（环境科学与工程专业论文）大连近岸海域微生物源示踪技术的应用研究.pdf

a p p l i c a t i o nr e s e a r c ho nm i c r o b i a ls o u r c et r a c k i n g t e c h n o l o g yi nd a l i a nb e a c hw a t e r s h e d at h e s i ss u b m i t t e dt o d a l i a nm a r i t i m eu n i v e r s i t y i n p a r t i a lf u l f i l l m e n to ft h er e q u i r e n m e n t sf o rt h ed e g r e eo f m a s t e ro fe n g i n e e r i n g b y f e n gw e n w e n ( e n v i r o n m e n t a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ) t h e s i ss u p e r v i s o r ：p r o f e s s o r z h a n gn a i d o n ga n dw a n gy a o b i n g j u l y2 0 11 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文：太蓬堑崖漫遮丝生物逦丞壁燕苤鳆虞周受塞：。除论文中 已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中 以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人或集体已经公开 发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名：z 圣燮， 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发 行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密( 请在以上方框内打t v ”) 撇：殇毫更一名嘿 日期：2 d f f 年1 月 日 隶，囊， 一二一? ”蚕1 毒一 + ： 。一 y 1 i 中文摘要 摘要 随着人口递增和畜禽养殖业不断发展，非点源污染问题在我国日益突出，严 重影响到自然水体质量和水体使用。微生物源示踪( m i c r o b i a ls o u r c et r a c k i n g ，m s t ) 技术由于能够识别受污染水体的污染源种类而在世界许多国家得以快速发展。为 促进该技术在我国的发展，本研究选择技术方法之一的抗生素抗性分析法 ( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i s ，a r a ) ，以大连地区为试验区域，建成陆上潜在污染 源( 人、狗、及、牛、猪) 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库，采用源验证、交叉验证和 样本验证对图谱库的准确性和可靠性进行了检验，采用实地验证对技术实用性进 行检验。结果显示： ( 1 ) 图谱库在物种源五分类模式下源验证的平均正确归类率( a v e r a g er a t eo f c o r r e c tc l a s s i f i c a t i o n ，a r c c ) 为5 2 9 ，交叉验证a r c c 为5 2 2 ，两验证a r c c 之差为o 7 ( 5 ) ：图谱库在“人源v s 动物源”二分类模式下源验证和交叉验证 a r c c 均为6 9 9 ，两验证a r c c 之差为0 ( 5 ) ，图谱库在两种模式下归类菌 株的准确性均良好。 ( 2 ) 图谱库在物种源五分类模式下样本验证a r c c 为4 8 0 ，与库内菌株交叉 验证a r c c 之差为4 2 ( 5 ) ；图谱库在“人源v s 动物源”二分类模式下样本验证 a r c c 为6 8 8 ，与交叉验证a r c c 之差为1 1 ( 5 ) ，图谱库在两种模式下溯源 样本的可靠性均良好。 ( 3 ) 应用本技术溯源星海湾污染源的结果显示该水域粪便污染显著源为人源， 其他源不明显；对金州湾溯源结果显示该水域粪便污染显著源为牛源，其次为人 源和狗源；图谱库实地溯源结果与预期分析基本一致，证明技术实用性良好。 以上结果说明了，本研究建立的a r a 指纹图谱库准确性和可靠性良好，技术 实用性较好；本研究证明了将基于抗生素抗性分析法的微生物源示踪技术应用于 我国水环境非点源污染源示踪是可行的，该技术有望成为治理我国水环境污染的 有效工具。 