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肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法 重庆医科大学病理教研室叶秀峰 肿瘤血管生成的分子机制及常用研究方法主要内容 第一节肿瘤血管生成的基本过程第二节肿瘤微血管形态和生物学特性第三节肿瘤血管生成的调控机制第四节抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用第五节肿瘤血管生成常用研究方法 人体肿瘤大部分为实体瘤 实体瘤瘤组织由瘤细胞和间质构成 后者主要包括血管 淋巴管 结缔组织 炎细胞及细胞外基质等成分 其中血管和结缔组织起营养 支持瘤细胞的作用 肿瘤内的新生血管和淋巴管分别通过血管生成 angiogenesis 和淋巴管生成 1ymphangiogenesis 实现的 并在肿瘤的生长和扩散 侵袭和转移 中起重要作用 已有研究证明 肿瘤血管生成活跃程度对组织病理分级 放射治疗以及在预后判断上都有重要的评估价值 第一节肿瘤血管生成的基本过程一 血管生成现象1945年Algire提出了 肿瘤血管生成 tumorangiogenesis 或 血管新生化 neovasclarzation 概念 对血管生成重要性的认识 特别是提出 肿瘤生长依赖于血管生成 观点 始于1971年Folkman对肿瘤血管生成的研究报道 血管生成是指活体组织在已存在的微血管床上芽生出新的以毛细血管为主的血管系统的过程 有别于胚胎时期由早期内皮细胞分化形成新血管的过程即血管形成 vasculogenesis 二 肿瘤血管生成的基本过程 一 血管生成的基本步骤 血管生成因子的产生过多使之与抑制因子失衡 导致内皮细胞激活 产生血管生成表型 血管部位细胞外基质改变 基底膜降解 内皮细胞芽生 增殖和迁移 新生内皮细胞索形成管状毛细血管襻及管腔 新生血管管腔的贯通 二 肿瘤血管生成的过程1 肿瘤生长的阶段性 无血管期 avascularphase 或称血管前期 prevascularphase 肿瘤直径不超过1 2mm 血管期 vascularphase 肿瘤迅速生长并发生转移 2 肿瘤血管的起源肿瘤中的血管可能有3种来源 血管生成 以两种方式发生 一是肿瘤细胞团先处于无血管期生长 后因缺氧而产生大量血管生成因子 从而诱导血管生成 另一种是瘤细胞先依赖宿主组织已存在的血管生长 继而出现瘤内血管消退 然后再因缺氧诱导血管生成因子作用而发生血管生成 血管套叠性生长 内皮祖细胞 endothelialprogenitorcell EPC EPC为血管内皮细胞的前体细胞 参与胚胎的血管生成 也称为成血管细胞 EPC主要来源于骨髓 表达CD133 CD34和VEGFR2 3 肿瘤血管生成的过程瘤细胞和巨噬细胞 血管生成因子 VEGF 等 小血管或毛细血管伸展 内皮细胞迁移形成毛细血管芽 新生毛细血管形成并连通 第二节肿瘤微血管形态和生物学特性肿瘤微血管不仅在形态上不同于正常血管 而且在生物学功能上也有其特殊性 一 肿瘤微血管形态表现肿瘤组织内新生的微血管一般遍布整个肿瘤组织 但分布上并不均一 血管生成最活跃 微血管密度最高的区域被称为所谓 血管热点区 hotspots 这也是进行肿瘤微血管密度测定的选择区域 很多肿瘤的微血管新生主要分布在肿瘤生长活跃的边缘 肿瘤的新生血管分布上常常无规律 分支紊乱 管腔不规则 表现为狭窄 扩张或扭曲 新生血管呈血窦状 条索状 管壁薄 甚至仅有一层内皮细胞 或管壁很厚 但结构上仍然不完善 内皮细胞比较幼稚 细胞间常有裂隙 且缺乏基底膜 有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连 肿瘤血管的结构缺陷是这些血管具有高通透性的结构基础 也是肿瘤转移途径之一 不同类型肿瘤间质血管没有本质区别 但在形态和数量上却有不同 生长活跃的恶性肿瘤常富于血管 如内分泌肿瘤 肾癌 骨肉瘤 绒毛膜癌 破骨细胞瘤 胶质母细胞瘤和肝细胞癌等 不同肿瘤血管的形态又有一定的差异 如胶质母细胞瘤中新生血管不仅丰富 而且内皮细胞呈不同程度的增生 肥大 绒毛膜癌 肝细胞癌等血管呈壁薄 明显扩张的血窦 总之 肿瘤微血管形态特点是 遍布整个肿瘤组织 但分布不均一 无规律 分支紊乱 管腔不规则 结构上不完善 内皮细胞比较幼稚 细胞间常有裂隙 且缺乏基底膜 有时血管外的肿瘤细胞可直接与血管管腔相连 肿瘤血管的结构缺陷是其具有高通透性的结构基础 也是肿瘤转移途径之一 二 肿瘤微血管的生物学特性 低反应性 高通透性 低供氧能力 第三节肿瘤血管生成的调控机制一 血管生成因子 一 VEGF及其受体家族 二 细胞外基质与基质金属蛋白酶 三 Ets家族成员 四 纤维母细胞生长因子 FGF 家族及其受体 五 血小板源内皮细胞生长因子 PD ECGF 六 其它血管生成因子 二 血管生成抑制因子 一 大分子蛋白前体酶解片段 二 细胞因子 三 丝氨酸蛋白酶抑制剂 四 组织金属蛋白酶抑制剂 五 抑癌基因 肿瘤血管生成受多种血管生成因子 angiogenicfactors 