（生物医学工程专业论文）细胞骨架图像分析处理系统开发.pdf

塑坚查兰曼主兰垒堡壅! ! ! 塑! a b s t r a c t 1 n h ed i s t 曲u t i o no fc y t o s k e i e t o ni sd o s e l yr c l a t e dt oc e l l sp h y s i o l o 百c a lf l l n c t i 彻t o d e v e l o p 锄i m a g ep r o c e 醛i n gs y s t e mt om e 弱u r et h ep a r a m e t e r so fc ) ，t o s k c l e t o ni s i m p o f t a n tf o rc c ub i o l o g yr e a s e 珀c h b yv i e w i n gt h ec ”o s k c k t o nm o l p h o l o g y ，an e wp a r 锄e t e r p e r i m e m b r a n e ( p m ) w h i c hw a sd e f i n e da st h em t i oo fc y t o s k e l e t o ni nm e m b r 柚ea r c at ot l l a ti n n e rc e u ，a n d s o m et e x t u r cp a t a m e t e r sw e r ec h o s e nt od e s c i i b et h i sd i s t r j m u t i o n mi m a g ep r o c c s s i n g s y s t e mw 舔d e v e l o p e du n d 盱v i s u a lc + + 6 oe n v i o m 跖tt om e 船u t et h 伪ep a i a m e t e 璐 丘_ 0 mt h e c y t o s k e l e t o i m a 萨s ， w hw e i et a k e n w i t hl 勰e rs c r n i l l gc o n f o c a l m i c r o s c o p e t h es y s t e mw a st e s t e dw “ht h r c cg m u p c y t o s k e l e t o i n l a g ，o b t a i n c di nd i f e f e n t c o n d i t i o n t 1 l ep a 舳e t e l 苫盯ea l ls i 和墒咖td i 妇f c 瑚c e sb e m e e n 卸ym og r o u p s t h i s r e s u i tc o r r e c t sw i t ht e s td e s i r e n i si n d i c a t c st h a tt h e s ep a 删n e t e r sc o u l dd c s c r i b em e v a r i a n c eo fc y t o s k e l e t o nm o i p h o l o g y 蛐dm a y b eu s e f u if o rc e nr e s e a r c h k e yw o r d s ：c ”o s k c l e t o n 【丑s e f ( = o n f o c a im i c m s 。o p et e x t u 他柚a l y s i s p e r i - m e m b r a n e ( p m )掣a yi e v e lc 0 啦c u n e n c c 哪t r i 】【 浙江大学硕士学位论文( 2 6 ) 1 - 1 研究背景 1 1 1 细胞骨架 第一章前言 细胞骨架( c y t o s k e l e t o n s ) ，是指细胞内蛋白质纤维组成的复合网架( 见图1 1 ) ， 随着细胞形态的改变而发生变化，同时进行自身协同性定向运动，是一种高度的动 态性结构。它在生物体中占着举足轻重的作用，几乎参与了机体一切重要生命活动， 如细胞内各种细胞器的空间定位及其在细胞质中的位置改变、细胞本身的运动和受 到周围应力影响时运动状态改变【m 出k ，1 9 9 9 l 、细胞内外的物质运输、细胞损伤 【s h a m a ，2 0 0 5 1 、细胞某些通道的信号转导r n i e 汹，2 0 0 2 】、细胞增殖分裂，生长r r a k a l l a s h i ， 2 0 0 0 1 与分化等。 国卜1细胞骨架成分圈 细胞骨架大体上由三类蛋白质纤维：微管( m i c r o t l l b u l 髂) ，微丝( m i c l 0 6 l 啪曲t s ， m f ) 以及中间丝( i n t e 咖e d i a t e 丘l a m e n t s ) 的组成。，通过这三种纤维之间的协调性分布， 以及与胞核，质膜，细胞器的相互作用，形成了细胞骨架的形态结构和运动协调系 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 6 ) 统。