关键词：非点源污染；源示踪技术；抗生素抗性分析法 英文摘要 a b s t r a c t w i t ht h ei n c r e a s eo fa n i m a l sa n dh u m a np o p u l a t i o ni no u rn a t i o n ，n o n p o i n t p o l l u t i o nh a sb e e nas e r i o u sw a t e re n v i r o n m e n t a lp r o b l e ma si td e g r a d e sw a t e rq u a l i t y a n dr e s t r i c t si t su s e m i c r o b i a ls o u r c et r a c k i n gt e c h n o l o g yh a sd e v e l o p e dr a p i d l yi n m a n yc o u n t r i e sa r o u n dt h ew o r l d b e c a u s et h ee m e r i n gd i s c i p l i n ec a nb eu s e dt oi d e n t i f y c o n t a m i n a t i o no r i g i n so fp o l l u t e dw a t e r s w i t ht h ea i mo fp r o m o t i n gt h et e c h n o l o g yi n o u rn a t i o n ，as t u d yw a sc o n d u c t e di nd a l i a nc h o s e dt ob et h ee x p e r m e n t a la r e a a sa m e t h o do fb e i n gw i l d l yu s e di nt h et e c h n o l o g y , a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i sw a s p e r f o r m e do n a na n t i b i o t i c r e s i s t a n c ef i n g e r p r i n td a t a b a s eg e n e t a t e df r o mp o t e n t i a l o n s h o r es o u r c e s ( h u m a n ，d o g ，c h i c k e n ，c a t t l e ，p i 曲r e s u b s t i t u t i o nt e s t ，c r o s s v a l i d a t i o n t e s ta n ds a m p l et e s tw e r ec a r r e do u tt ov e r i f yt h ea c c u r a c ya n dr e l i a b i l i t yo ft h ed a t a b a s e af i e l dt e s to ft h ep r e d i c t i v ep r a c t i c a b i l i t yo ft h et e c h n o l o g yw a sc o n d u c t e db ys a m p l i n g i nt w ow a t e r s h e d s t h er e s u l t ss h o w e dt h a t ： ( 1 ) t h ea v e r a g er a t eo fc o r r e c tc l a s s i f i c a t i o n ( a r c c ) o ft h ef i n g e r p r i n td a t a b a s ef o r t h ef i v e - w a ys p l i t ( h u m a n ，d o g ，c h i c k e n ，c a t t l e ，p i 曲w a s5 2 9 b yr e s u b s t i t u t i o nt e s t a n d5 2 2 b yc r o s s v a l i d a t i o nt e s t t h ea r c cf o rt h et w o w a ys p l i t ( h u m a na n d n o n h u m a n ) b yr e s u b s t i t u t i o n t e s ta n dc r o s s - v a l i d a t i o nt e s tw e r eb o t h6 9 9 t h e f i n g e r p r i n td a t a b a s ec a nb ec o n s i d e r e da c c u r a c yb e c a u s et h ea r c c d i f f e