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生物芯片技术 BIOCHIPTECHNOLOGY 研究历史 Researchhistory 1991Affymatrix公司StephenFodor 光刻与光化学技术 多肽和寡聚核苷酸微阵列 DNAChip概念Stanford大学Brown实验室 预先合成 机械手阵列1995Schena等 基因表达谱1996Cheeetal DNA测序1996Croninetal 突变检测1996Sapolsley Lipshutz 基因图克隆1996Shalonetal 复杂DNA样本分析1996Shoemakeretal 缺省突变定量表型分析 第十章生物芯片技术 生物芯片 biochip 的概念指采用光导原位合成或微量点样等方法 将大量生物大分子如核酸片段 多肽分子甚至组织切片 细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面 组成密集二维分子排列 然后与已标记的待测生物样品中的靶分子杂交 通过特定的仪器对杂交信号的强度进行快速 并行 高效地检测分析 从而判断样品中靶分子的数量 根据生物分子之间特异性相互作用的原理 如DNA DNA DNA RNA 抗原 抗体 受体 配体之间可发生的复性与特异性结合 设计一方为探针 并固定在微小的载体表面 通过分子之间的特性性反应 检测另外一方有无 多少或者结构改变等 生物芯片 Biochip或Bioarray 是指包被在固相载体上的高密度DNA 抗原 抗体 细胞或组织的微点阵 microarray 未来十年最具发展潜力的技术 第十章生物芯片技术 生物芯片的主要特点 高通量 微型化和自动化常用的生物芯片的分类 基因芯片 蛋白质芯片及芯片实验室 特点 高度并行性 提高实验进程 利于显示图谱的快速对照和阅读 多样性 可进行样品的多方面分析 提高精确性 减少误差 微型化 减少试剂用量和反应液体积 提高样品浓度和反应速率 自动化 降低成本 保证质量 第十章生物芯片技术 基因芯片 Genechip 又称DNA芯片 是根据核酸杂交的原理 将大量探针分子固定于支持物上 然后与标记的样品进行杂交 通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析 第十章生物芯片技术 2 蛋白质芯片 proteinchip 利用抗体与抗原特异性结合即免疫反应的原理 将蛋白质分子 抗原或抗体 结合到固相支持物上 形成蛋白质微阵列 即蛋白质芯片 第十章生物芯片技术 芯片实验室 labs on chip 高度集成化的集样品制备 基因扩增 核酸标记及检测为一体的便携式生物分析系统 实现生化分析全过程集成在一片芯片上完成 从而使生物分析过程自动化 连续化和微缩化 芯片实验室是生物芯片技术发展的最终目标 其他分类方法 根据应用 基因变异检测芯片疾病检测 如HIV P53基因 结核杆菌 法医鉴定 如DNA指纹图谱 表达谱芯片肿瘤相关基因 正常与肿瘤组织表达差异 药物筛选 培养细胞药物刺激前后表达差异 发育 同一组织不同发育时期基因表达差异 组织发生 不同组织或器官的基因表达差异 根据工艺和载体 1 原位合成法 密集程度高 可合成任意序列的寡聚核苷酸 但特异性较差 寡聚核苷酸合成长度有限 且随长度增加 合成错误率增高 成本较高 设计和制造较烦琐费时 2 DNA微矩阵法 成本低 易操作 点样密度通常能满足需要 芯片的载体需表面紧质 光滑的固体 如硅 陶 玻璃等 DNA微矩阵芯片常用玻片为载体 根据DNA成分 寡聚核苷酸或DNA片段 约20 25个核苷酸碱基 常用于基因类型的分析 如突变 正常变异 多态性 全部或部分cDNA 约500 