（食品科学专业论文）降胆固醇乳酸菌的研究.pdf

聱 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：隆盟固醒垩l 酸菌的婴究 本学位论文作者完全了解大连工业大学有关保留、使用学位论文的规 定，大连工业大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学 位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 足) ，保密期至2 ，咖年尹月2e l 为止。 学生签名：杰三左起导师签名：! 圭三三l ! 至 矽谚年少月上- e i 摘要 摘要 本研究主要以中国传统发酵食品为实验原料，从中筛选降胆固醇的益生乳酸菌，对 具有降胆固醇能力较高的乳酸菌进行定向诱导、模拟胃肠环境试验：对试验菌株进行菌 种鉴定和生物特性研究；小白鼠体内降血清胆固醇试验；研究了中草药对降胆固醇乳酸 菌生长的影响，添加最佳促生长中草药，进行降胆固醇发酵乳优化试验。 以改良k e n j i 培养基为选择性培养基进行乳酸菌筛选，初步获得降胆固醇的益生乳 酸菌共5 l 株，采用磷硫铁法测定乳酸菌的胆固醇降解能力，选取降胆固醇能力较强的 1 3 株乳酸菌，在k e n j i 发酵培养基中进行了降胆固醇的定向诱导试验，菌株的降胆固 醇能力提高2 3 - - 9 8 ，从中筛选出降胆固醇能力提高较大的菌株y s 0 9 、g l 0 2 、 z p - 0 4 、z p 0 5 、g l 0 3 、g l a a 、z p w 、y s 1 1 、z p z 进行模拟胃肠环境试验，筛选出 具有较好的耐酸、耐胆盐及对小肠上皮细胞粘附性、抑菌特性的乳酸菌。根据形态特征、 生理生化及多糖发酵试验进行菌株鉴定，菌株z p z 、z p 0 5 、z p w 菌为植物乳杆菌， 菌株g l - 0 3 为干酪乳杆菌干酪亚种，菌株y s 0 9 、y s 1 1 为嗜酸乳杆菌，菌株z p 0 4 为 短乳杆菌，菌株g l a a 和g l 一0 2 为鼠乳杆菌。 对降胆固醇效果最好的g l 0 3 菌株进行生物学特征研究，其最适生长温度为3 5 。c ， 最低生长温度为1 3 ，最高生长温度为4 6 ：其最适生长起始p h 为6 ，最低起始生长 p h 为3 6 ，最高起p h 为9 6 ；从其生长曲线上可以看出在m r s 液体培养基中，g l 0 3 在4 h 左右进入对数生长期，2 0 h 左右进入稳定期。并对g l 0 3 进行了3 0 天饲喂小白鼠 体内降低血清胆固醇的动物实验，灌胃组的血清t c 和t g 含量比高脂组显著降低，结 果表明其具有降低小鼠血清胆固醇功效。 在g l 0 3 菌株应用方面，作了降胆固醇中草药对其生长的影响和含中草药发酵乳的 发酵条件的研究，从1 6 种具有降胆固醇作用的中草药中，筛选出山楂为最佳生长促进 因子，通过正交实验和感官指标综合评价选出功能性含中草药的酸奶的最佳配方和发酵 条件为：蔗糖浓度6 ，发酵温度4 l ，山楂浓度1 ，g l 0 3 、保加利亚杆菌和嗜热链 球菌3 种菌混合的作为发酵菌种( 1 ：0 5 ：0 5 ) 。 关键词：降胆固醇乳酸菌，筛选、鉴定，定向诱导，模拟试验，动物试验，发酵乳 a b s t r a c t t h ep r e s e n ts t u d yw a su n d e r t a k e nt os c r e e nc h o l e s t e r o l r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sf r o m f e r m e n t e df o o do fc h i n a t h e s es c r e e n e dc h o l e s t e r o l - r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sw e r eu n d e r t a k e n s i m u l a t i o nt e s th u m a ng a d t r o i n t e s t i n a l ，i n d u c u m e n tt e s t ，c h o l e s t e r o lr e d u c i o ni n v i v o ， i d e n t i f i c a t i o na n dt h eb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sr e s e a r c h ，c h i n e s em e d i c a lh e r b sw e r ec h o i c e d t oo b s e r v ee f