耐甲氧西林金葡菌ppt课件.ppt

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 革兰阳性球菌 金黄色葡萄球菌是临床上常见的毒性较强的细菌 自从本世纪40年代青霉素问世后 金黄色葡萄球菌引起的感染性疾病受到较大的控制 但随着青霉素的广泛使用 有些金黄色葡萄球菌产生青霉素酶 能水解 内酰胺环 表现为对青霉素的耐药 科学家研究出一种新的能耐青霉素酶的半合成青霉素 即甲氧西林 methicillin 1959年应用于临床后曾有效地控制了金黄色葡萄球菌产酶株的感染 可英国的Jevons就首次发现了耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA MRSA从发现至今感染几乎遍及全球 已成为院内感染的重要病原菌之一 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的特性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的分型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的检测 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的特性 不均一耐药性广谱耐药性生长特殊性固有耐药获得性耐药 1不均一耐药性 MRSA菌落内细菌存在敏感和耐药两个亚群 即一株MRSA中只有一小部分细菌约10 4 10 7 对甲氧西林高度耐药 在50 g ml甲氧西林条件下尚能生存 而菌落中大多数细菌对甲氧西林敏感 在使用抗生素后的几小时内大量敏感菌被杀死 但少数耐药菌株却缓慢生长 在数小时反又迅速增殖 2广谱耐药性 MRSA除对甲氧西林耐药外 对其它所有与甲氧西林相同结构的 内酰胺类和头孢类抗生素均耐药 MRSA还可通过改变抗生素作用靶位 产生修饰酶 降低膜通透性产生大量PABA等不同机制 3 对氨基糖苷类 大环内酯类 四环素类 氟喹喏酮类 磺胺类 利福平均产生不同程度的耐药 唯对万古霉素敏感 3生长特殊性 MRSA生长缓慢 在30 C 培养基pH7 0及高渗 40g LNaCl溶液 条件下生长较快 4 在30 C时 不均一耐药株表现为均一耐药和高度耐药 在37 C又恢复不均一耐药 均一耐药株在 37 C或pH 5 2时 均一耐药性可被抑制而表现为敏感 增加NaCl浓度 低温孵育和延长时间 可使不均一耐药株群体中敏感亚群中的耐药性得到充分表达 即能耐受较高浓度的甲氧西林 而对其中耐药亚群无影响 5 但最近也有报道 高渗下延长培养时间 会影响MRSA的检出结果 因为在高盐情况下 培养48h 对甲氧西林敏感的金黄色葡萄球菌 methicillinsensitiveStaphylococcusaureus MSSA 易产生大量 内酰胺酶 可缓慢水解甲氧西林 导致细菌生长 而误认为MSSA 所以一般MRSA在高盐环境孵育24h 而耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌 MRCNS 由于耐药亚群菌数少于金葡菌 应孵育48小时观察结果 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的耐药机理 1固有耐药 是由染色体介导的耐药 其耐药性的产生与细菌产生一种青霉素结合蛋白 PBP 有关 产生五种PBP 1 2 3 3 和4 它们具有合成细菌细胞壁的功能 它们与 内酰胺类抗生素有很高的亲和力 能共价结合于 内酰胺类药物的活动位点上 失去其活性导致细菌死亡 而MRSA产生了一种独特的PBP 这种分子量增加了78 1000道尔顿的PBP 因其电泳率介于PBP2与PBP3之间 故称为PBP2a或PBP2 6 PBP2a对 内酰胺类抗生素亲和力很低 因而很少或不被 内酰胺类药结合 在 内酰胺类抗生素存在的情况下 细菌仍能生长 表现出耐药性 PBP2a的产生是受染色体甲氧西林耐药基因 mecA 来调节的 MRSA与MSSA根本区别在于它们的PBP不同 2获得性耐药 是质粒介导的耐药 某些菌株通过耐药因子产生大量 内酰胺酶 使耐酶青霉素缓慢失活 表现出耐药性 7 多为临界耐药 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的分型 MRSA分型对追踪传染源 研究型别与感染种类 耐药性的关系有重要作用 国外开展较早的噬菌体分型 将待测菌于肉汤中 35 C孵育6h 涂于分型琼脂平板上 待干后将23种噬菌体注入琼脂平板中的小方格内 再置35 C孵育6h后移至室温过夜观察结果 