微管由微管蛋白( t u b u l 岫组成，是一种球形的酸性蛋白，主要由a 和b 亚微管蛋 白构成。亚微管蛋白就是一种由a 和b 亚基构成的二聚体。t u b u l i n 可以反应出在受到 某些条件的刺激下，细胞内部的状态的改变【b o u l e “t m ，1 9 9 8 】。微管之间以微管结合 蛋白( m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp r o t e i n ，m 相联系，主要的m a p 有m a p - l 、m a p - 2 蛋 白等，它们与调节微管聚合范围及运动速率有着非常密切的关系。微丝，也称为纤 维肌动蛋白( f a c t i n ) 。是由球形肌动蛋白( g a c t i l l ) 单体形成的多聚体，它本身是 种很复杂的动态性网络结构【m i c h a c 】c 2 3 1 ，存在着微丝重建i h i r a y a m a ，2 0 0 2 】现 象。所谓微丝重建，就是随着细胞功能的改变而发生可逆性聚合和解聚的重组现象 【f c m a n d e z ，2 0 0 4 】。中问丝的成分则较为复杂，是由多基因家族编码的多种异源性 纤维状蛋白组成，主要包括酸性胶质蛋白( a c i d i c c y t o k e m t i n ，a c k ) 、碱性胶质蛋白 ( b a s i cc ”o k e r a t i n ，b - c 酌、波形蛋白( v i m e n t 蛐、肌间线蛋白( d e s m 呻、胶质纤维酸性 蛋白( g l i a l 肋f i l l a ya c i d i cp m t e i n ，g f a p ) 、周边蛋白邱h c 血) 、a - 内连蛋白 ( a 血t e m e x i n ) 、神经纤维蛋白( n e u 胁丘l 锄岫t e i n ，n f ) 、核纤层蛋白( a m i n i n ) f 翟中 和，2 0 0 0 1 ，其中还有两种较为特殊的晶状体中间纤维蛋白：f i l e n s i n 和p h a k i n i n f 王婷 婷，2 0 0 3 】。目前微丝是细胞骨架研究的主要对象。 细胞骨架以多种形式广泛存在于机体的细胞内，构成细胞的支持结构和胞质其 它成份的依附支架。以此维持细胞的特定形状和细胞内多种成分的空间位置。它赋 予细胞韧性和强度，并与细胞外基质紧密相关联，从而对各种组织的顺应性产生影 响。近年来的研究进一步证实，细胞骨架网络系统还参与细胞增殖、分泌、迁移 【r o j 一2 0 0 5 】、粘连、信号传递、分化、癌变及调亡i 、，e n e r k i n d a ，2 5 】等与生命现象 相关的活动过程，并且在许多疾病中有过表达现象。目前大量实验研究发现，细胞 状态与细胞骨架的相互作用密切。细胞在受到外界某些因素刺激的时候，它的细胞 骨架形态会发生很大的改变；图1 2 ，图1 3 显示了在药物刺激下其变化情况f g i m ， 2 0 0 3 】。f - a d i n 的变化，反应了细胞生理状态相应的变化【陆km ，1 9 9 9 1 。 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 6 ) 国1 - 2 受药物a 刺激的f - a c t i n圈卜3 受药物b 刺激的f _ a c t i n b e nz e 【b 姐。z c ，1 9 9 1 1 提出细胞骨架变化可以调节基因的表达，将其中的某些 基因成分突现出来【p n n ，2 0 0 0 l 。同时，细胞骨架可以把细胞内部深层次结构表达出 来【m i c h a e j k ，2 0 0 3 j ，为以后进一步研究细胞提供了一种新的手段。m a 血t 在实验中 发现与以往观点不同，细胞骨架的改变不仅仅是在吞噬细胞的前期，也在整个巨噬 细胞的活动过程中发生着i m a f i a t ，2 0 叫。表皮生长因子与它的关系很密切【) 【i ej s ， 2 0 0 4 】。细胞骨架的分布具有组织特异性，常用来进行某些疾病的鉴别诊断，如动脉 粥样硬化【b m d e r ，2 1 1 ，心肌坏死口) i s o a ，2 4 1 。因此通过对细胞骨架形态的分析， 可以对细胞状态进行一个有效的评价。 1 1 2 细胞骨架图像的获取 1 1 2 1 细胞骨架的获取设备 目前要获得较为精细的细胞骨架图像主要是通过共聚焦扫描显微镜采集得到 的，采集设备如图1 - 4 所示。激光共聚焦扫描显微镜( h s e rs c 卸n i n gc o n f a c a l m i c m s 。d p e ) 是近代生物医学成像仪器的重要发展成果之一。它结合了新颖的共聚 焦原理、激光扫描技术及计算机图像处理技术，是一种典型的高技术光电仪器。长 期以来，在使用普通光学显微镜时，光的衍射造成的分辨率的限制一直没有得以解 决。自激光发明以来，随着激光在显微镜中的应用日益广泛，如利用激光的相干性 竖垩盔兰璺主兰垡堕塞! ! ! 塑! 一 成功的研制了全息显微镜，利用激光的单色性作为荧光激励源设计成功的激光荧光 显微镜等等，显微镜技术的分辨率问题得到了很好的解决。