f e c to ng r o w t ho fl a c t o b a c i l l u s ，a n dh a w t h o r nw a su l t i m a t e l yc h o s e na sag r o w t h p r o m o t i n gf a c t o r , o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r ed e s i g n e da n dt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n ss t u d i e d i nt h i ss t u d y , c h o l e s t e r o l - r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sw e r ec u l t u r e di ns e l e c t i v ec u l t u r e ( k e n j ib r o t h ) ，5 1 c h o l e s t e r o l r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sw e r es e l e c t e da n dd e t e c t e dt h e i r c h o l e s t e r o l r e d u c i n ga b i l i t y i nv i t r o b yp h o s p h o r u s - s u l p h u r - i r o nm e t h o d ，13h i g h e r c h o l e s t e r o l r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sw e r es e l e c t e da n da c c l i m a t e dt h e mi nk e n j ib r o t h ，t h e s e c h o l e s t e r o l - r e d u c i n ga b i l i t yw a sr a i s e d2 3 - - - - 9 8 t h e nh i g h e rc h o l e s t e r o l - r e d u c i n ga b i l i t y s t r a i n sw e r es e l e c t e d ，t h e yw e r ey s 一0 9 ，g l - 0 2 ，z p - 0 4 ，z p 一0 5 ，g l 一0 3 ，g l - a a ，z p w ，y s 一1 1a n d z p z t h e s es t r a i n sp r o b i t i cc h a r a c t e r i s t i c sw e r ed e t e c e di ns i m u l a t i o nh u m a ng a d t r o i n t e s t i n a l c h o l e s t e r o l r e d u c i n gl a c t o b a c i l l u sh a db e t t e ra c i da n db i l es a l tt o l e r a n c e ，a d h e s i o np r o p e r t i e s a n da n t i m i c r o b i a le f f e c to nc o m m o np a t h o g e n s a c c o r d i n gt ot h em o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r , p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lr e a c t i o na n ds u g a rf e r m e n t a t i o nc h a r a c t e r , 10l a c t o b a c i l l u s s t r a i n sw e r ei d e n t i f i e dt o5g e n u s ，z p z z p 一0 5a n dz p ww e r ei d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u s p l a n t a r u m ，g l - 0 3w a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sc a s e