5000个核苷酸碱基 通常用于两种或以上样本的相关基因表达分析 基因芯片的种类 ScienceChip 生物分析和诊断NutriChip 食物分析 转基因 污染检测LeukoChip 血液分析 病毒分析 HLA分析AquaChip 水质分析SecureChip 含DNA的物质鉴定ChromoChip 基因分析和染色体序列ProkaryoChip 原核生物 兽医 环保等 第十章生物芯片技术 第二节蛋白质芯片 第一节DNA芯片 第一节DNA芯片 第一节DNA芯片 DNA芯片技术包括四个主要步骤芯片的设计与制备样品制备杂交反应和信号检测结果分析 生物芯片技术主要环节 芯片制备 微点阵样本制备 DNA提纯 扩增 标记杂交 样本与互补模板形成双链检测 共聚焦扫描 双色激光数据处理 定量软件 数据库检索 RNA印迹等 结果 第一节DNA芯片 第一节DNA芯片 二 样品的制备 三 杂交与结果分析 四 基因芯片技术在医学中的应用 一 芯片制备 一 芯片制备 基因芯片制备主要包括两个方面探针的设计 根据应用目的不同 设计不同的固定于芯片上的探针 探针在芯片上的布局 选择合适的方式将探针排布在芯片上 一 芯片制备 二 DNA芯片的制备 一 探针的设计 一 探针的设计 表达型芯片探针的设计不需要知道待测样品中靶基因的精确细节序列的特异性应放在首要位置单核苷酸多态性检测芯片探针的设计等长移位设计法特定突变位点探针的设计叠瓦式策略 一 芯片制备 一 芯片制备 图10 2 二 DNA芯片的制备 1 载体选择与预处理载体 用于连接 吸附或包埋各种生物分子并使其以固相化状态进行反应的固相材料 载体材料 玻片 硅片 硝酸纤维素膜 尼龙膜和聚丙烯膜等 载体的化学处理 活化剂 多聚赖氨酸氨基硅烷偶联剂 一 芯片制备 2 基因芯片制备 1 原位合成 insitusynthesis 光导原位合成法 原位喷印合成 分子印章多次压印合成 2 点样法 芯片制备 原位合成法 insitusynthesis 又可分为原位光控合成法和原位标准试剂合成法 适用于寡核苷酸 使用光引导化学原位合成技术 是目前制造高密度寡核苷酸最为成功的方法 一 芯片制备 图10 3 合成后交联 post syntheticattachment 利用手工或自动点样装置将预先制备好的寡核苷酸或cDNA样品点在经特殊处理过的玻片或其他材料上 主要用于诊断 检测病原体及其他特殊要求的中 低密度芯片的制备 两种制备方法比较 原位合成 测序 查明点突变高密度 根据已知的DNA编制程序制作复杂 价格昂贵 不能测定未知DNA序列合成后交联 比较分析制备方式直接和简单 点样的样品可事先纯化 交联方式多样 可设计和制备符合自己需要的芯片 中 低密度 样品浪费较多且制备前需储存大量样品 二 样品的制备 样品的制备过程包括核酸分子的纯化 扩增和标记 样本制备 制备高质量样本是困难的但又是极其重要的 制备细胞 组织或整个器官样本应特别小心 温度 激素和营养环境 遗传背景 组织成分等轻微改变都会使基因表达的结果发生明显变化 用于基因类型分析的样本是DNA 用于表达研究的样本是cDNA 样本制备后应进行标记 通常为酶标记 荧光标记和核素标记 三 杂交与结果分析 一 杂交反应 与传统的杂交方法类似 二 杂交信号的检测 最常用荧光法 三 数据分析 芯片杂交图谱的处理与存储由专门设计的软件来完成 杂交 是芯片技术中除方阵构建外最重要的一步液相中探针与DNA片段按碱基配对规则形成双链反应 选择杂交条件时 必须满足检测时的灵敏度和特异性 使能检测到低丰度基因 且能保证每条探针都能与互补模板杂交 合适长度的DNA有利于与探针杂交 温度 非特异性本底等均会影响杂交结果 最好在封闭循环条件下杂交 杂交炉 结果分析 芯片与标记的靶DNA或RNA杂交后 