际食品中的内源微生物和内源 酶处理研究，以确定工艺技术的可行性； 2 ) 超高压杀菌和钝酶机理研究，多系借助相关学科知识的得出的推论，还不够深 入，无法对实验进行必要的指导，另一方面，对于不同品种食品超高压处理对其理化性 质的影响仍需要进行大量的研究； 3 ) 此前对于超高压果汁加工的研究还集中于单纯的高压作用下各参数的变化，对 于温度协同高压处理的作用以及超高压的影响机理