r e n c e sb e t w e e n r e s u b s t i t u t i o nt e s ta n dc r o s s - v a l i d a t i o nt e s tw e r eb o t hs m a l l ( 1 e s st h a n5 ) ，0 7 a n d 0 r e s p e c t i v e l yi nf i v e - w a ys p l i ta n d i nt w o w a y s p l i t ( 2 ) w h e nt h es a m p l et e s tw a sc o n d u c t e d ，t h ef i n g e r p r i n td a t a b a s eh a da na v e r a g e c o r r e c tc l a s s i f i c a t i o nr a t eo f4 8 0 f o rf i v e - w a ys p l i t ，a n d6 8 8 f o rt w o - w a ys p l i t t h e a r c cd i f f e r e n c eb e t w e e ns a m p l et e s ta n dc r o s s - v a l i d a t i o nt e s tw a sb o t hs m a l l ( 1 e s s t h a n5 ) ，4 2 i nf i v e - w a ys p l i ta n d1 1 i nt w o w a ys p l i t ，w h i c hs h o w e dt h a tt h e f i n g e r p r i n td a t a b a s ec a nb ec o n s i d e r e dr e l i a b i l i t y ( 3 ) f i e l dt e s t sw e r ec o n d u c t e di nx i n g h a ib e a c h a n dj i n z h o ub e a c hs i m u l t a n e o u s l y t h ea r ar e s u l t ss h o w e dt h a th u m a nw e r et h em a j o rs o u r c eo fp o l l u t i o ni nx i n g h a i b e a c h ，a n dt h ep e r c e n t a g e so fo t h e rs o u r c e sw e r ei n s i g n i f i c a n t w h e ne n t e r o c o c c i i s o l a t e df r o mt h es e a w a t e ro fj i n z h o ub e a c hw e r ec l a s s i f i e du s i n gt h ea r ad a t a b a s e ，i t w a se v i d e n tt h a tc a t t l ew e r et h em a j o rs o u r c eo ft h i sw a t e r s h e d ，f o l l o w e db yh u m a na n d d o g t h er e s u l t sw e r ec o i n c i d e n tw i t hp r o s p e c t i v ei n v e s t i g a t i o nc o n c l u s i o n s ，w h i c h s h o w e dt h a tt h et e c h n o l o g yi sp r a c t i c a b l e n er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h ea r a f i n g e r p r i n td a t a b a s ec a nb ec o n s i d e r e da c c u r a c y a n dr e l i a b i l i t y , a n dt h et e c h n o l o g yi sp r a c t i c a b l e a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e a n a l y s i sm e t h o d b a s e dm i c r o b i a ls o u r c et r a c k i n gt e c h n o l o g yc a n b eu s e dt oi d e n t i f ys o u r c e so fn o n p o i n t p o l l u t i o ni n0 u rn a t i