用4组23种噬菌体 将MRSA分为4群 一般以 群为最多 8 也有报告以 群为多 噬菌体分型结果常不满意 日本小粟子证实有29 3 菌株不能分型 且重复性差 不宜用于流行病学调查 质粒图谱分型较为可靠 可分为18个型 能准确地分析菌株之间的相关性 将流行菌株与非流行菌株加以区别 国内MRSA广泛存在分子量为1 6Md 1 8Md及2 67Md的质粒 不同地区和不同医院会有特殊质粒带 免疫印迹分型法将MRSA分为9个型 以B C型为最常见 各型含有特征性的分子带 该法比较稳定 染色体限制性内切酶分析可识别病原体DNA链上特异位点及核苷酸序列 能从基因水平显示病原体特征 MRSA还可用血清学 凝固酶 耐药谱等方法分型 现在Southern印迹法也逐渐运用于MRSA的分型 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的检测 由于MRSA的不均一耐药性 给其检测带来一定的困难 MRSA的检出率受孵育温度 时间 培养基的pH和NaCl的浓度 菌液的数量等多种因素的影响 因此 目前还没有一种最佳的检测方法 1纸片扩散法 K B法 2肉汤稀释 MIC 法3琼脂稀释 MIC 法4琼脂筛选法5浓度梯度 Etest 法6自动化药敏检测7DNA探针杂交8PCR技术 1纸片扩散法 K B法 平皿中MH琼脂厚度为4mm 菌液调至0 5麦氏浊度 涂沫于上述平板 甲氧西林含量5 g 片 35 C孵育24h 抑菌圈 11mm为耐药 17mm为敏感 由于MRSA通常对其它耐酶半合成青霉素也耐药 因此美国临床实验室标准化委员会 NCCLS 推荐用苯唑西林来代替检测MRSA 苯唑西林在贮存过程中药效不易降低 且对不均一耐药性检测效果更好 所以国内多数实验室都采用苯唑西林 苯唑西林含量为1 g 片 抑菌圈 10mm为耐药 13mm为敏感 11 12mm为中介 质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213 耐药菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923 敏感菌株 纸片扩散法最大优点是快速 简便 价格便宜 易被检验人员接受 在合适的抗生素及培养温度 菌液的浓度 培养基厚度等条件下 检测MRSA是可行的 但Leneastre等 9 对K B法和特异性mecA基因DNA片段法鉴定MRSA的结果进行了比较 发现在49株用K B法鉴定为MSSA的菌株 特异性mecA基因DNA片段法鉴定却有11株含mecA基因 59株用纸片法鉴定为典型MRSA的菌株 有10株却没有特异性mecA基因 这两种方法大约有18 20 的差异 Chipman 10 等研究也表明以mecA基因检测法为参考方法时 纸片扩散法的符合率为88 2 这可能与纸片法中的琼脂中没有NaCl成份 一些菌株的耐药性得不到完全表达有关 因此 为提高纸片扩散法检测MRSA的可靠性 最好在MH琼脂中加入40g LNaCl 2肉汤稀释 MIC 法 美国疾病控制中心 CDC 推荐用MH肉汤培养基加NaCl至20g L浓度 同时加入Ca Mg离子 将苯唑西林进行倍比稀释 从0 125 16 g ml 菌浓度为104 ml 35 C孵育24h MIC 2 g ml为敏感 4 g ml为耐药 该法检出率可达95 但操作较繁琐 3琼脂稀释 MIC 法 用含20g LNaCl的MH琼脂将苯唑西林倍比稀释为12个不同浓度并浇注平皿 苯唑西林量终浓度为0 125 256 g ml 再将菌液 0 5麦氏浊度 点种于含药平皿 35 C孵育24h 该法适用于大量菌株的MRSA检测 结果容易判断 重复性好 但耗时 费力 4琼脂筛选法 这是1997年NCCLS推荐的MRSA的确证试验 即MH培养基加NaCl 40g L 加苯唑西林 6 g ml 将菌液 0 5麦氏浊度 点种或画线35 C孵育24h 只要平皿有菌生长 即使一个菌落也是MRSA 该法敏感度为100 常用作校正其它方法的标准 尤其适用于检测抑菌圈直径处于中介度的金黄色葡萄球菌 5浓度梯度 Etest 法 是1988年ABBiodisk公司推出 在含20g LNaCl的MH琼脂平板上 贴上苯唑西林的试条 菌液调至0 5 1麦氏浊度 35 C孵育24h 直接读取MIC值 MIC 2 g ml为敏感 4 g ml为耐药 Etest法结合了纸片扩散法和肉汤稀释法的优点 长塑料条含有连续的呈指数梯度变化的苯唑西林 0 016 256 g ml 故在检测低水平或中等程度耐药的MRSA时结果更为准确 Novak 11 等报道 用Alamar法和Etest法对127株MRSA的检测比较 两者结果相关较高 