近十年来，随着激光扫 描测量图像技术的发展，人们将其应用于显微领域从而形成了一种新型的显微镜 二激光扫描共聚焦显微镜( l s c h o ，给传统的显微镜领域带来了革新。同普通的光 学显微镜相比，它具有较高 成像设备 共聚焦显微镜 图1 4 细胞骨架成像设备图 灵敏度、较高的横向轴向分辨率，可以对样品进行更好的观察，因而在生物、医学 诊断及半导体电子器件检测等方面具有广泛的应用【a s l l m mr a z d n ，2 1 l 。 激光扫描共聚焦显微镜成像原理如图1 - 5 所示，激光器发出的激光束经过扩束 透镜和光束整形镜，变成一束直径较大的平行光束，长通分色反射镜使光束偏转9 0 度，经过物镜会聚在物镜的焦点上，样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个 方向的荧光，一部分荧光经过物镜、长通分色反射镜、聚焦透镜、会聚在聚焦物镜 的焦点处，再通过焦点处的针孔，由检测器接收。 从图1 5 中可以看出，只有在物镜的焦平面上发出的荧光才够到达检测器，其 它位置发出的光均不能过针孔( p i i l l l o l e ) 。由于物镜和会聚透镜的焦点在同一光轴 上，因而称这种方式成像的显微镜为共聚焦显微镜。在成像过程中针孔起着关键作 4 用，针孔直径的大小不仅决定是以共聚焦扫描方式成像还是以普遍光学显微镜扫描 方式成像，而且对图像的对比度和分辨率有重要的影响。 图1 - 5 【s c m 系统的原理示意围 5 浙江大学硬士学位论文( 2 0 嘶) 1 1 2 2 几种细胞骨架图像的荻取方法 细胞骨架观察的基本原理就是通过荧光染料和骨架成分的特异性结合，由染料 的荧光来表征细胞骨架成分。通过激光扫描共聚焦显微镜，拍摄得到细胞骨架图像。 1 内皮细胞骨架检测 取e c v 3 0 4 脐静脉内皮细胞株，解冻复苏后用含1 0 小牛血清的d 培养基 培养，以o 2 5 胰蛋白酶消化传代。实验时分别种细胞于1 2 孔板与2 4 孔板中，将细 胞放置于o 5 c mxo 5 c m 的盖玻片上。待细胞至9 0 融合时，以无血清d b m 培养基 培养2 4 h 后开始实验。2 4 h 后，以p b s 反复冲洗，在4 条件下，用4 多聚甲醛固定细 胞，再以p b s 冲洗。然后加入f - a d i n 荧光抗体，在3 7 条件下，闭光保存3 0 n l i n ，再 以p b s 冲洗，以洗掉多余荧光抗体，最后用1 0 缓冲甘油封片置于激光扫描共聚焦 显微镜下观察【陈玉成2 小也可以检测g - a d i l l ，其染色步骤与f - a c t i l i 相似，它的特 异性结合物为俄勒冈绿标记的d n a 酶l ( o r e g o ng 蛐d n a i ，o 嘞m o 旺) 【郭晓华， 2 0 0 5 】。 2 脊髓细胞骨架骨架检测 培养大鼠脊髓细胞，用p b s 冲洗2 次。用4 多聚甲醇将其固定2 0 m i i l ，p b s 洗涤 3 次，每板加入1 0 0 u l 孵育液。内含与f - a c t i n 专一性结合的绿色荧光标记物b o d l p yf l p h a u a d d i n ( 1 ：1 0 0 ) 和胞核特异性红色荧光染料d a p lr h o d a m i l 增( 1 ：8 0 0 ) ，在3 7 条件 下，避光孵育1 h ；p b s 洗涤3 次，在缓冲甘油中封片，激光扫描共聚焦显微镜下观察 ( 戚盂春2 0 0 5 1 。 3 系膜细胞骨架检测 在无菌盖玻片上接种系膜细胞，置c 0 2 培养箱中培养，进行f - a c 皿荧光染色。 p b s 液洗3 次，每次5 m i n ，用4 多聚甲醛固定系膜细胞s m i n ，用o 1 t r i t o nx 1 0 0 处理10 i 】1 i n ，再和r h o d a m i i l c p h a l l o i d i n ( 0 1 6 5 u m o l l ) 混合，3 7 孵育1 h 。p b s 液洗3 次，每次5 m i n ，缓冲甘油中封片。在激光共聚焦显微镜下观察各组系膜细胞f a d i n 分布【唐万欣，2 0 0 4 】。 6 浙江大学硬士学位论文( 2 0 d 6 ) 4 毛囊外根鞘无色素黑素细胞“蝴m c ) 骨架检测 将a m m c 首次传代于放置有预先包被纤维连接蛋白( 1 毗咖m 2 ) 盖玻片的6 孔培 养板中，取其中生长良好的细胞。用d h 伲m 基础培养基处理细胞4 d ，以去除a m m c 培养基中其他成分对细胞的影响。取盖玻片上的a m m c ，p b s 洗3 次，每次5 m i n ， 浸入4 多聚甲醛液中，室温固定1 0m i n 。用p b s 冲洗5n l i n ，重复3 次。把盖玻片的 细胞面朝上置于一张滤纸上，放入有盖平皿中。用0 5 t r i t 锄x 一1 0 0 室温下处理细 胞5 m i i i ，以便抗体可以进入细胞内。p b s 冲洗5n l i n ，同样重复3 次。用羊血清覆盖 细胞，持续1 0m i n ，以减少盖玻片上非特异抗体的影响。