或与标记的靶抗原或抗体结合后 可采用下列方法分析处理数据 共聚焦扫描仪 应用最广 重复性好但灵敏度较低 质谱法 快速 精确 可准确判断是否存在基因突变和精确判断突变基因的序列位置 探针合成较复杂 化学发光 光导纤维 二极管方阵检测 直接电荷变化检测等 芯片扫读装置 根据采用的光电偶合器件 分为光电倍增管型和CCD型 根据激光光源 可分为激光型和非激光 应用最为广泛的是激光光源的共聚焦扫描装置 分辨率 灵敏度极高 有良好的定位功能 可定量 应用广泛 图象分析 复杂的杂交图谱一般需由图象分析软件来完成 分析软件的功能 鉴定每个点阵 最大限度消除本底荧光的干扰 解析多种颜色图象 可标记或排除假阳性 识别和分析对照实验是否成功 可将信号标准化等 图象处理软件必须具备提取基因库和数据库的能力 四 基因芯片技术在医学中的应用 基因表达分析基因型 基因突变和多态性分析疾病诊断 遗传性 感染性 肿瘤药物筛选指导用药及治疗方案预防医学 四 基因芯片技术在医学中的应用 生物芯片分析原则 1 测定过程应包括五个基本步骤 需解决的生物学问题样本制备生物化学反应检测数据分析 2 生物学系统控制必须精确地与检测目的相匹配 3 生物学样本必须精确地与生物学种类相匹配 4 所有基因分析必须平行处理 5 基因分析技术必须适合微型化和自动化 6 平行格式必须精确的依据生物学样本的次序 7 检测系统必须能精确地获得数据 8 检测系统获得的数据必须能被精确地控制和重复 9 两种或以上平行数据组比较应受到单个实验所固有特性的限制 10 绝对比例关系只存在于组合实验的平行数据组内 11 平行格式包括内在和外部的整个系统误差的分析因素 12 在每个系统模块中采集到该系统所有变量的四维数据时 才能称为完成生物系统平行基因分析 生物芯片技术的12条原则只是一个基本框架 其术语的详细定义和有关理论可参见http cmgm stanford edu schena 质量控制 实验对照 体外转录从cDNA合成mRNA 参入标本中作为对照 此mRNA不与点阵的核酸杂交 将不同浓度的不同基因参入标本中 可作为标本间标准化的参照 用两种不同吸收光谱的荧光素同时分析两个标本 如果两种荧光强度一致 可排除标本间变异因素 用单一碱基错配的寡核苷酸做对照可排除交叉杂交 结果有效性的证实 在表达矩阵上 有时难于区分极其相似的序列 如基因族成员 亚类或异类的存在 比较两种不同DNA序列表达水平时 有些参数如核苷酸的成分 二级结构的存在和矩阵上DNA的长度都会影响杂交 证实矩阵分析的结果可用RT PCR 区别基因族成员 比较不同DNA种系表达 证实基因变异或突变和精确测定DNA表达水平 NorthernBlot 证实某一基因的相对表达水平 WesternBlot RNA表达是否达到细胞中的蛋白水平 质谱仪 证实矩阵结果是否在蛋白水平 等 第二节蛋白质芯片 第二节蛋白质芯片 蛋白质芯片 proteinchip 又称蛋白质微阵列 是指以蛋白质或多肽作为配基 将其有序地固定在固相载体的表面形成微阵列 用标记了荧光的蛋白质或其它分子与之作用 洗去未结合的成分 经荧光扫描等检测方式测定芯片上各点的荧光强度 来分析蛋白质之间或蛋白质与其它分子之间的相互作用关系 第二节蛋白质芯片 根据制作方法和应用的不同 蛋白质芯片分为两种蛋白质功能芯片细胞中的每一种蛋白质占据芯片上一个确定的点 主要是高度平行地检测天然蛋白质活性 蛋白质检测芯片将能够识别复杂生物溶液 如细胞提取液 中靶多肽的高度特异性配体进行点阵 这种芯片能够高度并行的检测生物样品中的蛋白质 第二节蛋白质芯片 第二节蛋白质芯片 蛋白质芯片技术在医学中的应用特异性抗原抗体的检测生化反应的检测疾病诊断对疾病分子机制的研究药物筛选及新药的研制开发 抗体和蛋白质阵列技术 