和血管生成抑制物 angiogenesisinhibitors 的调控 肿瘤细胞 内皮细胞和巨噬细胞受缺氧刺激等使局部微环境发生变化的因素作用而合成和释放大量血管生成因子从不同环节促进血管生成 组织中同时也存在内源性血管生成抑制因子 对血管生成起抑制作用 一 血管生成因子血管生成的始动需要血管生成因子 一系列血管生成因子 细胞因子 细胞外基质和黏附分子及其抑制物 以及代谢性和机械性因子均参与了血管生成过程 一 血管内皮生长因子 VEGF 及其受体家族1 血管内皮生长因子家族血管内皮生长因子 vascularendothelialgrowthfactor VEGF 又称血管通透性因子 vascularpermeabilityfactor VPF 为分子量34 45kD的同源二聚体糖蛋白 VEGF基因通过转录水平的剪切 可产生5种变异体 即VEGF206 VEGFl89 VEGFl65 VEGFl45和VEGFl21 分别由206 189 165 145和121个氨基酸组成 其中以VEGF165最具特征性 其次是VEGF121二者均为可溶性分泌蛋白 扩散力强 易于到达靶细胞 近年又发现其他一些与VEGF功能相似 结构上有一定同源性的多肽因子 包括胎盘生长因子 placentorgrowthfactor PIGF VEGF B VEGF相关因子 VEGF relatedfactor VRF VEGF C VEGF相关蛋白 VEGF relatedprotein VRP 以及VEGF D FIGF和VEGF E等成员 它们共同构成VEGF家族 VEGF主要由血管周围的细胞产生 并通过旁分泌机制作用于内皮细胞 在促进血管形成 抑制内皮细胞的凋亡及提高血管通透性等方面发挥重要作用 2 VEGF受体类型 VEGF只有与其特异性受体结合后才能发挥生物学功能 目前 已鉴定并克隆出3种受体 即VEGF受体l VEGFR 1 又称flt 1 VEGF受体2 VEGFR 2 又称flk 1或KDR 及VEGF受体3 VEGFR 3又称flt 4 均属酪氨酸激酶受体 称为Flt家族 前两种受体一般只表达于血管内皮细胞表面 但偶尔在其它类型细胞 如肿瘤细胞中也有表达 Flt 4在胎儿早期静脉的内皮细胞上呈一过性表达 胎儿后期和出生后的内皮细胞则不再表达 在成人Flt 4只在淋巴管的内皮细胞上表达 由于Flt家族基因的表达部位不同 其配体的结合部位也不同 早期血管的形成需要VEGF的调节 它们与内皮细胞上相应的酪氨酸激酶受体结合 引起内皮细胞分裂和分化 并形成管腔样结构 在胚胎发育过程中 VEGF 主要是VEGF A 通过其受体VEGFR 1 Flt 1 和VEGFR 2 Flk 1 KDR 促进内皮分化 增殖 迁移和原始血管形成 由新形成的内皮组装成管腔样结构需要VEGFR 1的表达和激活 而VEGFR 3的表达与内皮细胞形成静脉或淋巴管有关 VEGF不仅是内皮细胞特异的强效有丝分裂原 而且能促进内皮细胞产生并调节纤溶酶原激活物及其抑制因子 增加血管通透性等特性 在血管生成中发挥重要作用 VEGF在几乎所有的人体肿瘤和肿瘤细胞株中皆有过表达 VEGF及其受体在肿瘤中的表达常与肿瘤分化程度密切相关 大多数实体瘤VEGF基因均有过表达 VEGF165 VEGF121两种VEGF最常见 在VEGF家族中 VEGF C和VEG D既可诱导血管生成 又可诱导淋巴管生成 已有研究报道 人体多种肿瘤细胞高表达VEGF C 体内转基因实验也证实 肿瘤细胞VEGF C的高表达能选择性地诱导肿瘤组织淋巴管生成 肿瘤组织中的VEGF C和VEGF D还来源于浸润的巨噬细胞 缺氧是许多细胞系产生VEGF的一个强烈的诱导因子 离体条件下 葡萄糖缺乏亦是VEGF表达的诱因 VEGF在肿瘤坏死灶周边常呈强表达 肿瘤中诱生型一氧化氮合酶 iNOS 表达水平常与VEGF呈正相关 NO与VEGF之间具有相互调节作用 多种癌基因的激活通过上调VEGF表达而诱导血管生成 失活的抑癌基因 如突变型p53基因 也参与了VEGF介导的血管生成过程 二 细胞外基质与基质金属蛋白酶细胞外基质 人体各种组织均由细胞外基质 extracellularmatrix ECM 构成支架 根据其分布部位 组成成分及功能的不同可将其分为基膜 BM 和间质结缔组织两大类 ECM成分由4大家族组成 胶原蛋白 蛋白多糖 弹性蛋白 ECM糖蛋白 目前发现ECM糖蛋白有10余种 如层粘连蛋白 纤维粘连蛋白 fibronectin FN 等 其中FN主要分布于皮肤 肌腱 血管壁和骨基质等组织 多数ECM糖蛋白具有粘附功能 这种功能的发挥与其分子内部含有的某些特殊的蛋白片段有关 通过这些片段 ECM糖蛋白就可以与细胞及ECM其它成分结合 参与细胞的粘附 迁移 生长和分化 2 基质金属蛋白酶的家族成员 随着现代基础医学科学理论和实验技术的飞速发展 大量的MMPs被发现 分离 纯化及测序 它们广泛地分布于动植物界 几乎能降解所有生物体内的ECM成分 到目前为止 MMPs家族至少包含20种酶 而且其新成员仍在继续增加 3 基质金属蛋白酶的促新血管形成作用 电镜观察显示 新的毛细血管围成环状及新合成的细胞外基质成分沉积 