吸掉羊血清，滴加1ug m i 罗丹明标记的鬼笔环肽3 7 避光孵育3 0 m i i l ，滴加鼠抗人b 微管蛋白抗( 1 ：5 0 ) ， 3 7 避光孵育3 0 m i l l 。p b s 冲洗5m i l l ，3 次重复，加入f t r c 标记的山羊抗鼠i g g 二抗 溶液( 1 ：1 0 0 ) ，3 7 避光孵育3 0 m i n 。p b s 缓冲液洗3 次，用滤纸吸掉周边水分，每份 待测样品加入o 2m lp b s 后分别置于连接电脑的激光共聚焦显微镜下，选择4 0 倍 的物镜，红、绿滤光片，激发光波长为4 8 8 砌和5 4 3 n m ，预扫描后选定最佳细胞扫 描参数，锁定参数【马慧军，2 0 0 5 】。 5 轮藻细胞骨架检测 实验前一天取不同生长阶段节间细胞的轮藻主枝，去除周围的轮生细胞，放入 p e m 缓冲液( p e mb u 缸f ，5 0 n i 啪j l 脚e s ，5 衄o l le g t a ，5 姗o l lm g s 0 4 ， 5 0 m m o v l k c l ，p h 6 8 ) 中平衡过夜。次日将平衡好的节间细胞经1 0 u 啪i l o f y 朋l i n 先预处理4 0 l i n ，或直接置于固定液( 0 5 戊二醛+ 4 多聚甲醛) 中固定 4 5 m i n ，p e m 冲洗后将细胞切成约2 衄的小片段，在抽提液中f 1 h t o nx 1 0 0 ， 5 0 l ，瑚o l lk a ，1 m m o i ，le g t a ，o 1 m m o l ，le d t a ，4m o l l 甘油，0 5 m m o l 几m g c l 2 ， 1 m m o l ld t t ，p h 6 8 ) 振荡反应3 h 。1 m 咖ln a b h 4 中反应3 0 m i i l ，以除去多余的醛 基。5 0 m m o l l ，甘氨酸o h7 4 ) 冲洗3 0 n l i n ，在4 下，用一抗( 1 ：2 0 0 。a 确t u b l l l i n ，s i 舯a ) 孵育过夜n 次日用p e mb u 艋r 充分洗涤，移入f r r c 标记的二抗( 1 ：1 0 ，军事医学科 学院) 中，黑暗中3 7 反应2 3h ，洗涤后封片镜检。采用美国b i o r a d 公司m r c 1 0 2 4 型激光共聚焦成像系统，氩一氪激光发生器( k r y p 自叫衄o n ) ( 1 5 m w ) 激发波长4 8 8 浙江大学硕士学位论文( 2 0 晒) n m ，观察骨架。 1 1 3 细胞骨架图像分析的现状 目前，细胞骨架的研究，大多选取细胞骨架中的f a c t i i i ，通过荧光染色得到骨 架图像进行分析。依靠人眼对图像进行观察，得出一些定性的骨架分布特征。 1 1 3 1 定性分析方法 内皮细胞骨架 有研究发现，内皮细胞微丝的改变与内皮层通透性的调节性能密切相关，对于 维持内皮细胞的屏障功能有重要意义阿h mw ，1 9 9 3 】。内皮通透性的破坏，会导致 脂质成分通过内皮层侵入内皮下沉积。形成动脉粥样硬化“t h c r o s d c r o s i s ，a s ) 斑，这 是a s 形成的前期过程，我们可以通过细胞微丝的破坏去判断a s 前期是否发生。 陈玉成【陈玉成，2 0 叫在实验中发现，氧化低密度脂蛋白( o x i d el o wd e 璐i t y 图l 一6 内皮细胞骨架 l i p o p r o t e 氓简称为o x - u ) l ) 作用内皮细胞2 4h 后，细胞形态改变明显。运用激光扫描 共聚焦显微镜，则清楚的显示了内皮细胞微丝明显破坏断裂、稀疏、分布紊乱。经 过1 7b - 雌二醇预先对细胞进行处理，骨架微丝在o x l d l 作用下仍保持了正常的形 态，分布规则且细胞外形正常。由此证明1 7b 雌二醇可抑制o x u ) l 对细胞骨架微 丝的损伤。f _ a c t i n 的变化可以作为反映某种药物对于a s 的前期治疗效果的一个指 标。旺u n i av 芷实验中证实随着o x u ) l 赴理的时间越长，细胞f - a d i l l 分布越为均 浙江大学硕士学位论文( 2 6 ) 匀f c e u n av ，2 0 0 3 】a 在宋革的研究中陆革，2 0 0 4 】，发现细胞微丝在正常情况下主要集中分布在细胞膜 周区域，细胞浆内有少许不规则的较细的纤维丝分布，呈不规则排列。经过 s 作 用内皮6 h 后，内皮细胞膜周区域的f a c l i n 致密斑减少或消失，周边的纤维致密带向 胞浆区域移位，胞浆内出现极性分布的应力纤维( s t r e s sf i b c 璐) ，表现为纤维变粗、变 短、排列整齐，均匀化。c i i c i l l a 在实验中也发现经过2 4 h 的尼古丁刺激内皮细胞，它 的微丝分布均匀程度增加，而在内皮细胞里面预先加入抗体抑制，则不会出现骨架 均匀化分布的状态【c u c i n aa ，2 0 0 0 】。琢出也发现y 2 7 6 3 2 m l 7 可以使内皮细胞微 丝状态改变【y 0 k o m 嘶2 0 0 4 1 。 