o n ，w h i c he n a b l e st h ea p p l i c a t i o no fa p p r o p r i a t em a n a g e m e n t p l a n s f o rp r e v e n t i o no ff u r t h e rc o n t a m i n a t i o n k e yw o r d s ：n o n p o i n tp o l l u t i o n ；s o u r c et r a c k i n gt e c h n o l o g y ；a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e a n a l y s i s 目录 目录 第1 章绪论1 1 1 微生物源示踪技术( m s t 技术) 2 1 1 1m s t 技术背景2 1 1 2m s t 技术原理2 1 1 3m s t 技术方法3 1 1 4m s t 技术研究概况5 1 2a r a - m s t 技术研究进展6 1 2 1a r a 指纹图谱库的建立6 1 2 2a r a 指纹图谱库的分析9 1 2 3a r a 指纹图谱库的验证：1 0 1 2 4a r a m s t 技术应用1 3 1 3 国内研究进展1 4 1 4 研究前景展望1 5 1 5 本论文设计思想1 6 第2 章a r a 指纹图谱库的建立与准确性验证1 8 2 1 材料与方法1 8 2 1 1 材料1 8 2 1 2 方法1 9 2 2 结果2 0 2 2 1 五分类物种源模式准确性验证2 0 2 2 2 二分类人和非人模式建库准确性验证一2 2 2 3 讨论2 3 2 4 小结2 4 第3 章a r a 指纹图谱库的可靠性验证2 5 3 1 材料与方法2 5 3 1 1 材料2 5 3 1 2 方法2 6 3 2 结果2 8 3 2 1 五分类模式可靠性验证结果2 8 3 2 2 二分类模式可靠性验证结果。2 9 3 3 讨j 沧2 9 3 4 小结3 0 目录 第4 章a r a - m s t 技术实用性验证水域的确定3 1 4 1 材料与方法3 1 4 1 1 社会调研3 1 4 1 2 生物指标检测3 1 4 2 结果3 3 4 2 1 调研结果3 3 4 2 2 采样站位的确定结果3 4 4 2 3 粪便污染指标检测结果3 5 4 3 讨论3 8 4 4 j 、结3 9 第5 章a r a m s t 技术实用性验证4 0 5 1 材料4 0 5 1 1 试剂及其他4 0 5 1 2 主要仪器4 0 5 2 方法4 0 5 2 1 水样采集与处理方法。4 0 5 2 2 肠球菌分离方法。4 1 5 2 3 肠球菌生化鉴定方法4 1 5 2 4 抗生素抗性检测方法4 1 5 2 5 污染溯源方法。4 1 5 3 结果4 2 5 3 1 星海湾溯源结果与分析4 2 5 3 2 金州湾粪便污染溯源结果4 5 5 4 讨论4 7 5 5 小结4 9 结论5 0 参考文献5 1 攻读学位期间公开发表论文5 8 墅炙谢5 9 基于a r a 方法m s t 监测技术的验证研究 第1 章绪论 近几年来，国家相关部门采取果断措施抑制和降低工业点源污染，虽取得了 一些成效，但水环境污损事件和环境灾害依然频发i h 】。究其原因，相对于点源污 染，非点源污染因其涉及范围广、控制难度大、治理起步晚，目前已成为影响水 体环境质量的重要污染源【弼】。人口的递增和畜禽养殖业的迅猛发展导致人类和动 物排泄物总量的日益增加，所占污染物比重已经从2 0 年前的5 1 0 上升到3 5 以上【7 - 1 0 1 ，以人畜粪便为主的非点源污染对我国水环境造成的污染日益加重，不但 增加水体环境中磷、有机氮和难降解污染物的浓度，引起“水华”、“赤潮”等环境事 件，危险性更大的是人畜粪便中含有的大量致病微生物，能够导致水源性传染疾 病的暴发、娱乐场所关闭和水产养殖环境的恶化，从而带来重大的经济损失。传 统的水环境监测方法和指标只能反映出受污程度而不能明确污染物来源，找不到 污染源头就无法针对性地消除污染，国家虽然花大力气进行水环境非点源污染的 整治工作，取得一定成效，但是污染问题依然严峻，形成了非点源污染治理工作“治 理效率低、花费费用高、环境效果差”的被动局面。水环境非点源污染治理的盲目 性问题也曾困扰着欧美等发达国家的水环境监管部门，国际上发展起来的集污染 监测和溯源示踪为一体的微生物源示踪技术( m i c r o b i a ls o u r c et r a c k i n g ，m s t ) 为解 决这一难题提供了新的思路【1 1 】。借鉴国际上的先进经验用以解决国内日益严重的 由非点源污染引发的水环境问题，研究和发展适合我国的m s t 技术势在必行。 本论文以国家8 6 3 海洋示踪监测技术领域科研项目“典型近岸海域粪便污染微 生物源示踪监测技术研究”为依托，验证基于抗生素抗性分析法( a n t i b i o t i c r e s i s t a n c ea n a l y s i s ，a r a ) 的m s t 技术的可用性。