铺垫后 血管环前端新合成的BM就开始了MMPs所介导的蛋白水解过程 内皮细胞迁移将始于局部水解 形成一个新的毛细血管芽 随后又经历了一系列细胞外蛋白水解酶的活化与抑制的动态循环 体外细胞培养发现 当将人脐静脉内皮细胞培养于BM样物质上时 内皮细胞很快排成直线 围成管状 编织成血管网 4 MMPs在不同癌组织中的表达 人类癌组织种类繁多 研究癌细胞所产生的各种MMPs分子的特点及其在各种癌组织中的分布情况 对了解癌的浸润和转移过程有重要意义 已有资料表明 不同种类的癌细胞所表达的MMPs分子种类和表达量也不相同 例如 乳腺癌 MMP 7 8及 13表达量明显高于正常乳腺组织 5 MMPs激活与癌的浸润和转移 多数癌组织中潜在型MMP 2的激活程度是癌发生转移的重要指标 因此检测癌组织内MMP 2活化酶MT MMP对癌的治疗具有重要意义 三 Ets家族成员Ets原癌基因于1983年分别在不同的实验室中分离成功 迄今发现至少有Ets 1 Ets 2等11种Ets基因家族成员 Ets 1与新血管形成 血管周围基膜的分解和内皮细胞本身的迁移力是血管生成的两个关键因素 前者主要与MMPl有关 后者则主要与Ets 1有关 已发现的4种典型的血管生长因子aFGF bFGF VEGF及EGF都能调节人脐静脉内皮细胞 HUVECs ECV 304细胞以及人网膜微血管内皮细胞中的ets 1mRNA的表达 上述培养的细胞当受到生长因子等刺激时 2小时后其ets lmRNA的表达呈最高值 12小时后又恢复到原来水平 如用VEGF刺激培养的内皮细胞时 其DNA Ets复合物明显增多 而用VEGF和GGAA Ets功能域的竞争性抑制剂 controlcompetior 同时刺激培养的内皮细胞时 DNA Ets复合物的量则明显减少 血管生长因子作用于内皮细胞时能够引起内皮细胞Ets 1mRNA的表达 而且其作用受转录水平的调节 四 纤维母细胞生长因子 FGF 家族及其受体目前研究最为深入的是碱性成纤维细胞生长因子 bFGF 和酸性成纤维细胞生长因子 aFGF 两者在结构上是相关的 bFGF是一种广泛存在于人体各组织中的生物活性物质 被认为是血管内皮细胞 成纤维细胞 神经细胞等生长的刺激物 bFGF是体内分布广泛的生长因子之一 如脑 心 肝 胎盘和白细胞等均有存在 bFGF除分布于细胞内 还分布于许多细胞的胞膜及胞外基质中 它也可在不同肿瘤中表达 包括膀胱癌 神经胶质瘤 肝癌 胃肠癌 乳腺癌 肾细胞癌和甲状腺癌等许多培养的细胞系都可以合成它 其功能具有多样性 可促进内皮细胞的有丝分裂 趋化性和迁移 刺激内皮细胞产生胶原酶降解基底膜 诱导来源于中胚层和神经外胚层细胞的增殖和分化 bFGF也表现出亲神经性行为 促进神经元的存活和分化 bFGF和aFGF均与肝素有很强的亲和力 研究表明这种高亲和力对于FGF与细胞表达的受体结合是非常重要的 bFGF的生物学作用是通过与其特异性的细胞表面受体FGF受体 FGFreceptors FGFR 结合而介导实现的 已经识别4种FGFR 包括FGFR 1 flg FGFR 2 bek FGFR 3和FGFR 4 FGFR 1在bFGF FGFR系统中的作用最大 正常脑神经元和胶质细胞中FGFR 1的表达呈现明显的异质性 即组织中有些细胞呈现FGFR 1阳性 有些则显示阴性 血管内皮细胞亦是如此 五 血小板源内皮细胞生长因子 PDGF 血小板源性生长因子 platelet derivedgrowthfactor PDGF 是由多种细胞产生的肽类生长因子 由于其在组织修复 胚胎发育 免疫及多种常见疾病的愈复中起着重要作用 除血小板外 单核巨噬细胞系统的细胞 血管内皮细胞 胎盘和胚胎细胞 系膜细胞及某些肿瘤细胞均可产生和释放PDGF 纤维母细胞 平滑肌细胞 内皮细胞及神经细胞等多种细胞均存在PDGF受体 PDGF与细胞膜上的专一受体结合后可诱发一系列细胞内反应而发挥生物学效应 主要表现在3方面 促进细胞的有丝分裂 PDGF能刺激多种细胞如血管内皮细胞 纤维母细胞和胶质细胞等的分裂 增殖 趋化性 PDGF对纤维母细胞 平滑肌细胞和嗜中性粒细胞有趋化性 受体介导趋化反应 而 受体则抑制趋化反应 血管收缩效应 PDGF收缩大鼠主动脉的作用较经典的血管紧张素II更强烈 此外 PDGF通过影响骨骼肌中细胞骨架与细胞膜的相互作用而致细胞骨架重排 还参与胚胎的发育和生长以及中枢神经系统发育过程 六 其它血管生成因子舒血管素 Angiotropin 血管新生素 Angiogenin 表皮生长因子 转化生长因子等也能刺激内皮细胞生长 此外 缺氧是肿瘤和非肿瘤性疾病血管生成的重要刺激因素 缺氧诱导的相关转录因子包括缺氧诱导因子 1 2 hypoxiainducingfactor l 2 HIF 1 HIF 2 和NF B 其中以HIF l在血管生成中的作用最为重要 血管生成因子 二 血管生成抑制因子体内存在内源性的血管生成抑制因子 它们通过影响血管生成过程的各个环节发挥抗血管生成的活性 血管生成抑制因子大致可分为7类 大分子蛋白前体酶解片段 细胞因子 丝氨酸蛋白酶抑制剂 含TSPI型重复模序的血管生成抑制因子 