is u b s p c a s e i ，y s 一0 9a n dy s 1 1w e r e i d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sa c i d l o p h i l u s ，z p 一0 4w a si d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l u sb r e v i s ， g l a aa n dg l 一0 2w e r ei d e n t i f i e da sl a c t o b a c i l l um u r i n u s i nt h i ss t u d y , t h es e r i e so fb i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa b o u ts t r a i ng l - 0 3a n a l y z e d ，i t s o p t i m a lt e m p e r a t u r e37 。c ，a n dt h em i n i m u m13 。c ，m a x i m u m4 6 。c a sf o ri n i t i a lp hc e l l g r o w t h ，t h eo p t i m a lw a s6 0 ，a sw e l lt h eu p p e ra n dl o w e rl i m i t a t i o n sw a s9 6a n d3 6 ， r e s p e c t i v e l y g r o w t hc u r v ew a sd e t e c e di nt h em r sb r o t h ，g l - 0 3w a se n t e r e dt o t h e l o g a r i t h m i cg r o w t hp h a s e a n da f t e r4 ha n da n de n t e r e dt os t a b l ep h a s ea f t e r2 0 h d u r i n gt h e30 d a y sa n i m a le x p e r i m e n t ，t h em e a nv a l u e s f o rt h es e r u mt ca n dt go fi n t r a g a s t r i c a b s t r a c t a d m i n i s t r a t i o ng r o u pw e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nh i g hf a tg r o u p ，t h eg l - 0 3l o w e r e dt h e s e r u mc h o l e s t e r o lo fr a t sf e dw i t hf a t e n r i c h e dd i e ta n dp r e v e n t e dh y p e r l i p e m i af r o m o c c u r r i n g a b o u ta p p l i c a t i o no fs t r a i ng l - 0 3 ，t h ee f f e c tg r o w t ho fs t r a i n sf o r mc h i n e s em e d i c a l h e r b sw e r eu n d e r t a k e n ，h a w t h o r nw a su l t i m a t e l yc h o s e nf o r m16k i n d so fc h i n e s eh e r b sa sa g r o w t hp r o m o t i n gf a c t o r o r t h o g o n a le x p e r i m e n tw e r ed e s i g n e d ，s e n s eo r g a ni n d e xa n dt h e o p t i m a lf e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sw e r er e s e a r c h e d t h er e s u l ts h o w e dt h eo p t i m a lf e r m e n t a t i o n c o n d i t i o n sw e r es u c r o s ec o n c e n t r a t i o no f6 ，f e r m e n t a t i o nt e m p e