通过检验所建成的物种源肠球菌 a r a 指纹图谱库的准确性和可靠性以及技术实用性，对基于a r a 方法的m s t 技 术进行了技术应用前的溯源验证研究，以期为推动a r a - m s t 技术尽早服务于我 国水环境非点源污染监测与治理提供帮助，同时为同领域的国际研究提供参考。 本章节综述微生物源示踪技术的背景、原理、方法，主要细致分析了作为m s t 技术重要方法之一的a r a 方法目前的国内外研究进展，并对该技术的研究前景进 行了展望。 绪论 1 1 微生物源示踪技术( m s t 技术) 可追溯性不是一个新的术语，它早在航空、空间和军队等领域有过应用。二 十世纪八十年代，随着工业化点源污染得到有效控制，非点源污染上升为自然水 体环境污染的重要来源。尤其是欧美等发达国家的环境卫生机构和组织对水域环 境质量和公共卫生安全等方面的要求不断提高，追溯开始用于水域环境管理的非 点源污染源示踪和污染控制，以此提高政府机关及单位的环境管理和监督水平。 1 1 1m s t 技术背景 二十世纪八十年代，美国地区大约有1 3 的地面水存在粪大肠菌群超标现象， 即使对点源污染源的治理效率几乎达到1 0 0 的情况下，仍然有相当规模的水域没 有达到清洁法案中的水质要求，水域的生态环境质量依然没有得到改善，反而逐 渐加重。最终发现陆地非点源污染才是其潜在原因，同时调查证明陆源性人畜粪 便是非点源污染源的重要组成部分，由此开始，美国水质管理计划开始重视和加 强陆地非点源污染控制。 非点源污染具有分散性、隐蔽性、随机性、不易监测、难以量化等特征，相 对于点源污染的监测治理技术和手段已经基本实现成熟化操作而言，对非点源污 染的治理和监测存在很大难度。世界各国广泛采用的传统监测方法是一种“只能描 述现象，不能找到源头”的被动监测，由于只是检测受污染水体的大肠杆菌群数和 粪大肠菌群数等个别指标，仅能反映出环境受粪便污染的程度。传统方法监测能 力的局限性成为困扰水域环境管理和保护的难题，已经无法满足非点源污染监控 与治理的需要，因此亟需研究一种能够准确识别和定位非点源污染来源的新技术 【1 1 】。在此形势下，美国自八十年代末开始了非点源污染溯源技术的研究，m s t 技 术就这样应运而生了。 从m s t 技术的应用功效而言，该技术是一种基于风险管理为基础的安全保障 技术。一旦水环境遭受的非点源污染加重，超出水环境所能承受的最高污染负荷， 或可能威胁到人和动物的健康等，可以依托该技术所能提供的有关污染源的信息， 对污染源头及时实施直接有效的控制，有针对性地切断或降低源头污染，消除环 境影响，减少环境损失，保障公共安全。 1 1 2m s t 技术原理 2 基于a r a 方法m s t 监测技术的验证研究 m s t 技术是一种利用微生物在环境中的生化特性、遗传多样性及其特异性代 谢产物确定其宿主来源的新技术。溯源性管理在环境污染监测与管理中的应用在 近二十年来得到了广泛的发展。在环境污染溯源技术的发展建设中，各国对“可追 溯性”的定义尚未一致，国际标准化组织i s 0 ( 8 0 4 2 ：1 9 9 4 ) 把可追溯性定义为：通过 记录和标识追溯某个实体的历史、用途或位置的能力【1 2 l 。 该技术的基本原理【1 1 ，1 6 】是：由于不同动物摄食习惯及其体内环境的差异，生 活在宿主体内的微生物在环境因子( p h 值，营养素和特殊受体等) 的胁迫作用下， 功能上产生一系列的特异性环境适应，并将所产生的这种特异性遗传给子孙后代， 进而形成一个区别于其他宿主环境的特异性微生物种群。这类微生物携带了带有 其宿主或生存环境的特异性指纹图谱( 如：特异性微生物、特殊代谢产物、遗传学 特征等) ，通过分析这些宿主特异性微生物或特异性指纹图谱，可以达到识别污染 源的目的。 1 1 3m s t 技术方法 各国研究机构对m s t 技术研究所采用的方法有多种【1 3 2 0 】，根据是否需要事先 建立已知源数据库，可以将其分为非依赖数据库型方法( l i b r a r y i n d e p e n d e n t ) 和依赖 数据库型方法( l i b r a r y - d e p e n d e n t ) 。 ( 1 ) 非依赖数据库型方法 非依赖数据库型m s t 技术方法是通过直接检测水环境中的源特异性微生物或 依靠分子生物学的方法直接检测其源特异性标识物，如d n a 片段等，来确定污染 源的方法。非依赖数据库方法仅需检测某一宿主源的特异性标志物的有无，无需 建立数据库，所以宿主特异性标志物( s p e c i f i cm a r k e r ) 的专一性是非依赖数据库型的 关键。该类型方法的快速、可靠、灵敏和特异性已得到大多数专家学者的认可， 特别是随着实时定量p c r 方法的发展，对一些宿主特异性指示物进行量化分析也 成为可能。 ( 2 ) 依赖数据库型方法 依赖数据库型方法根据所获取的指纹来源的不同又分为表型法( p h e n o t y p i c m e t h o d s ) t f f l 基因型法( g e n o t y p i cm e t h o d s ) 两种。表型法是利用微生物在不同的环境 因素诱发下产生的特有生化代谢产物，从而判断宿主来源的方法。主要方法有： 抗生素抗性分析法( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i s ，a r a ) 、碳源利用法( c a r b o ns o u r c e 3 绪论 u t i l i z a t i o n ，c s u ) 和血清型法( s e r o t y p i n g ) 等【1 3 6 1 。基因型法是利用在不同宿主环境内 存在的同一种微生物具有相似但有差异的基因指纹，利用其差异，反向追踪其所 在宿主的方法。目前主要应用的方法有：核糖印迹法( r i b o t y i n g ) 、限制性片断长度 多态性分析法( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，a f l p ) 、脉冲场凝胶电泳法 ( p u l s e d - f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p f g e ) 、重复序列扩增法( r e p e t i t i v ee x t r a g e n i c p a l i n d r o m i c p c r ，r e p p c r ) 等【1 1 8 1 。 第一步：指纹图谱库的建立第二步：粪便污染溯源识别 e c o l i 基冈型分析 le c o l i 基因型分析 i i 建立已知源特异性指纹图谱库 水样源e c o l i 指纹与图谱库指纹进行比对 1 i r 自然环境水体污染源解析 ， 图1 1 依赖数据库型m s t 技术概念图( 以e c o l i 的r e p - p c r 指纹图谱为例) f i g 1 1s c h e m a t i cr e p r e s e n t a t i o no ft h eh o s t - l i b r a r ya p p r o a c hu s e di nm i c r o b i a ls o u r c e t r a c k i n g t h eg e n o t y p i cm e t h o dr e p p c ri si l l u s t r a t e da sa ne x a m p l e 4 基于a r a 方法m s t 监测技术的验证研究 1 1 4m s t 技术研究概况 m s t 技术由美国于二十世纪八十年代术率先研究和发起，其目的是为有效治 理由非点源污染所引起的自然水体环境污染，该技术自出现以来，有几件较为重 要的关键事件1 2 1 】。2 0 0 2 年2 月，m s t 技术专题研讨会首次在美国加利福尼亚州欧 文市举行，会议分析和总结了已有的几种源示踪方法的优缺点，并通过比较、评 估制定了实施当初现有方法的总纲。加拿大于2 0 0 5 年3 月召开了全国性的m s t 技术研讨会，会上一致认为粪便污染对水域的危害日渐严重，传统的粪便污染监 测方法必须改进，快速发展和推广m s t 技术是目前能够有效治理水环境污染问题 的重要出路。同年7 月，美国环境保护总署( e p a ) i e 式颁布了微生物源示踪技术的 一系列相关性导则【1 9 1 ，其中详细阐述了现有示踪技术的理论与方法，比较了各种 方法的利弊，并对m s t 的实际应用效果进行了探讨，肯定了m s t 技术在水域环 境管理中的巨大作用。 由于受科技水平和经济实力的影响，m s t 技术的发展目前主要集中在发达国 家，并在全球范围内被应用于多种自然水体( 包括河流、湖泊、近岸海域) 的非点源 污染的源示踪【2 2 之7 l 。此技术在世界许多流域得n - f 成功应用，目前研究最深入且 发展最快的是美国，美国环境保护总署已经专门编写和颁布了m s t 技术导则用以 指导全国范围内的粪便污染示踪，包括佛吉尼亚州、新泽西州、爱达荷州等在内 的许多州相继建立了各自不同流域的非点源示踪监测的数据库系统，同时为探讨 和评价该技术的时空稳定行和代表性提供了极为重要的基础研究数据【2 0 i 。其他国 家在该技术发展方面远没有达到像美国那样的广泛影响和效应，但已经有不少国 家将m s t 技术应用于水源环境卫生管理和污染控制，并取得了重大成效【2 6 1 。加 拿大的m c i m e n t l 评价了三种微生物指示因子，并对地下水粪便污染源进行示踪研 究【2 l 】。国外很多研究机构结合高新技术，利用分子生物学，光学，化学等应用学 科理论为基础，成功总结出大量试验方法。在研究的同时，也不断尝试于相关产 品的开发和研制。