组织金属蛋白酶抑制剂 抑癌基因及其它血管生成抑制因子 一 大分子蛋白前体酶解片段这些大分子蛋白前体分别来源于血浆 如纤溶酶原 抗凝血酶 和胞外基质 如胶原蛋白 基底膜蛋白多糖 纤连蛋白 1 纤溶酶原酶解片段 血管生成抑制素血管生成抑制素 angiostatin 是最先发现的内源性血管生成抑制因子之一 它是纤溶酶原的蛋白酶解产物 最初在Lewis肺癌小鼠的血清和尿液中分离得到 血管生成抑制素特异作用于内皮细胞 它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移 并诱导内皮细胞凋亡 它通过与细胞表面的受体结合发挥作用 已发现的血管生成抑制素受体 ATP合成酶的 angiomotion和整体联蛋白 5 3 2 抗血管生成性抗凝血酶 antiangiogenicantithrombin aaAT 研究表明aaAT是切除了羧基端环的抗凝血酶 aaAT可特异性地抑制内皮细胞的增殖 而不作用于其它正常细胞或肿瘤细胞 aaAT对血管生成的抑制作用有剂量依赖性 3 内皮细胞抑制素 endostatin 它可以抑制内皮细胞的增殖和迁移 并诱导内皮细胞凋亡 内皮细胞抑制素主要的抗血管生成活性是通过抑制内皮细胞迁移实现的 它可与内皮细胞表面的 5 1整联蛋白结合 抑制FAK的激活 进一步影响其下游ERKl p38MAPK的活化 从而抑制细胞的迁移 影响细胞的存活 内皮细胞抑制素还可以诱导内皮细胞凋亡 二 细胞因子IFN IFN IFN 和IL 12 IL 18是具有多种功能的调节性细胞因子 对肿瘤有直接的抑制作用 近年来的研究发现它们也可以通过间接的作用方式抑制血管的生成 来达到抗肿瘤的目的 它们可以通过下调VEGF和FGF等生长因子的表达水平来发挥抑制血管生成的活性 白细胞介素 12 IL 12 则是通过提高IFN 的表达水平 引致IP 10水平增高来发挥其抗血管生成的功能 三 丝氨酸蛋白酶抑制剂 Serineproteaseinhibitor Serpin 丝氨酸蛋白酶抑制剂超家族是由一系列具同源性的蛋白质组成的蛋白质家族 某些Serpin家族成员有抑制血管生成的活性 这些成员包括PEDF pigmentepithelium derivedfactor maspin 血管紧张素原等 PEDF是眼内最重要的血管生成抑制因子 它抑制血管生成的作用主要是通过诱导内皮细胞凋亡实现的 它特异性作用于激活的内皮细胞 而不会影响静止的内皮细胞 四 组织金属蛋白酶抑制剂 tissueinhibitorofMMP TIMP TIMP是体内天然存在的金属蛋白酶抑制物 包括TIMP 1 TIMP 2 TIMP 3 TIMP 4 TIMP在两个阶段对MMP的活性进行抑制 一是在MMP酶原活化阶段 TIMP与MMP形成稳定的复合物 抑制其自我活化 二是在MMP活化之后 与其按照1 1的比例结合 对其活性进行抑制 五 抑癌基因 Tumorsuppressorgene 1 p53p53突变是肿瘤中最常见的基因突变 p53基因编码的产物P53蛋白是一种转录因子 它通过调节下游靶基因的转录 表现出多种生物学功能 其中之一是抑制血管生成 P53的靶基因中包括多种调节细胞周期和细胞凋亡的基因 它通过激活这些基因的转录 导致内皮细胞生长周期停滞并促进内皮细胞的凋亡 P53还通过影响血管生成调节因子VEGF的水平抑制血管生成 2 VHLVHL综合征 vonHippel Lindaudisease 是一种以多个器官发生肿瘤为特征的遗传性疾病 它的致病原因是VHL抑癌基因的种系突变 与VHL综合征相关的肿瘤 如视网膜血管瘤 小脑血管瘤 脊柱血管瘤等都是高度血管化的肿瘤 靶向阻断小鼠肝脏的VHL基因 会导致小鼠肝实质血管化程度加强 这些现象提示我们 VHL可能有抑制血管生成的作用 3 PTEN研究发现PTEN可以下调血管生成因子VEGF的表达 这一结果说明PTEN有抑制血管生成的作用 第四节抗血管生成疗法在肿瘤治疗中的应用血管生成是肿瘤 糖尿病性视网膜病 风湿性关节炎 动脉粥样硬化 慢性炎症等血管增生性疾病的重要病理特征 抑制血管的生成对这些疾病的治疗有重要的意义 Fo1kman在1971年提出血管生成与肿瘤的生长和转移密切相关 可以通过抑制肿瘤的血管生成达到治疗肿瘤的目的 在肿瘤生长的最初阶段 肿瘤细胞可以通过扩散的方式吸收营养 但肿瘤的体积达到2 3mm3时 由于缺乏足够的营养和氧气 其生长受到限制 此时肿瘤细胞的增殖和死亡达到平衡 肿瘤处于休眠状态 几乎不会发生转移 这种状态可能维持长达数年之久 此后 在某些因素 缺氧 癌基因 的诱导下 血管生成因子处于上调状态 并且 或者 血管生成抑制因子处于下调状态 打破了两者之间的动态平衡 使得血管生成机制处于开启状态 开始血管生成的过程 新生血管为肿瘤的继续增殖提供了充足的氧气和营养物质 使肿瘤得以快速生长 绝大多数实体瘤和血液系统肿瘤的生长都需要有血管的生成 原发瘤的血管生成过程也为肿瘤细胞进人血液循环 转移到其它器官提供了机会 因此血管生成不仅是肿瘤生长的前提条件 也是促进肿瘤转移的重要因素 与传统的以肿瘤细胞为靶点的治疗方法 