r a t u r e4 1o c ，h a w t h o r n c o n c e n t r a t i o n1 ，m i x e ds t r a i n sw e r eg l 一0 3 ，l a c t o b a c i l l u sb u l g a r i c u s ，a n ds t r e p t o c o c c u s t h e r m o p h i l u s ( 1 ：0 5 ：0 5 ) k e yw o r d s ：c h o i e s t e r o 卜r e d u c i n gl a c t o b a c iii u s ，s c r e e n i n g ，i d e n t i f i c a t i o n ， i n d u c t i o n ，s j m u l a t i o n ，a n i m a it e s t ，f e r m e n t e dm ii k i i i 目录 目录 第一章绪论1 1 1 益生菌的研究概况1 1 1 1 益生菌的定义1 1 1 2 益生菌的种类1 1 1 3 益生菌应具备的条件2 1 1 3 1 对酸和胆盐有一定抗性2 1 1 3 2 能在肠道中黏附定植2 1 1 3 3 不携带可转移的耐药因子2 1 1 3 4 对宿主的安全性3 1 1 - 4 益生性乳酸菌的生理功能3 1 2 降胆固醇乳酸菌的研究概述5 1 2 1 降胆固醇乳酸菌的发现和发展5 1 2 2 乳酸菌降胆固醇的研究现状及机理6 1 2 3 影响降胆固醇能力的因素7 1 2 4 筛选降胆固醇益生菌应注意的问题8 1 2 5 降胆固醇乳酸菌研究存在的问题9 1 2 6 降胆固醇乳酸菌研究的热点与进展9 1 3 主要研究意义和研究内容1 l 1 3 1 主要研究意义1 l 1 3 2 主要研究内容1 2 第二章降胆固醇乳酸菌的筛选13 2 1 材料和方法1 3 2 1 1 材料和主要试剂1 3 2 1 - 2 主要仪器1 3 2 2 方法1 3 2 2 1 降胆固醇乳酸菌的分离及初步鉴定1 3 2 2 1 1 乳酸菌富集培养1 3 i v 目录 2 2 1 2 乳酸菌的分离和纯化1 4 2 2 1 3 过氧化氢酶测定1 4 2 2 1 4 乳酸的检测1 4 2 2 2 胆固醇降解能力的测定1 5 2 3 结果与分析1 6 2 3 1 降胆固醇乳酸菌的分离及初步鉴定结果1 6 3 3 2 胆固醇降解能力的测定1 6 第三章降胆固醇乳酸菌的定向诱导和模拟胃肠环境试验18 3 1 实验材料和方法1 8 3 1 1 试验材料1 8 3 1 1 1 菌株及主要试剂1 8 3 1 1 2 主要仪器1 8 3 1 2 试验方法1 8 3 1 2 1 定向诱导的方法1 8 3 1 2 2 模拟胃肠环境试验1 9 3 2 结果与分析2 0 3 2 1 降胆固醇乳酸菌的定向诱导试验结果2 0 3 2 2 模拟胃肠环境试验结果2 l 3 2 2 1 耐酸试验结果2 1 3 2 2 2 耐胆盐试验结果2 l 3 2 2 3 粘附性试验结果2 2 3 2 2 4 抑菌试验结果2 2 3 2 2 5 药敏试验2 2 第四章菌株的鉴定和生物特性的研究2 5 4 1 试验材料和试验方法2 5 4 1 1 实验材料2 5 4 1 1 1 菌株与培养基2 5 4 1 1 2 主要仪器2 5 4 1 2 试验方法2 5 4 1 2 1 常规的生理生化鉴定2 5 4 1 2 2 糖类发酵特性试验2 7 v 目录 4 1 2 3 最高、最低、最适生长温度和p h 值的测定2 8 4 1 2 4 生长曲线的测定2 8 4 2 试验结果与讨论2 9 4 2 1 常规的理化鉴定结果2 9 4 2 2 乳杆菌属鉴定结果2 9 4 2 3 最适生长温度3 l 4 2 4 最高及最低生长温度3 1 4 2 5 最适起始生长p h 3 2 4 2 6 最高及最低起始生长p h 3 3 4 2 7 生长曲线测定3 3 第五章菌株的体内降胆固醇活性的研究3 5 5 1 材料和方法3 5 5 1 1 实验材料3 5 5 1 2 试验方法3 5 5 1 2 1 灌胃菌液的制备3 5 5 1 2 2 高脂饲料的制备3 5 5 1 - 2 3 实验动物分组及饲养方式3 5 5 1 2 4 血样的采集与检测3 6 5 2 结果与分析3 6 5 2 1 灌胃乳酸菌g l - 0 3 菌液对小鼠血脂的影响3 6 5 2 2 灌胃乳酸菌g l - 0 3 菌液对小鼠体重与脏体比的影响3 7 第六章含降胆固醇中草药酸乳的发酵条件的研究3 9 6 1 材料和方法3 9 6 1 1 实验材料3 9 6 1 2 主要仪器3 9 6 1 3 试验方法3 9 6 1 3 1 中草药提取液的制备3 9 6 1 3 2 不同中草药提取液的不同浓度与乳酸菌的协同试验3 9 6 