系膜细胞骨架 唐万欣【唐万欣，2 0 0 4 】实验中，经过高糖作用7 2 j l 的肾小球系膜细胞骨架荧光染色 强度明显下降，表明高糖有可能导致f ，删n 解聚，改变其细胞微丝的空间排布，从而 图1 - 7 系麒细胞细胞骨架 影响了系膜细胞的相关功能。用胰岛素加高糖处理的系膜细胞中，f - w d n 荧光强度上 升，可见胰岛素对高糖引起的f _ 珊i 解聚有一定的逆转作用。高糖导致细胞骨架解聚， 导致系膜细胞收缩功能失调，造成早期肾小球的高滤过状态。 癌细胞骨架 蔡军【蔡军，2 0 0 3 】在实验中发现经过舢2 0 荆激的胃癌细胞，原有的细胞骨架网络 结构完全被破坏，4 8 h 分布均匀化，9 6 h 局部出现高亮区域。经c d “v 6 处理2 4 h 后的 大肠癌细胞，细胞骨架构像发生变化，呈解聚状态，荧光强度减弱，细胞骨架在细 浙扛大学硕士学位论文( 2 0 0 6 ) 胞膜周集中分布的现象即“环状”结构消失，并分散于细胞浆由【李祖国，1 9 9 8 】。与正 常h e l a 细胞相比，转染了m s e 蚴p 2 的h c l a 细胞，其细胞骨架呈解聚状态，荧光强 度减弱，细胞骨架在细胞核周集中分布的现象消失【王华，2 0 0 3 l 。微丝的完善程度与 肿瘤的转移潜能呈负相关f 张红英，2 0 0 2 】。说明通过观察细胞微丝结构，可以预测肿 瘤，癌症的转移状况。 其他细胞 在具有t a n 西e f 病的病人，其巨噬细胞和成纤维细胞的细胞骨架比正常情况下更 为分散和且荧光强度更低【h i n n 鸭2 0 0 0 】。细胞骨架可以使人类的嗜中性粒细胞的“环 状”现象更明显。甲酰三肽使细胞骨架分散。在经过反应蛋白预处理的细胞，对甲 酰三肽的分散作用有抑制【蹦s 廿n e ，2 0 0 4 1 。经过黄草消处理轮藻细胞4 0 m i n ，骨架解聚， 网络结构消失，微丝散乱排布，细胞停止生长【于荣，2 0 0 4 1 。野生型首蓿银纹夜蛾核多 角体病毒( a c p v ) 抑制染草地夜蛾细胞出现调亡，使细胞微丝出现环状现象 【a j “a i i d r a k 2 0 0 3 1 。在肥大心室细胞和凋零中，心肌细胞细胞骨架都呈现比正常细胞 更为均匀的分布状态【功u i a ，2 呻2 j 。a 平滑肌细胞骨架由于受到葡萄状腺激素的刺 激【l e m u u o 迟1 9 9 6 】，其分布发生改变。细胞骨架图像可以反应出某种药物的治疗效果： 限制过量的白细胞粘连i b a r b a r an c b e ，2 0 叫。 上述研究细胞骨架图像的方法，大都还停留在定性处理的层面上。以描述性的 语言进行判定细胞骨架的形态分布，比较模糊，不是十分精确。为了进一步研究细 胞骨架，也有部分研究进入了定量阶段，通过结合计算机技术对细胞骨架特征的进 行统计定量分析。常用的算法有；灰度统计，结构信息分析，形态学研究，灰度共 生矩阵等。 1 1 3 2 定量分析方法 灰度统计 选取单个心肌细胞骨架图像，分析其中的灰度统计特征。以此来说明细胞骨架 1 0 浙江太学硬士学位论文( 2 6 ) 的变化情况。 1 方差 其中 卢荟( i ) p ( i ) 为像素点的灰度 这是反映图像灰度值分布离散性的度量 2 偏度 专薹焖 灰度偏度反映了灰度偏离均值对称情况的程度。 ( 1 - 1 ) ( 1 - 2 ) ( 1 - 3 ) 3 峰度 啦- 专羹黼) ( 1 4 ) 该参数度量灰度是集中在均值附近，还是分布在两端 这三个参数能很好的定量反映细胞骨架的不同【姚宇华，2 0 0 5 】。 结构信息分析 提取出骨架的外边缘轮廓，从细胞结构的构型特征进行分析。记录在一个正交 方向上其灰度的变化情况，比较这两个方向上的变化曲线情况。通过欧拉数和多边 形角度的变化来量化细胞骨架图像结构的变化。将图像作二值化处理，提取出骨架 的纤维结构，统计在水平方向上的夹角来反映图像的不同。将模糊的图像反映成具 体的数据，便于比较和分析f i s m a c lb u i o ，1 9 9 8 】。 基于形态学上的参数【f 眦m l al 2 0 0 5 】 采用形态学上的算子，对骨架细胞图像进行分析，反映的是图像纹理不规则性 和复杂度的特征。它的优点在于既不易受灰度均值的影响，又不会因图像尺度的改 1 1 浙江大学硕士学位论文( 2 0 嘶) 变而产生大的变化，可以说比较适于分析细胞显微图像。f u m a f o l al 在自己的研究中， 选择了r u 蟠于1 9 9 4 提出的算法。 ，= i _ 州_ d f p r l h 矿f o | _ 1 5 幽广 n 6 1 t v 是正态梯度，u q 是正态拉普拉斯算子，d f p 【，1 表示不规则图形的维数， d f m 【- 】为高阶分析维数。将肝细胞的结构图像，运用p c a ( 主成分分析) 识别图 像，运用上述算法将其形态学参数计算出来。 灰度共生矩阵法 姚字华等研究模拟微重力条件下心肌细胞骨架中微管的形态变化，利用图像的 灰度共生矩阵参数量化该变化。对模拟微重力条件下培养的心肌细胞( 回转组) 和 静置条件下培养的心肌细胞( 对照组) 的微管图像提取敏感的灰度共生矩阵特征参 数，并利用这些参数评价槲皮素对抗细胞的微重力反应的药物效果。结果表明微重 力环境中微管图像的纹理均匀性变差，槲皮素对细胞的微重力反应有一定的对抗作 用。