放疗 化疗 相比 血管生成抑制剂以肿瘤血管内皮细胞为靶点 具有低毒 广谱及不易产生抗药性的优点 一 血管生成抑制剂在肿瘤治疗中的应用近年来以血管为靶点治疗肿瘤成为肿瘤研究的热点之一 血管生成过程的各个环节都可能成为抗血管生成的潜在靶点 肿瘤的血管生成受到多种血管生成因子的调控 VEGF是其中作用最强 专属性最高的血管生成因子 这使它成为抗血管生成药物研究的热点之一 目前有多种针对VEGF VEGFR及其信号转导途径的药物在研究之中 此外还开发了多种针对其它生长因子及MMP的小分子药物 其中某些已进入临床试验阶段 二 内源性血管生成抑制因子在肿瘤治疗中的应用目前已进入临床试验阶段的内源性血管生成抑制因子包括血管生成抑制素 内皮细胞抑制素等 以内皮细胞抑制素为例 在以Lewis肺癌小鼠为模型的体内抑癌实验中 内皮细胞抑制素使肿瘤完全消退的剂量是20mg kg d 而血管生成抑制素的用量则高达100mg kg d 内皮细胞抑制素的高效抑瘤活性使它成为第一个进入临床试验的此类血管生成抑制因子 采用注射重组血管生成抑制因子的方式治疗肿瘤存在某些局限性 需长期用药 重复注射 用量高 成本高 蛋白不易获得 所以采用血管生成抑制因子进行基因治疗的方式越来越受到重视 采用基因疗法治疗肿瘤 基因可在体内长期表达 不需在短期内频繁注射 药物用量少 成本低 较蛋白疗法有更大的应用潜力 有人将带有内皮细胞抑制素基因的质粒载体对小鼠进行肌肉注射 观察到血清内皮细胞抑制素水平升高 小鼠脑转移肿瘤生长显著减慢 三 抗血管生成疗法的发展趋向虽然已经有数种血管生成抑制剂进入了临床试验阶段 但它们在人体实验中所显示的抑瘤效果并不如动物实验所显示的结果理想 这说明体内特别是肿瘤的血管生成过程是一个有多种因素参与 多条信号通路调控的极其复杂的过程 单独使用某种血管生成抑制因子或是阻断与血管生成相关的某条信号通路并不能完全阻断血管的生成 如果可以尝试将几种作用机制不同的血管生成抑制因子 如血管生成抑制素与内皮细胞抑制素 联合应用 应该会取得较单独使用一种因子更好的效果 此外 抑制肿瘤的血管生成 可以增强肿瘤细胞对放化疗的敏感性 因此将抗血管生成疗法与放化疗联合应用 有望取得更好的治疗效果 Folkman的理论为肿瘤的治疗开辟了一条崭新的道路 抑制肿瘤的血管生成 阻断肿瘤的营养供给 可导致肿瘤的萎缩 退化 同时 抑制肿瘤新生血管生成 还可以阻断肿瘤的血道转移 抑制转移瘤的生长 用血管生成抑制剂治疗肿瘤具有高效 低毒的特点 不易产生耐药性 还可以增强放疗 化疗的效果 减少放 化疗的剂量 降低毒性 因此 抗血管生成疗法在肿瘤的治疗中有广阔的应用前景 第五节肿瘤血管生成常用研究方法第一部分体外实验第二部分体内实验第三部分整体实验 第一部分体外实验1 血管内皮细胞分离培养方法2 内皮细胞增殖实验3 胎盘血管培养实验4 肿瘤微血管密度计数5 连续切片三维重建6 微血管铸型法7 扫描共聚焦显微镜三维重建8 血管内皮迁移实验9 小管形成实验10 器官培养测定实验 第二部分体内实验1 鸡胚绒毛尿囊膜实验2 角膜微囊实验3 海绵植入实验4 圆盘血管生成系统5 基质胶栓实验6 海绵 基质胶实验 第三部分整体实验1 斑马鱼实验模型2 爪蟾蝌蚪实验模型3 肿瘤模型 第一部分体外实验1 血管内皮细胞分离培养方法微血管内皮细胞分离方法主要有3种 包括酶消化法 机械分离法和磁珠分离法 最常用的是酶消化法 酶消化法的优点是分离的细胞多 纯度较高 缺点是酶对某些表面蛋白有破坏作用 后两种方法可以避免酶对内皮细胞的损伤 缺点是其他细胞的污染可能性较大 下面以酶消化法为例 第一步分离血管内皮细胞的分离是将剪碎的组织浸泡在消化酶中 因酶的消化一般是由外向里 所以最后被消化下来的细胞才是内皮细胞 因此 彻底地消化组织是获得足够微血管内皮细胞的前提 且非血管内皮细胞的污染是不可避免的 为了能分离获得足够的微血管内皮细胞 采用过量的酶消化是必要的 第二步细胞的纯化血管内皮细胞的分离过程中必然伴随非血管内皮细胞的污染 因此血管内皮细胞的纯化是决定血管内皮细胞培养成功与否的关键 也是血管内皮细胞培养的技术难度所在 目前已经建立了多种微血管内皮细胞纯化的方法 血管内皮细胞纯化的方法主要有 1 用尼龙网或不锈钢网筛过滤细胞悬液 2 物理刮除法 3 生长特性选择法 4 局部消化法 5 差速黏附法 6 免疫磁珠法等 可以根据不同细胞的培养特性或生物特性选择其中几种方法进行纯化 第三步内皮细胞的鉴定目前为止 还没有发现不同器官组织的血管内皮细胞具有共同的特异蛋白或标志 因此 血管内皮细胞的鉴定大多是根据器官和组织的起源 从形态 表型 生化和功能等方面进行综合评价 血管内皮细胞一般呈单层生长 有接触抑制现象 呈典型的铺路石状 电镜下可以看到Weibel Palade小体 其表面可以表达CD31 CD34 凝血调节蛋白和第 因子等 可以摄取低密度脂蛋白 产生前列腺素 PGI2和PGE2 表达E 选择素 内吞功能 结合植物血凝素 形成毛细血管样网络 不管利用那种方法 培养的内皮细胞都可根据某些特征进行鉴定 内皮细胞可以利用其表面表达血管紧张素合成酶 摄取乙酰化低密度脂蛋白及第 因子的表达进行鉴定 