1 3 3 含中草药酸乳的发酵条件的研究4 0 6 2 结果与分析4 1 6 2 1 不同中草药提取液的不同浓度与乳酸菌的协同试验结果4 1 v i 日录 6 2 2 正交试验结果4 2 6 2 3 感官指标评价4 4 第七章结果与展望4 6 参考文献4 8 致谢5 1 附录a 降胆固醇乳酸菌的初步鉴定结果5 2 附录b 不同乳酸菌的耐酸能力5 5 附录c 不同乳酸菌的耐胆盐能力5 7 附录d 试验菌株对选择的碳氢化合物的细胞表面疏水特性5 8 附录e 乳酸菌对不同抗菌药物药敏性6 0 附录f 乳酸菌的常规的理化鉴定结果6 1 附录g 科研项目及发表文章6 1 v i i 第一章绪论 1 1 益生菌的研究概况 1 1 1 益生菌的定义 第一章绪论弟一早珀t 匕 1 9 6 5 年，l i l l y 和s t i l l w e l l 把益生菌描述为一种微生物产生的可以刺激其它微生物 生长的物质，是与抗生素作用相反的物质【2 】【6 1 。1 9 7 4 年，p a r k 将益生菌定义为有利于肠 道平衡的有机物质，这一定义将抗生素也包括在内。1 9 8 9 年，f u l l e r 把益生菌定义为能 够促进肠内菌群生态平衡，对宿主起有益作用的活微生物制剂，这一定义强调了益生菌 必须由活细胞组成，从而排除了抗生素。1 9 9 2 年，h a v e n a a r 等人将益生菌定义为“由 单一或多种微生物组成的活菌制剂，当应用于人或动物后，能通过改善宿主土著菌群的 组成，从而促进人或动物的健康”，该定义从多方面发展了益生菌这一概念。1 9 9 6 年， 美、德、英、荷、瑞典及日本等国1 5 位专家参加的“国际抗菌策略研究组 在讨论会 提出了益生菌定义：“益生菌是含活菌和( 或) 包括菌体组分及代谢产物的死菌的生物 制品，经口或其他黏膜投入旨在黏膜表面处改善微生物与酶的平衡或刺激特异性与非特 异性免疫”。上述定义指出3 点：( 1 ) 益生菌的组成：活菌、死菌、菌体组分及代谢产 物；( 2 ) 使用途径经口及其他黏膜( 包括皮肤) ；( 3 ) 目标功能：调整正常微生物群及 其酶系统的平衡，刺激特异性及非特异性免疫。到目前为止，在世界范围内学者们对其 定义还存在着争议。但是益生菌的保健功效已得到一致认可，并被广泛应用于工业、农 业、食品及医疗保健等与人类密切相关的各领域中。 1 1 2 益生菌的种类 益生菌主要是来源于动物肠道的正常生理性细菌和某些非肠道菌。1 9 8 9 年美国食品 和药物管理局( f d a ) 以及美国饲料监察协会( a a f c o ) 公布了4 1 种可用于饲料的安 全菌株。我国农业部于1 9 9 6 年公布了6 类菌：乳酸杆菌、粪肠球菌、双歧杆菌、酵母 菌、d m 4 2 3 腊样芽孢杆菌和s a 3 8 腊样芽孢杆菌可用于动物微生态调节剂。目前，常 用的益生菌菌种有双歧杆菌，乳酸杆菌和一些链球菌。其中，双歧杆菌有：青春双歧杆 第一章绪论 菌、短双歧杆菌等；乳酸杆菌有：嗜酸乳杆菌、保加利亚乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳 杆菌、罗伊氏乳杆菌、短- 孚l $ 1 ：菌、格氏乳杆菌和瑞氏乳杆菌；链球菌有：粪肠球菌、乳 链球菌、嗜热链球菌、和唾液链球菌。有些益生菌菌株已被用于商业化生产，如新西兰 恒天然公司的d r l 0 和d r 2 0 、汉森的c r l 4 3 1 和b b l 2 、雀巢的l a l 、益力多的s h i r o t a 菌株和荷兰l g g 制品等。 1 1 3 益生菌应具备的条件 益生菌必须是被公认为安全的微生物，在应用于生产实践之前要经过严格的筛选。 目前普遍认为益生菌应具备的基本条件如下所述【3 】【5 1 。 1 1 3 1 对酸和胆盐有一定抗性 益生菌及其制剂通常以口服的途径摄入，经过胃、小肠后以活性状态到达大肠，定 植后发挥其生理功效。益生菌定植存活是其发挥有益作用的关键，这种定植存活过程取 决于两个方面的特性，即能否抵御体内不良环境和是否具有附着于肠道的黏附能力。通 常从自然界分离得到的益生菌，如嗜酸乳杆菌、双歧杆菌等抵御人体消化道环境的能力 很差，这是影响其应用功效的主要障碍【3 】。因此，考察益生菌对酸和胆盐的耐受能力极 具研究意义。 1 1 3 2 能在肠道中黏附定植 新生婴儿，其肠道是无菌的。但出生后不久，外界的菌就会大量进入体内。有的菌 与宿主细胞有一定亲和力，通过黏附定植，成为肠道里的常驻菌。黏附是指细菌与肠上 皮细胞通过生物化学作用产生的特异性黏连。黏附是定植的第一步，不能黏附于肠上皮 细胞表面的细菌只能是过路菌，而不能在肠道内定植，也就不能充分发挥生理功能。乳 酸菌是人及动物肠道正常菌群的重要成员，百年来人们对其生理调节功能，营养促进作 用和非特异性抗感染等方面作了大量的基础和应用方面的研究。