发现模拟微重力条件下心肌细胞骨架中微管的形态发生弥散性变化图像的灰 度共生矩阵参数能很好地描述该变化，同时证明槲皮素能部分恢复这种弥散性变化 【姚字华，2 0 0 3 】。 对比度参数 c ( d ，一) = j 1 2 p ( i i 矗，一) 。， 局部平稳 d ( d ，p ) = 吾了扫( j l d ，8 ) ( 1 6 ) ( 1 - 7 ) 差熵 以一，= 一手p l 一，姒一峨一r ( 1 8 ) 浙江大学硕士学位论文( 2 6 ) 惯性矩 必d ，p ) = ( 1 一j ) 2 p ( i j i d ，p ) ， 1 2 研究课题的提出 ( 1 - 9 ) 通过实验研究发现。细胞在受到外界某些因素刺激的时候，它的细胞骨架形态 会发生很大的改变。因此通过对细胞骨架形态的分析，可以对细胞状态进行一个有 效的评价。大量实验证明通过r 枷n 图像是能够反应出细胞所处的生理状态的。 本课题从定量研究的角度出发，用空间灰度共生矩阵法研究纹理结构，得到整 个细胞里面的骨架分布状况：通过研究细胞骨架图像的特征，提出用骨架膜周参数 作为特征参数进行分析。依靠本实验室已有的数字图像分析处理技术的基础，建立 细胞骨架图像分析系统，为细胞生物学研究人员提供一种细胞骨架图像定量评价技 术。 本课题研究内容 ( 1 ) 通过阅读大量文献和研究细胞骨架图像本身，提出膜周参数结合灰度共生矩 阵参数定量分析细胞骨架形态。 ( 2 ) 利用数字图像处理技术，采用基于面向对象方法的m i c r 0 f tv i s u a lc + + 6 o 作为系统的开发平台实现细胞骨架分析处理系统。 ( 3 ) 应用一组细胞骨架受到药物影响的实验图像对系统进行了测试，以验证系统 的可行性。 浙江大学硬士学位论文( 2 6 ) 2 1 引言 第二章细胞骨架图像分析算法的设计 细胞骨架是细胞的微观结构，可通过荧光共聚焦显微镜的观察。可以根据对细 胞生物学研究中各种状态下细胞骨架图像的观察分析，一般认为细胞骨架的膜周集 中化则表示细胞处在正常的生理状态下；而骨架成分分布均匀化则属于细胞的病理 状态；而细胞处于更严重的破坏状态，则细胞骨架在细胞质中出现不规则的高度集 中区域。而且除了空间分布的改变，处于不同生理状态的细胞，其细胞骨架的纹理 结构也是不相同的。这种对细胞骨架特征的定性描述，难以准确反应细胞生理状态 的差异，也不利于对研究成果的交流和比较。应用图像处理技术，对细胞骨架图像 进行处理和参数化定量分析，可为细胞生理学提供一种定量客观的技术手段。本课 题的研究主要通过膜周分析和灰度共生矩阵作为特征参数来分析细胞骨架图像。 2 2 膜周分析基本算法 正常细胞骨架分布有趋于膜周集中化的特点；异常细胞骨架具有弥散性变化：分布 趋于更均匀，分散；破坏严重的细胞，其骨架在胞质内出现不规则的高度集中区域。 提出膜周参数来描述这种骨架分布特点，将细胞骨架分为中央区和膜周区( 如图2 所 示) ：膜周区定义为从细胞边缘向内一定距离的区域即不规则双环区内部，中央区 定义为膜周区内层包围的区域。膜周区内的骨架结构的密度记为c d r a ( c ”o s k e l e t o n sd 曲s i t yi nr i i l ga r e a ) ，中央区内骨架结构的密度记为c d c a 1 4 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 6 ) ( c ”o s k e l e t 叫sd l e 璐i t yi nc e n t e ra r c a ) 。 圈p 1 不规则双环图 定义膜周参数p 缸p c d - m e m b r 粕c ) ： 删黑 c d 翻 、 则该参数能够描述细胞骨架在膜周相对集中分布的特点。其中膜周的宽度按照公式 ( 2 - 2 ) 求解得到： 2 2 1 多边形面积算法 ( 2 2 ) 膜周参数计算中，涉及到多边形面积的计算。由于多边形可以分解为多个三角 形来计算，因此计算多边形面积首先讨论三角形面积问题【和青芳2 6 1 。 假设三角形三个顶点坐标为( x 1 ，y 1 ) ，o y 2 ) ，( x 3 ，y 3 ) ，通过( x l ，y 1 ) ，( x 2 ，y 2 ) 的直线 方程为： ：一_ ) ，。沁一( 屯一) y + y ，0 2 一五) + 而o ，2 一y 1 ) = 0( 2 - 3 ) 浙江大学硕士学位论文( 2 肿6 ) y( 1 1 ，y 1 ) 对一 ( x h y 3 ) 则根据点到直线的距离公式 ：匦：丝! 型 一2 + 口2 ( x 3 ，y 3 ) 到直线方程( 2 弓) 的距离就为： ( x l ，y 1 ) ，( x 2 y 2 ) 两点距离为： 则三角形面积 1 6 ( 2 4 ) ( 2 - 5 ) ( 2 q 浙江大学硕士学位论文( 2 0 0 6 ) s 。膏三x d ，x d ： s 。三l ( y ：一y ，k 一也一毛) y ，+ y ，也一鼍) + 薯：一y ，) l ( 2 - 7 ) 将公式( 2 8 ) 化简为行列式表达，则三角形的面积可以由以下的行列式计算 和兰x ( 2 - 9 ) 这个行列式也可以排成它的转置形式，即x 排成一行，y 排成行，1 排成一 行( 行列式与它的转置行列式相等) 。