内皮细胞在培养条件下可以形成管形 像原始血管形成或损伤后血管再生 这被认为是内皮细胞独有的特征 但有报道说培养的上皮也可以形成管形 因此 一般情况下研究者们采用最有利的方法获得高纯度的内皮细胞 并用多种方法进行鉴定 血管内皮细胞的培养要点根据血管内皮细胞的生长特性 需要采用一些特殊的培养条件 并且这些培养条件可能因为血管内皮细胞的起源不同而有所差异 血管内皮细胞的培养一般选用DMEM M199等基础培养基 pH7 2 添加150mL L 200mL L的胎牛血清 1000单位 mL双抗 20g L谷氨酰氨 还需添加内皮细胞生长因子 一般添加浓度为1 根据其接触抑制现象需及时进行传代培养 2 内皮细胞增殖实验2 1内皮细胞增殖检测血管内皮细胞的增殖是血管发生的重要步骤 目前 已有多种成熟的细胞增殖测定方法 如四氮唑盐还原法和 3H 胸腺嘧啶掺入法等细胞增殖测定方法 2 1 1四氮唑盐还原法 又称MTT比色法 是一种最常用的检测细胞存活和生长的方法 活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶使外源性MTT还原为蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中 而死细胞无此功能 MTT结晶形成量与细胞数成正比 该方法已被用于检测内皮细胞增殖 并广泛用于一些生物活性因子的活性检测 大规模的抗肿瘤药物筛选 细胞毒性实验以及肿瘤放射敏感性测定等 2 1 2 3H 胸腺嘧啶掺入法是一种更好的测定细胞增殖的方法 将同位素氚标记的胸腺嘧啶核苷 3H TdR 作为DNA合成的前体掺入到增殖细胞中 通过放射自显影观察细胞增殖情况 2 2血管生成调控因子 生长 抑制因子 的检测血管生成调控因子很多 但多数都是蛋白质 根据实验条件和需要可以从核酸水平或蛋白质水平进行检测 2 2 1血管生长 抑制 因子核酸水平检测RT PCR检测血管生长 抑制 因子的mRNA表达 是以RNA为起始膜板产生cDNA 再以cDNA为膜板进行PCR扩增 获取目的基因或检测基因表达 略 2 2 2血管生长 抑制 因子蛋白质水平检测2 2 2 1酶联免疫吸附试验 ELISA 定义 用酶标记抗原或抗体检测液体 血液 细胞液 中未知抗体或抗原的方法 用于检测体液中的血管内皮生长 抑制 因子 分类 间接法 IndirectELISA 将已知抗原吸附于固相载体 酶标记二抗检测液相中未知抗体双抗体夹心法 SandwichELISA 将已知抗体吸附于固相载体 酶标记一抗检测液相中的可溶性抗原竞争法 CompetitiveELISA 将已知抗体或抗原吸附于固相载体 酶标记抗原或抗体检测液相中的可溶性抗原或抗体 2 2 2 2免疫组织化学 免疫荧光标记 定位或半定量 免疫组织化学 略 免疫荧光组织化学原理 根据抗原抗体反应的原理 先将已知的抗原或抗体标记上荧光素 再用这种荧光抗体 或抗原 作为探针检查细胞或组织内的相应抗原 或抗体 在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素 荧光素受激发光的照射 由低能态进入高能态 而高能态的电子是不稳定的 以辐射光量子的形式释放能量后 再回到原来的低能态 这时发出明亮的荧光 黄绿色或橘红色 用荧光显微镜可见荧光所在的组织或细胞 从而确定抗原或抗体的性质和定位 以及用定量技术测定含量 2 2 2 3免疫印记 Westernblot 基本原理 免疫印迹又称Western印迹 Westernblot 与DNA的Southern印迹技术相对应 两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体 通常为NC膜 然后用探针检测特异性组分 不同的是 Westernblot所检测的是抗原类蛋白质成分 所用的探针是抗体 它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原发生特异性反应 该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点 具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测 以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性 该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记 Westernblot的过程分四阶段 a 蛋白样品的制备及蛋白样品浓度测定b SDS 聚丙烯酸胺凝胶电泳 SDS PAGE c 蛋白质的电转移 转膜 d 靶蛋白的免疫学检测 杂交 2 2 2 4流式细胞仪检测 流式细胞仪检测范围 细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量 细胞结构 特异性抗原 细胞表面 胞浆 核 细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体 细胞功能 