乳酸菌本身良好的黏附 定植特性，是其充分发挥生物学效能的保证，也是影响活菌制剂效果的关键因素之一。 1 1 3 3 不携带可转移的耐药因子 自1 9 2 9 年f l e m i n g 发现青霉素以来，已发现9 0 0 0 余种抗生素。抗生素的应用， 使大多数细菌性疾病得以控制，也证是由于长期大量使用抗生素，而产生了不少副作用。 2 第一章绪论 滥用抗生素引起微生物的耐药性是一个重要问题，耐药性的存在不仅影响抗生素效果， 而且可能产生出一批新的对人类危害更大的致病性微生物。由此可见，在选择有益菌株 应用于微生态制剂的生产时，应将不带耐药因子作为一个重要的筛选指标。在r 益广泛 食用的微生态制剂中，应用最为普遍的是乳酸菌。而乳杆菌天生对许多抗生素具有抗性， 但在大多数情况下，这种特性是不能转移的。这些具有非转移耐药基因的乳杆菌，不必 考虑其安全性。 1 1 3 4 对宿主的安全性 益生菌对宿主必须是安全的。双歧杆菌、乳酸杆菌一直破认为是安全的，关于其有 害的报道很少。但随着科学的不断发展，对益生菌安全性的认识也在发生变化。近年发 现，乳酸杆菌、明串珠菌、片球菌、肠球菌和双歧杆菌经常能够从许多感染的病变组织 中分离出来。这些报道引起了人们对益生菌安全性的重新认识。益生菌安全性评价一般 以病原性、毒性、代谢活性及菌株内在特性作为依据。如果益生菌制剂应用于人体，那 么菌株除了具备上述特性外还需满足以下几点要求：( 1 ) 必须分离来自健康人体的肠道； ( 2 ) 必须经过一定时间证明其无致病性；( 3 ) 不能与一些疾病( 如心内膜炎、肠道不 适症等) 有相联系的历史；( 4 ) 不能使胆盐早期解离。 1 1 4 益生性乳酸菌的生理功能 在人体消化道中定殖着种类繁多的微生物，其中一部分对人体健康有益，部分则有 害。t i s s i e r ( 1 9 0 5 ) 从母乳喂养的婴儿消化道中分离到这样一种有益细菌，并将其命名为 b a c i l l u sb i f i d u s 。将双歧杆菌用作益生菌就起源于该发现，目前作为益生菌常用的双歧杆 菌有b a d o l e s c e n t i s ， b b i f i d u m ，b 1 0 n g u m ，b f n f a n t i s ，b 1 a c t i s ( b a n i m a l i s ) 和 b t h e r m o p h i l u m ，其中后两种双歧杆菌来源于人体以外的生境。将链球菌以酸奶的形式 用作益生菌始于f u l l e r ( 1 9 9 3 ) ，作为酸奶发酵剂菌种之一的s t h e r m o p h i l u s 也是常用的 益生性乳酸菌之一【2 】【5 。具有益生作用的乳酸菌通常都是肠道细菌，它们被认为具有改 善人体胃肠消化道微生态环境的功能。益生作用的范围可以分为营养、生理作用和抗菌 作用等三个方面这方面研究及观察到的作用直接导致了各种含有乳酸菌的食品及饲料 在人和动物中的应用，乳酸菌还具有潜在免疫辅助作用，口服乳酸菌可以激发黏膜和系 统性免疫反应。益生性乳酸菌在营养及治疗方面的作用见表1 1 ： 3 第一章绪论 表1 - 1 益生性乳酸菌所产生的健康促进作用及可能的作用机理 t a bl - 1h e a l t hp r o m o t i o no fp r o b i t i cl a c t o b a c i l l u sa n dp o s s i b l em e c h a n i s mo fa c t i o n 益生菌的功能提出的作用机理 对肠道菌群的凋。1 ，作片j 减缓乳糖不耐症通过细菌性 预防肠道感染 增强免疫功能 减少炎症或过敏反应 抗大肠癌作用 改变血脂浓度， 减少心脏病发病风险 抗血脂作用 预防和治疗泌尿生殖道不着 感染 调节消化道的蠕动性 乳杆菌能抑制小肠菌群过度生长；降低或抑制有毒代 谢。产物的产生；抗菌作川 产物的产生：抗菌作h j1 3 - 卜乳糖茁酶分解乳糖 对抗体表达的增强辅助作用：能刺激系统性或分泌性 免疫反应；竞争性排除：改变肠道环境，使其不利于 致病菌的生存和治病力的产生；改变黏膜表面细菌素 的结合位点，减少毒素的结合；改变消化道菌群的组 成：黏附剑肠道黏膜表面，阻1 卜病原菌的黏附：与致 病菌竞争营养物质 增强机体对感染的_ f 特异性抵抗力；提高自血细胞的 吞噬活性；在受到减毒的s a l m o n e l l at y p h i m u r i u m 致 敏时，增加血清i g a 的表达：促进网状内皮组织淋巴细 胞增值；在抗原特异性免疫反应中发挥免疫佐剂作用： 调节t h l 厂r h 2 平衡，诱导细胞冈子的合成 使免疫系统同复剑静息状态：调1 ，细胞冈子的合成； 阻j ：抗原在血液中转位( 或转移) ； 与突变剂结合；顿化致癌物；改变人肠菌群的活性； 免疫反应：影响次级_ | j 日盐的活性； 同化j | ；1 日l i i i | 醇；改变肠道菌群_ | ；1 日盐水解酶活力；抗氧化 作用 通过肽酶的作用，分解乳蛋白产生具有抗高血压作用 的小肽( 例如i p p 、v p p ，均为血管紧张素转化酶抑 制剂) ；细胞壁成分对血管紧张索转化酶有抑制作用； 黏附到尿道和阴道上皮细胞表面；竞争性排除；产生抑 菌物质( 如h 2 0 2 、生物表面活性剂) ；竞争性排除； 产生乳酸 短链脂肪酸刺激肠道收缩 4 第一章绪论 近一个世纪以来，乳酸菌的保健作用得到了广泛而深入的研究。