用Etest法检测127株MRSA 其中93株MIC 256 g ml 28株在6 256 g ml 检出率达96 Etest法具有精确 可靠 稳定性好的特点 但缺点是价格昂贵 6自动化药敏检测 目前有Vitek系统 ATB系统 MicroScan系统 SensiterARIS等 将菌液稀释后注入药敏板或孔内 然后通过检测菌液浊度 荧光指示剂的荧光强度或荧光底物的水解反应来判读结果 其优点是快速 但有时对生长缓慢或延迟表达耐药性的MRSA 在3 4h内难以达到检测水平 容易漏检或误报MRSA 7DNA探针杂交 上述的方法都是检测MRSA耐药表型的方法 MRSA根据其耐药频率可分为1 2 3 4类 其耐药频率为10 7 10 4 10 3以及10 1 12 上述常规的检测方法对于3 4类MRSA一般不存在问题 但对于低频率的1 2类则很容易造成漏检 因此 对于低水平耐药或临界水平耐药的MRSA 应选择特异性高的分子生物学方法来检测 DNA探针杂交是用特异性的mecADNA片段经地高辛标记 与可疑菌株进行杂交 有学者报告 13 DNA探针仅与MRSADNA杂交 与MSSADNA无杂交带 其特异性高于琼脂稀释法 敏感性高于肉汤稀释法 而且可直接用于临床标本 无需先进行细菌分离培养 但探针较贵 保存期较短 8PCR技术 本世纪80年代末期 国外就有人用聚合酶链反应 PCR 来检测PBP2a的mecA基因 它是根据金黄色葡萄球菌TK784的mecA基因DNA序列 14 设计一引物 再裂解提取被测菌的DNA 在一定条件下进行扩增 经琼脂糖电泳后在紫外灯下观察有无与阳性对照菌株 金黄色葡萄球菌ATCC29213 相同的区带 PCR具有较高的灵敏度 只要被测菌有微量的的基因 即出现阳性结果 因此常作为检测MRSA的参考方法 陈秀枢实验表明 14 金黄色葡萄球菌耐苯唑西林的耐药水平与mecA基因有较好的相关性 MIC 4 g ml的22株菌均检出mecA基因 由于PCR很灵敏 有时会因实验室的污染而出现假阳性 为使PCR具有更高的可靠性 必须对其扩增产物进行探针杂交或测序以提高特异性 15 而有一些耐药基因是沉默基因 不表达mecA基因产物 有时会得出假耐药结论 所以分子生物学方法并非100 的敏感和特异 加上该法前期处理操作繁琐 且需要一定的设备 仅在可疑或特殊情况下做此试验 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 感染的流行概况自从1961年英国发现MRSA后 在欧美及亚洲一些国家相继报道了MRSA所致的院内感染 从60年代后期到80年代 MRSA感染率大大增加 美国NNIS报道1975年182所医院MRSA占金黄色葡萄球菌感染总数的2 4 1991年上升至24 8 其中尤以500张床以上的教学医院和中心医院为多 因为这些医院里MRSA感染的机会较多 耐药菌株既可由感染病人带入医院 也可因滥用抗生素在医院内产生 16 欧洲1993年1417家医院ICU分离的MRSA达60 17 而日本Kansai医科大学附属医院MRSA的分离率1993年达到41 国内在70年代发现有MRSA 近几年MRSA的检出率正在逐年上升 上海1978年在200株金黄色葡萄球菌中MRSA只占5 1988年上升至24 1996年激增至72 18 天津1988年调查MRSA分离率为47 19 北京医科大学附属医院1996年分离MRSA达58 3 20 山东淮坊市1996年在三家医院的婴儿室分离出金黄色葡萄球菌198株 其中MRSA为112株 56 5 21 武汉同济医科大学附院1992年分离MRSA就达79 6 22 MRSA感染多发生于免疫缺陷者 大面积烧伤 大手术后患者 长期住院及老年患者 MRSA极易导致感染的流行和暴发 MRSA传播主要通过医护人员的手 在患者 医护人员 患者间播散 另外 衣物 敷料等物品可携带MRSA 促进MRSA在院内的流行 病人一旦感染或携带MRSA 该菌可存在于患者身上达数月之久 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA 的治疗和预防 1MRSA的治疗MRSA感染的治疗是临床十分棘手的难题之一 关键是其对许多抗生素有多重耐药 因其耐药机制是PBPs 青霉素结合蛋白 性质的改变 因此 MRSA几乎对所有的 内酰胺类抗生素耐药 且在同时 还可能对大环内酯类抗生素 氨基糖苷类抗生素等多种抗菌药物表现出耐药性 目前最常用 也是疗效最肯定的抗生素为万古霉素 去甲万古霉素 替考拉宁等 其次 对于以上药物有禁忌症 或是不可耐受的患者 也可使用其他的抗菌药物 如夫西地酸钠 而在某些国家和地区 也可使用头孢吡普 替加环素