定性和定位 免疫组织化学 免疫荧光标记定量 ELISA Westernblot及流式细胞仪检测 3 胎盘血管培养实验特点 该实验模型不需要加外源性生长因子 该模型是筛选人类血管生成潜在激活增强因子和抑制因子行之有效的体外实验模型 实验步骤 1 从剖腹产手术24小时之内的人胎盘顶端表面截取约长2 5cm 直径为l 2mm的表浅血管 洗去血污 浸入Hank平衡盐溶液中 2 将血管培养在48孔培养板中 可在孔中分别加入各种血管生成因子 再加l99培养基 将血管片段在凝固前迅速加入培养孔中央 理想的是使血管片段悬浮于培养胶中 3 然后将培养板置37 保湿孵育培养14 21天 每周换培养基2次 4 用减数成像系统计算原来血管条生成的血管索数量 每隔一天计数新生长形成的微血管条数 由此描绘微血管生长曲线 5 用免疫组化 流式细胞仪 电镜等分别检测了CD34 Weibel Palade小体标志物等 证实新生血管中含有内皮细胞 4 肿瘤微血管密度计数 MVD 用CD31或CD34等抗体在组织切片上对血管内皮细胞进行免疫组织化学标记 血管内皮细胞质呈棕黄色 MVD计数 先在低倍视野内找到微血管密度最高的区域 然后在高倍视野内计数微血管的数目 分辨不清或染色模糊的细胞不计入结果 单个的棕黄色内皮细胞或细胞簇作一个血管计数 但肌层较厚及血管腔面积 8个红细胞直径的血管不计数 计5个视野的MVD 取其平均值作为MVD MVD可以作为肿瘤血管生成的形态学指标 提示肿瘤生长 侵袭和转移潜能 5 连续切片三维重建法物体切片二维参数为人们提供了物体某一截面的二维信息 如果将物体不同截面上的二维图像按照截面的空间关系依次排列 便可组成物体的三维数据 连续切片的计算机三维重建技术是对某一结构进行连续超薄切片 然后把这一系列切片的图像 通过计算机进行处理 从而得到该结构的立体形态的一种方法 在利用计算机图像处理理论 图形生成理论以及视觉心理学 在二维平面上形象地显示物体的三维图像 这就是计算机三维重建过程 该技术包括 1 连续切片技术2 二维图像的处理技术3 三维重建技术 6 微血管铸型法原理 将铸型材料 聚甲基丙烯酸甲酯 灌注到动物体内 生前经左心室插入导管至升主动脉 灌注12 24小时后处死动物 10 福尔马林固定2 3天后 用24 盐酸腐蚀掉组织 留下血管 离子镀膜机镀金 扫描电镜下观察微血管情况 微血管铸型材料采用聚甲基丙烯酸甲酯 聚甲基丙烯酸甲酯是一种高分子合成树酯 它是由甲基丙烯酸甲酯通过聚合反应生成 单体是液态 聚合体是固态 聚合反应过程分为引发 发展和终止阶段 单体加入引发剂后 产生活化中心 即为引发阶段 放射性骨坏死边缘的微血管铸型图 7 激光扫描共聚焦显微镜三维重建法激光扫描共聚焦显微镜是在荧光显微镜成像基础上加装了激光扫描装置 利用计算机进行图像处理 把光学成像的分辨率提高了30 40 使用紫外或可见光激发荧光探针 从而得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像 在亚细胞水平上观察诸如Ca2 pH值 膜电位等生理信号及细胞形态的变化 成为形态学 分子生物学 神经科学 药理学 遗传学等领域中新一代强有力的研究工具 激光共聚焦成像系统能够用于观察各种染色 非染色和荧光标记的组织和细胞等 能够进行活体细胞中离子和PH值变化研究 神经递质研究 荧光原位杂交研究 FISH 细胞骨架研究 基因定位研究 原位实时PCR产物分析 荧光漂白恢复研究 FRAP 胞间通讯研究 蛋白质间研究 膜电位与膜流动性等研究 完成图像分析和三维重建等分析 共聚焦显微镜的分辨率超过普通光学显微镜 染色过程简便 可以在活细胞上进行无创伤性的染色 最大程度地维持细胞的正常形态 多种自发性的荧光染料 已被广泛地用于诸如RNA DNA细胞核 线粒体 内质网 肌动蛋白 细胞膜等结构的标记 运用免疫荧光技术 将不同波长的两三种荧光物质标记在内部不同结构的相应抗体上 以这几种荧光物质特定的光谱特性选择激发光和滤光片 则可以观察到细胞内部各结构间的毗邻关系 共聚焦显微镜生成厚度小于0 2微米的依次相连的光学切片 即使较厚的组织的三维数据也可被计算机获取 运用适当的图像分析软件 可以测量并确定所观察结构的表面特征 体积等参数 为相互结合定量测量提供了新手段 激光扫描共聚焦显微镜可以将各层面的微血管图像进行三维重建和处理 从而 可以分析微血管的三维立体特征及其空间关系 8 血管内皮迁移实验目前 对血管内皮细胞迁移的影响 已经有很多有效的测定方法 其中以改良的BoydenChamber或Transwell法最常用 这些方法均是通过观测穿过一定孔径 如8 m 硝酸纤维素薄膜的细胞数量 确定细胞迁移能力 8 1BoydenChamber实验 Boyden室由两层组成 两层之间为胶原包被的多孔的多聚碳酸盐滤膜 血管内皮细胞放于上层 同时加入待测药物 共同培养6h后 除去上层的细胞 下层细胞用甲醇固定 HE染色 光镜下计算下层的血管内皮细胞数 该方法优点在于它对药物浓度梯度差异很敏感 但对实验技术要求较高且计数方法不同可能会造成统计结果误差较大 因此有必要建立一个严格的计数标准以减少因方法不同产生的误差 