现已确定能 在人体肠道内定殖并存活的乳酸菌，其生理功能与人的营养状念、细胞感染、药物效应、 毒性反应、免疫反应、肿瘤反应、衰老过程和应激反应等息息相关，是人和动物肠道内 必不可少的正常菌群。 1 2 降胆固醇乳酸菌的研究概述 1 2 1 降胆固醇乳酸菌的发现和发展 乳酸菌大量存在于酸乳及其它相关发酵乳制品中，2 0 世纪7 0 年代，科学家先后通 过对大量饮用酸乳等发酵乳制品的非洲m a s a i 人血清胆固醇的研究、对常饮酸乳的美 国人的调查，以及直接对酸乳的研究均发现乳酸菌具有降低人体血清胆固醇的作用。有 观察表明普通动物粪便中排泄的胆固醇比无菌动物排泄的多，这暗示定居的微生物可能 会对血清胆固醇水平有一定的影响。这些结果引起了国内外营养学、医学、微生物学等 各界人士的普遍关注，从而掀起了乳酸菌降胆固醇作用的研究热潮。迄今，有大量实验 证实不同种类的乳酸菌具有降低胆固醇的效果。有关乳酸菌降胆固醇的研究主要集中于 乳酸杆菌的不同种类，其中以嗜酸乳杆菌的材料最为丰富，所选用的菌株类型也最多。 国外对降胆固醇乳酸菌的研究起步较早。g i l l i l a n d ( 1 9 7 7 ) 对肠道乳杆菌的降胆固醇作 用进行了研究，提出了乳酸菌在生长过程中通过降解胆盐促进胆固醇的分解代谢，从而 降低胆固醇含量的观点。g i l l i l a n d ( 1 9 8 5 ) 和其它研究人员进一步指出，在厌氧条件和 含有适量胆盐的高胆固醇培养基中生长时，嗜酸乳杆菌菌体细胞可以吸收胆固醇而降低 介质中胆固醇的含量。r a s i c 等证实了纯培养条件下部分乳酸菌和两歧双歧杆菌 ( b i f i d o b a c t e r i u mb i f i d u m ) 对胆固醇的吸收作用。 国内近些年也对乳酸菌降胆固醇作用进行了探究。张佳程( 1 9 9 8 ) 利用胆固醇含量 较高的奶油来筛选降低胆固醇能力强的乳酸菌株。王成涛( 2 0 0 2 ) 利用原生质融会技术 将芽孢杆菌和嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌进行远缘杂交，构建出高效降解胆固醇、产乳酸 的优势功能菌，并应用于食品发酵。肖琳琳( 2 0 0 3 ) 从西藏传统发酵乳中分离到一株有 效降解胆固醇的乳酸菌，并用实验性高血脂小鼠模型对该菌在体内的降血脂作用进行了 实验研究，结果表明，实验组小鼠血清中t c 、t g 浓度较对照组显著降低。 5 第一章绪论 1 2 2 乳酸菌降胆固醇的研究现状及机理 国内外大量临床试验证实，服用乳酸菌及其相关制品具有减少人体血清胆固醇含 量，降低心脑血管疾病率功效。为此，人们对乳酸菌丌展了体内外降胆固醇的研究，旨 在开发功能性乳酸菌制品，满足人们健康的需要。目前，在利用微生物降胆固醇领域科 学工作者们己做过很多有价值的研究。如许多研究表明乳酸菌发酵的食品可以降低人体 的血清胆固醇的含量。r i c h a r d s o n ( 1 9 7 7 ) 和m a n n 2 6 研究表明：在膳食中摄入 酸乳可以降低血液部的胆固醇，在酸乳中含有一种3 一羟基3 甲基葡萄糖酸和乳清酸可以 抑制从乙酸合成胆固醇的因子。我国学者郭本恒在功能性乳制品中关于乳酸菌的保健功 能指出 3 】：食用酸奶可以降低人体血清胆固醇的水平的功能。而微生物对食品基质中的 胆固醇是否有降低作用，这方面的研究对于利用微生物丌发低胆固醇制品具有重要的理 论意义。有人对乳酸菌在食品基质中的降胆固醇作用做了研究，发现在既没有额外加入 游离胆固醇也没有添加胆盐等物质的奶油中，大部分菌种也能达到4 0 以上的胆固醇吸 收率，尤以几种嗜酸乳杆菌的吸收同化能力最强。迄今，有大量实验证实不同种类乳酸 菌具有降低胆固醇的效果，具体参见表1 2 。 为此，人们对于乳酸菌降低胆固醇的机理进行了广泛的研究【l 】。乳酸菌降胆固醇的 可能机制有多种方式，一方面是为乳酸菌本身所具有的b i l es a l th y d r a s e ( 胆盐水解酵素) 活性，可使胆固醇在代谢过程中产生去结合型态的胆盐( b i l es a l t ) ，而乳酸菌体对胆盐共 轭活性增加，使胆固醇与去结合型胆盐于酸性p h 值下，产生共同沉淀作用 ( c o p r e c i p i t i o n ) ，从而降低了胆固醇含量，如1 9 9 8 年s m e t 等人指出猪只在食用 l a c t o b a c i l l u sa c i d o p h i l u s 的第3 7 周内，粪便中胆盐中的排出量有明显增加，相对的， 在第3 - 7 周内，猪只体内总血清胆固醇浓度也有明显的下降。