也可以将( 2 9 ) 去掉外面的绝对值符号，则三角 形的面积用矢量面积来表示。 假设三角形的三个顶点按逆时针方向排列，按上面的行列式计算出的值为正， 若为顺时针方向排列则计算出的面积为负。三角形方向变换时，实际上是调换了上 面这个行列式的两行。利用这个性质还可以判断判定点在有向线段的哪一侧或是否 在线段确定的直线上。 p 2 、 、， 、 p 芏 ，r ， ， p l 围2 2 向量三角形 1 7 浙江大学礤士学位论文( 2 0 嘶) 现在回到多边形面积的问题上。我们可以将多边形的每一条边看作首尾相连的环 形有向线段，然后在多边形所在平面上任取一点，该点与多边形的每一条边构成一 个有向三角形，所有有向三角形的面积之和的绝对值就是多边形的面积。对于点在 多边形内部时。这个是显然的。当点在多边形外部时我们直观的感觉是计算出的面 积会变大。但由于我们计算的是有向三角形的面积，当点在多边形外面时必然有部 分三角形与其它三角形相反，正好抵消多出来的面积。且对凹多边形也同样适用。 c1 ， j 加。i l _ h1 l 卜 ky 21 + k k l | k p 1 p 5 排针吲 ) ，o 1 ik 1 |ky o1 | p i ( 2 1 0 ) 鬈 卉 图2 - 3 矢量面积计算 2 2 2 绘制相似多边形算法 绘制多边形，用鼠标记录点下的各点，然后将各点连接，最后一点直接和第一 个点连接，就得到了一个封闭的多边形。如图2 - 4 ，在多边形绘制完成的基础上， 浙江太学硕士学位论文( 2 0 嘶) dd 图2 4 相似多边形的绘制图2 5 相似多边形绘制完成圈 将多边形么a 内角的角平分线计算出来，在角平分线上距离a 点为w 的a 点，将a 的坐标记录下来，然后循环，将每条角平分线计算出来，分别确定同样距离的w 的 点。将所有点连接起来，就得到了相似多边形如图2 5 所示。 2 3 纹理分析 纹理( t c x t u r c ) ：由紧密地交织在一起的单元组成的某种结构，作为一种重要的 物体表面特征普遍存在于自然界中，最直观的例子如水纹、木纹、指纹、布纹等。 在地质构造方面，不同类的岩层具有不同的纹理、走向和不同大小的颗粒度，在图 像上呈现不同的分布、方向、颗粒大小和粗细度的纹理。在土地利用方面，人工地 物，例如道路、居民地等具有较为规则的纹理，而自然地物则呈现不规则的、随机 分布的纹理【c h a p p a i d ，2 0 0 3 卜在病理诊断中，正常器官组织表面的纹理和发生病变的 器官表面的纹理差别很大【v 黼t mn f ，1 9 明。在细胞骨架图像中，正常细胞和异常细 胞的骨架图像纹理结构也是有很大的区别。因此纹理是图像的基本特征，是进行 图像分析特别是纹理图像的一个极其重要的信息源。与其它图像特征相比，纹理反 映了灰度模式的空间分布，包含了物体的表面信息及其与周围环境的关系更好地 1 9 浙江大学硬士学位论文( 2 0 0 6 ) 兼顾了图像的宏观结构与微观结构【u a p i ss ，2 0 0 q ，因而在图像分析中日益受到研究者 的关注。 纹理是人类知觉系统认识世界的重要手段，已经研究了4 0 年之久。在各类文献 资料中，一般将纹理分为两大类：结构纹理( 确定性过程) 和统计纹理( 随机过程) 。目 前纹理分析常用的方法大致有三种：统计方法模型方法以及基于数学变换( 信号处 理) 的方法。统计分析主要是通过统计参数来表征图像上灰度级分布的随机特征。模 型方法就是通过建立一些模型，进行特定的分析。信号处理方法则是将图像转化成 信号进行分析研究。 2 3 1 纹理分析概述 统计法图像纹理分析 共生矩阵法 寿亦萱等在研究天气现象图像中，采取灰度共生矩阵提取的纹理特征参数，用 于分析中短期天气过程，取得较好的效果f 寿亦萱2 5 j 。王新增等在分析矾花圈像 中，采用相关函数和共生矩阵，将图像参数差异对应明矾添加量不同的5 种类别，对 于工业生产有实际的应用【王新增，瑚5 】。童隆正等在分析c t 肝图像中，也采用共生矩 阵将病变和正常组织做了个较好的区分【童隆正，2 0 0 3 】。张文君在实验过程中，发现 超声心动图计算机纹理分析对于急性心肌梗死的鉴别诊断具有一定的准确性，并且 计算机图像分析超声图像的纹理变化，选用灰度共生矩阵可以进行定量研究【张文君， 2 0 0 2 1 ， 浙江大学硕士学位论文( 2 0 嘶) 灰度差分法 所谓灰度差分，就是选取局部灰度差分矩阵，其中常用的矩阵特征：能量、平 均值、角二阶矩、反差、熵、反差分矩、方差。郑磊斌等研究磁共振图像，发现m r 灰度图的纹理可以直接反映了骨小梁的网络结构，对灰度图直接进行纹理分析可以 用来评估骨质疏松现象，证实引入的纹理和结构参数确实对骨质疏松有较好的分辨 力。从局部灰度差分矩阵中提取的参数具有更强的区分性，对骨架的分析效果更为 准确【郑磊斌，2 0 0 5 l 。常发亮等在研究纸张匀度的时候将灰度方差作为特征参数进行 研究，运用改进的金字塔分析算法，验证了机器视觉的匀度与人眼匀度的一致性【常 发亮2 0 0 4 】。 灰度游程长法 简单说，灰度游程长度即为同一直线上具有相同灰度值的最大像素数目的集合。 它与灰度级数、长度、方向等因素有关。一个灰度游程长度定义为游程中像素点的 个数。