8 2Transwell实验 这项技术的主要材料是Transwell小室 其外形为一个可放置在孔板里的小杯子 根据实验需要 可有不同选择 其关键部分都是一致的 那就是杯子底层的一张有通透性的膜 而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样 这层膜带有微孔 孔径大小有0 1 12 0微米 根据不同需要可用不同材料 一般常用的是聚碳酸酯膜 将Transwell小室放入培养板中 小室内称上室 培养板内称下室 上室内盛装上层培养液 下室内盛装下层培养液 上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔 将细胞种在上室内 由于聚碳酸酯膜有通透性 下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞 从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长 运动等的影响 应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜 就可以进行共培养 细胞趋化 细胞迁移 细胞侵袭等多种方面的研究 8 3划痕损伤实验 在国外出现较早 用移液器滴头或刀片在单层血管内皮细胞的培养皿上划痕 为边缘内皮细胞迁移提供一裸露区域 经过创伤后边缘的单层内皮细胞可迁移至创伤区域 并重新形成新的单层内皮细胞层 在光镜下计数从损伤边缘迁移出的细胞数和迁移的相对距离 并计算出细胞的实际迁移距离 然而这种方法的定量具有任意性 9 小管形成实验小管形成实验能模拟人体内毛细血管生成的过程 包括内皮细胞出芽增殖和毛细血管网结构形成等步骤 接近人体内血管生成的实际过程 内皮细胞在基质胶 纤维蛋白胶 胶原等基质上培养时能形成网状结构 用电子显微镜来分析小管间的紧密连接 从而定量血管生成情况 实验一般采用24孔培养板 但它底面积大 Matrigel用量多 计数区域大只能随机选择几个典型区域且数据分析耗时长 Sanz等采用384孔和536孔培养板培养可节约胶的用量 借助计算机可以计算整个孔的小管及小管之间的连接数及小管的长度和面积 改进方法后减少了原来分析困难及重现性差的缺点 10 器官培养测定实验器官培养实验极大地推进了对血管形成的测定 器官血管形成测定法包括鼠主动脉环 鸡主动脉弓 猪颈动脉 胎儿鼠骨移植测定法等 这些测定法非常相似 其中鼠主动脉环测定应用最为广泛 取下大鼠主动脉后 剪成1mm宽的血管环 再用纤维蛋白胶或胶原蛋白胶包埋 然后以无血清的MCDB131培养液培养 培养过程中每天计算主动脉环产生的新生微血管数并进行定量分析 用不同胶培养的大鼠主动脉环新生血管的生长曲线不同 胶原包埋的主动脉环 培养1周时血管数达到顶峰 第2周开始萎缩 2002年有人将此方法改进 采用更薄的胶层包埋动脉环使得新生成血管染色更方便 应用双重染色法和共聚焦显微镜在同一层面上观察到内皮细胞和平滑肌细胞及外周细胞共同存在并证明了新生血管主要由内皮细胞构成 动脉环取材范围广泛 观察方法简单 可从分子水平阐明血管生长的分子调控机制 是一个较好的体外血管生成模型 第二部分体内实验1 鸡胚绒毛尿囊膜实验2 角膜微囊实验3 海绵植入实验4 圆盘血管生成系统5 基质胶栓实验6 海绵 基质胶实验 1 鸡胚绒毛尿囊膜实验 CAM 特点 1 方法简便且成本低 仪器设备条件要求不高 2 易于操作 便于推广 3 可用于进行大样本研究 4 可用于影响血管生成因素或药物的筛选和评价 鸡胚绒毛尿囊膜 CAM 实验主要步骤 1 鸡胚准备和接种组织 2 组织接种 3 接种组织的收获与观察 CAM血管生成实验模型的用途 检测评价接种物刺激CAM血管增生的血管生成作用 用于分析研究血管生成促进因子 抑制因子的活性和作用的检测 如肿瘤血管生成的研究等 对接种物 如肿瘤组织 自身的血管生成进行研究 用于分析不同组织的血管生成活性和作用 如肿瘤组织有引发新生血管生成的作用 对照 抗血管生成药物作用以后 2 角膜微囊实验1 动物模型 4 6周龄雄性裸小鼠 在手术显微镜下 裸鼠角膜建立一个1 5mm 0 8mm大小的微囊 将肿瘤组织切成0 3mm3小块 然后接种于微囊中 建立裸鼠角膜微囊移植模型 2 实验分组 分处理组和对照组 3 角膜新生血管的观察与定量研究 手术后第3 5 7 9 12 15 18 21d 应用体视显微镜 动态观察角膜微囊内肿瘤诱导的血管生成情况 显微数码摄像系统记录观察结果 根据新生血管的数目及生长速度确定新生血管的活性 按照Ziche法定量计算角膜新生血管的积分 即新生血管积分 血管密度 血管长度 血管密度指数1相当于0 25条血管 角膜 2相当于25 50条血管 角膜 3相当于50 75条血管 角膜 4相当于75 100条血管 角膜 5相当于 100条血管 角膜 将角巩膜缘到角膜中心 瞳孔 的距离分成5等份 以圆周到圆心的距离为5 计算新生血管长度 3 海绵植入实验1987年有人提出海绵植入实验模型 先将待测药物注入无菌聚酯海绵中 再将海绵植入大鼠皮下 海绵植入后测定其中的血流 血管化后