蛋白质组学 protiomics 的兴起 促进了抗体和蛋白质阵列技术的发展 PareickBrown使用特异性抗体微矩阵 测定了细胞和体液样本中数千种不同的蛋白质 Leuking等采用蛋白质微阵列技术 测定了10pg的微量蛋白质 并证实假阳性极低 乳腺癌基因芯片 Stanford乳腺癌微矩阵 Perouetal 1999 每种基因的数据以行表示 每个实验用列表示 颜色强度表示对照和实验cDNA的比率 比率相同时为1 结果为红色表示mRNA增加 绿色表示减少 灰白色表示缺乏 两种基因的相似性用Pearson相关公式或Euclidian测距公式计算 DNA微矩阵分析软组织肉瘤表达KavineMaillardetal 1999 cDNAs进行DNA表达矩阵 PCR产物包被在经赖氨酸处理的玻片上 用Cys3 和Cys5 标记的cDNA进行杂交 洗涤后用Scanarray3000扫描仪测定矩阵 表达数据储存在ACeDB数据库中 根据数据表达类型区分不同的基因 微矩阵分析DNA和蛋白表达HolgerEickhoffetal 1999 根据已有的序列数据 组合800000人类EST序列 已重矩阵了38000克隆用于RNA表达分析 克隆经PCR扩增后共价结合于玻片上 每张玻片固定19200个基因片段 标记人组织RNAs与被选的38000人基因片段的矩阵进行杂交 比较健康与疾病组织的图象 用软件分析点识别和点定量 使用寡聚核苷酸鉴定新的cDNA克隆 和进入表达载体 使相应蛋白能直接表达 矩阵后可分析蛋白 蛋白和蛋白 DNA的关系 生物芯片相关仪器 点阵仪 制备芯片 点样针分为实心和空心两种 点样方式有非接触喷点和接触点样两种 杂交仪 全自动完成调节 加探针 漂洗和热循环的杂交过程 扫描仪 激光共聚焦或CCD直接成像分析结果 微矩阵仪器介绍 QBotQPixQArrayQPetQSoft2000 QBot 超高解析基因筛选暨排列分析仪 基因菌落筛选 ColonyPicking 3500 h基因排列打点 Gridding 100000 h基因复制 Replication 96 96 96 384基因重新排列 Re Arraying 正确的基因置复制盘基因微矩阵排列 Micro Arraying 20000 片全自动液体分注系统 LiquidHandling 96针 注液量1 200 l 适合PCR产物 分析软件 分析 质控 上网 环境控制 紫外线照射 空气滤网 阳极处理铝板 QPix 半敞开式基因筛选暨排列分析仪 经济型 基因菌落筛选 ColonyPicking 3500 h基因排列打点 Gridding 100000 h基因复制 Replication 96 96 96 384基因重新排列 Re Arraying 正确的基因置复制盘基因微矩阵排列 Micro Arraying 20000 片分析软件 分析 质控 上网环境控制 紫外线照射 空气滤网 阳极处理铝板 QArray 第三代半敞开式基因微矩阵排列仪 基因微矩阵排列 Microarrying 同时处理84片玻片 每一打点玻片分4个区域 可安排不同的矩阵排列 可选16或24针座 仪器容量 玻片84片 玻片架6个 384孔板5盘 分析软件 分析 质控 上网 环境控制 紫外线照射 空气滤网 阳极处理铝板 自动液体处理系统 杂交仪 Affymetrix640杂交仪 温度范围 0 100 C探针用量 l流速 10ml min样本区 2 4 6 4cm 扫描仪 GenearrayTM扫描仪 激光 氩离子 488nm适用染料 荧光素 藻红素单扫描时间 4分钟分辨率 3 6 9或24微米 生物芯片技术的发展 发展趋势微型化 DNA矩阵越来越小 集成化 矩阵上的基因组越来越大 多样化 测定范围越来越广