灰度游程长度矩阵如( 2 - 3 所示，其中每一项p ( i j ，o ) 表示在方向e 上，灰度级为 i ，而游程为j 的次数。o 一般取o 。，4 5 。，9 0 。，1 3 5 。4 个方向。 r ( 口) = p ( i 口)( 2 1 1 ) 朱红娟等在脂肪肝病变研究中采用灰度游程长度法分析图像，选取行程长度不 均匀因子，灰度不均匀因予，短行程因子，长行程因子参数，得到了较好的定量分 析结果a 脂肪肝比正常肝的参数取值偏高【朱红娟，2 0 0 5 】。在文本o c r 识别中，李向 丰采取灰度游程长度法，将文本中笔划的宽度确定出来【李向丰，2 0 0 4 l 。在笔迹鉴别 中，这种分析方法也有很好的应用【杨子华。2 0 0 4 】。 浙江大学硕士学位论文( 2 6 ) 模型方法 基于模型的纹理分析，是通过模型参数来定义纹理，模型的参数决定着纹理的 质量。纹理模型法认为像素间存在某种相互关系，此算法的重点就在于研究这种关 系。 自相关模型 影像纹理的一个重要性质是纹理的反复性。自相关函数可用来表示纹理的粗糙 程度，光滑自相关函数能够反映影像纹理基元的空间大小。如果基元较大( 纹理粗 糙) ，则自相关函数随窗口移动下降速度较慢；基元较小，则自相关函数随窗口移动 下降速度较快。对于规则的纹理，自相关函数显示出峰值和谷值。通过自相关模型 里面的布朗运动模型，提取出一个平均斜率，作为判断刀具是否处于正常工作状态 的标准【熊四昌，2 4 】 m a r k o v 随机场模型 这一模型假设每一像元的密度与邻域像元有关，与其它像元无关。紧靠的元素 有直接交互作用，另外全局的影响也可以传播分散开来的。在纹理分析中，m a r k o v l 遁机场模型基于纹理，满足随机、静态等前提条件。 分形模型 据m a n d c l b r o t ，自相似性是分形的基本原则。分维值是分形模型中进行定量表 征的最佳工具，分形中分维值最直接的意义就是代表了表面的起伏程度。求分维值 是分形分析中的核心问题。由于地学自然分形在一定的尺度范围内呈现统计分形， 因此，在自然分形算法中多采用分维估值法。 自回归模型 浙江大学硕士学位论文( 2 0 帖) 提出一个观点，即一个像素的灰度可以通过按某种标准排列的一个像素序列的 加权和与附加的独立噪声表示。以此为基础去实现这个自回归模型去分析图像的纹 理结构。 数学变换方法( 信号处理方法) 数学变换的方法包括多种。包括空问域滤波、付立叶滤波、g a b o r 和小波模型等。 其中大多数方法是采用滤波计算某些特定的特征。 空间域滤波 早期常用边缘算子方法分析，通过各种能够检测有关影像灰度函数梯度的局部 数学算子来检测纹理，通常采用r o b c r t 算子、l 印l a c i 柚算子等；最近的研究转入以 空间矩为基础进行分析，如l a w 滤波，提出2 5 种滤波方式提取图像中的信息，如线 性，起伏等。 g a b o r 变换 g a b o r 变换是英国物理学家g a b o f 提出来的，由“测不准原理”可知，它具有最 小的时频窗，即g a b o r 函数能做到具有最精确的时问- 频率的局部化：另外，g a b o r 函数与哺乳动物的视觉感受也相当吻合，这一点对研究图像特征检测或空间频率滤 波非常有用恰当的选择其参数，g a b o f 变换可以出色地进行图像分割、识别与理解。 回红等研究了基于结构的指纹识别算法，构造了适用于指纹识别g a b o r 滤波函数 的物理模型，设计了优化的滤波器参数【回红，2 0 0 4 】。 同样，细胞骨架也具有相应的纹理结构，在受到外物刺激下，它的纹理结构会 发生改变，我们可以通过找出其中的特征参数来对它们加以区分，达到将细胞生理 浙江大学硬士学位论文( 2 0 帖) 状态区分的目的。在本论文中采用纹理分析方法中一种较常见的方法，称为灰度共 生矩阵法( 掣a y 自呲e o 咖i f e n c em a t r i 】【；g r c m ) 【h a 叫i c k ，1 9 7 3 】，灰度共生矩阵是 建立在估计二阶组合条件概率密度函数基础上的纹理分析方法。图像的灰度矩阵反 映的是图像的视觉信息，灰度共生矩阵反映的则是图像关于方向、相邻间隔、变化 幅度的综合信息。分析灰度共生矩阵可以分析图像的局部模式和排列规则。实际上 从灰度共生矩阵中可以提取出图像的很多纹理特征，如二阶矩、对比度、相关、方 差、逆方差、熵等等。金震东在实验中发现这种纹理参数对鉴别超声内镜胃粘膜下 肿瘤的图像颇有价值i 金震东，1 9 9 8 】。目前，灰度共生矩阵纹理分析有很广泛的应用， 在遥感、航片影像纹理、海浪图像分析、胸透x 射线图像分析等领域均有涉及。 2 3 2 灰度共生矩阵 所谓灰度共生矩阵就是指某方向上间隔一定距离的一对像素点灰度出现的统计 规律。根据图像中的一个像素的位置、相邻像素对之间的灰度差和距离、以及相邻 像素相对该像素的角度，可定义一个共生矩阵p ( j j ，d ，9 ) ，其中i l i 表示这对图像的像 素点的灰度值，d 是这对像素点的位移向量，0 表示连接这对像素点的平面方向。一 般d 取作1 ，2 ，3 ，4 ，5 ；o 取四种值；o o 、4 5 9 、9 0 。、1 3 5 4 。不同的d ，e 对应不 同的矩阵，当d ，o 选