另一方面，乳酸菌细胞 膜可键结胆固醇，甚至可将吸附的胆固醇进行同化作用( a s s i m i l a t i o n ) ，而代谢成细胞所 需物质，如1 9 8 5 年g i l l i l a n d 等提出嗜酸乳杆菌对胆固醇有吸附及同化作用，在o 3 o x g a l l 的环境下，乳酸杆菌的降胆固醇的能力较佳。在1 9 9 7 年，n o h 等同样提出嗜酸乳 杆菌的细胞膜可键结胆固醇，进而将吸附的胆固醇同化代谢成细胞所需物质。 尽管乳酸菌降低胆固醇的作用得到体内和体外实验的支持，但其作用机理至今尚未 定论，主要有三种观点：菌体细胞直接吸收、吸附胆固醇；菌体含有的胆盐水解酶 使胆盐由结合态转变为脱结合态，与胆固醇发生共沉淀；其他理论。如m a n n ( 1 9 7 7 ) 指出发酵乳中的3 羟基。3 甲基戊二酸可抑制甲羟戊二酸单酰c o a 还原酶( 胆固醇生 物合成中的限速酶) 的活力，从而抑制胆固醇的合成。 6 第一章绪论 表1 - 2 国外文献报导的具有降胆固醇功能的益生菌 t a b 1 - 2c h o l e s t e r o l - r e d u c i n gp r o b i t i c sr e p o r t e di na b r o a dd o c u m e n t s 蕊生乳酸龋凶株 l a c i d o p h i l u s ( 嗜酸乳杆菌) 三c a s e ( 干酪乳杆菌) l d e l b r u e c k i i s u b s p b u l g a r i c u s ( 德氏保加利亚乳杆亚种) l a m y l o v o r u s ( 食淀粉乳杆菌) 三r e u t e r i ( 罗伊士乳杆菌) 最b r e v e ( 短双歧杆菌) bb i f i d u m ( 两歧双歧杆菌) l f e r m e n t u m ( 发酵乳杆菌) l p l a n t a r u m ( 植物乳杆菌) l r h a m n o s u s ( 鼠李糖乳杆菌) a t c c 4 3121 ，r p 4 2 ，p 4 7 奉，r p 4 3 ，r p 3 4 a t c c 4 3 5 6 ，r p 3 2 宰，a t c c 4 9 6 m u h l 1 7 ，m u h 7 9 m u h 4 1 ，c h 4 a t c c 3 3 4 0 9 * d n 11 2 0 5 3 c r l l 0 9 8 a t c c l 5 7 0 m u h 8 0 a t c c l 4 9 3 12 0 * 2 9 9 v a t c c 7 4 6 9 表示经过体内验证 1 2 3 影晌降胆固醇能力的因素 许多因素可以影响到乳酸菌对胆固醇的脱除能力。分离自同一样品的不同菌种，同 一菌种的不同菌株间，甚至同一菌株在不同的试验中，其胆固醇脱除能力均有所不同。 纯培养条件下的研究表明，在含有胆盐的高胆固醇培养基中乳酸菌沉淀。胆固醇的能力 受多种因素的影响，如胆盐浓度、胆盐种类、活细菌数量以及培养液的p h 值等。适宜 的胆盐浓度、较高的活菌数和较低的p h 值有利于胆固醇的沉淀。此外，也有体内研究 证明，乳酸菌在动物胃肠内的活性、在胃肠道内黏附和定植的能力以及是否有足够数量 的菌体，都会影响其降胆固醇作用的发挥。 对于胆盐与乳酸菌降低胆固醇的之间关系，众多研究者均认为，适当增加胆盐浓度 可以提高菌体细胞壁的通透性，使固醇类物质渗入细胞内部，引起环境中胆固醇浓度下 降；而胆盐浓度过高，则抑制细菌的生长，不利于菌体细胞对胆固醇的吸收。在体内， 胆盐是胆固醇代谢的主要终产物，采取有助于胆盐分解代谢的措施将有利于降低胆固醇 7 第一章绪论 浓度。b r a s h e a r s 等人对两株干酪乳杆菌和两株嗜酸乳杆菌在不同p h 值条件下的降胆固 醇能力进行了研究，发现干酪乳杆菌在不同p h 值条件下对胆固醇的脱除能力存在显著 差异。在p h 6 0 时两株菌几乎不能降低生长介质中的胆固醇含量，而在不控制p h 值( 低 于6 0 ) 时，对胆固醇的脱除量可达6 0ug m e 。但嗜酸乳杆菌在不同p h 值条件下对胆 固醇的脱除量则无明显差异。h k i m o t o ，s o h m o m o 等人试验表明热致死的菌株n 7 具 有降低培养基中的胆固醇作用，他们还推测能够降低动物体内的血清胆固醇。这可能是 由于死菌体在通过人体肠道时，利用其表面吸附胆固醇，将胆固醇携带出体内，降低体 内的一部分