美国s o u r c em o l e c u l a r 公司为不同粪便来源细菌进行鉴定，能够 提供相对准确的宿主源f 2 2 】；美国杜邦公司开发研制出一套自动细菌鉴定仪【2 3 j ；加 拿大a q u a v i cw a t e rs o l u t i o ni n c 公司与维多利亚大学共同研发了“a q u a v i cs o u r c e t r a c kt m ”技术服务项目，帮助客户识别污染水体的污染源i z 4 1 。 5 绪 论 m s t 技术目前虽然已取得了可喜的成果，但仍然还不成熟，可采用的方法多 种多样，各种方法之间的优缺点不断显现，目前还没有哪一种方法被国际上认定 为完全合理和有效。该技术在美国、欧洲以及澳洲等地的应用取得了良好的示踪 效果，国外相关经验的积累为我国此技术的研究起到重要的参考和借鉴作用。虽 然采用单一方法的源示踪技术大部分都能够在流域粪便污染示踪上取得较好效 果，但多种方法的联用可以更好的实现彼此之间的优势互补，多方法交叉联用将 是未来微生物源示踪技术发展的大势所趋。未来的研究也将继续讨论时间与地理 位置的变化对示踪指示物稳定性的影响。有关于m s t 的统计学分析，倾向于开发 大范围并更被大多数人认同的更有效的统计方法。而且可以预见，随着基因片断、 基因序列和实时检测技术的发展，更加敏感和多样性的检测，同检测多样性的有 机物和分子指示物，将有统一的实验和操作方法。 1 2a r a m s t 技术研究进展 a r a 方法是一种已经被用于区分不同粪便来源指示细菌的方法，是m s t 技术 可选用的库依赖型表型示踪方法中的一种。其所依据的基本原理是不同物种源由 于抗生素使用情况的差异造成不同动物粪便源的同种菌群的耐药谱存在差异，通 过检测不同物种源粪便中指示因子的抗生素抗性表型，利用数学分析软件建立起 不同源抗性表型的分类规则，通过将未知源菌株的抗性表型与各源表型进行比对 实现对未知源菌株源示踪的功能。 该方法具有操作简单、经济快速等特点，比起基因型方法，此方法不需要特 殊的技术培训及仪器设备，而且成本低廉，从而得到了广泛应用。根据a r a 方法 在m s t 技术中的具体应用过程，可将其分为潜在源指纹图谱库的建立、指纹图谱 库分析，指纹图谱库验证、实地溯源应用四个步骤。 1 2 1a r a 指纹图谱库的建立 由于基于a r a 方法的m s t 技术是一种库依赖型微生物源示踪法，其核心部 分是构建研究区域内不同粪便源指示因子的a r a 指纹图谱库，这是未知源指示因 子“有源可溯”的前提和基础。根据时间顺序将指纹图谱库的建立过程分为确定参数 因子、实际操作建库、建库数据转换三个阶段。 1 2 1 1 确定参数因子 6 基于a r a 方法m s t 监测技术的验证研究 在待研究区域进行实地调研、多方面获取资料信息，在对该地域污染源进行 全面分析的基础上，确定具体地域范围及所选指示因子的种类，并在此前提下确 定拟建a r a 指纹图谱库各参数因子：一是确定指示因子的种类，二是确定潜在粪 便源种类，三是确定所选抗生素种类及浓度，四是确定指纹图谱库预包含数据量 的大小。 ( 1 ) 指示因子的确定：目前被a r a m s t 技术最普遍采用的指示因子种类是大 肠埃希氏菌和肠球菌。指示因子抗生素抗性的种源差异性是a r a m s t 技术可行 的前提条件，而指示因子进入自然环境后抗生素抗性的时空稳定性也是技术成功 实现的关键性环节。v a n t a r a k i sa 等人检测希腊某地大肠杆菌多重耐药性结果显示 人源耐药指数是动物源的3 倍1 2 8 l ；j o n eea n d e r s o n 等人研究了野牛与家养牛肠道 肠球菌的耐药谱型后发现野牛肠球菌耐药性要低于家养牛【3 2 】；m a t t e wa a n d e r s o n 等人研究显示人、牛和马肠道内大肠杆菌对同种药物的耐药性存在差异【3 引。以上 研究表明采用肠球菌或大肠埃希氏菌作为示踪因子的a r a 方法可以用于人源和动 物源的分类示踪，其应用于m s t 技术的基本原理是成立的。 ( 2 ) 潜在污染源种类的确定：不同地域和水体所选取的污染源种类是不同的， 源种类的确定一定要具有代表性，至少需包含对研究区域的非点源污染具有明显 或重大影响的种类，其次再考虑添加其他的可能源，另外还需提前考虑到污染源 样本采集的方便程度，从而合理制定可行性强的采样方案。 ( 3 ) 抗生素种类和浓度数量的确定：抗生素种类的选取基于社会调研与资料分 析的基础上，主要考虑所选指示因子常用的检测药物种类、各污染源常服用药物 种类等方面，尽量选择各源之间使用情况差异较为明显的药物种类，尽量避开各 源表现同一的可能性高的药物。国际上对于m s t 技术中所建立a r a 指纹图谱库 药物种类的数量虽没有统一的规定，但大多数研究所选取的种类数量基本都不少 于八种，抗生素种类的选取以十种左右为宜。并不是选取的种类越多越好，因为 过多的种类数量不但会增加劳动和资金成本，降低建库效率，甚至可能会干扰或 降低指纹图谱库分析的准确性。抗生素浓度数量的确定，一般情况下，针对每种 药物选择3 4 个浓度梯度为宜，不同抗生素的梯度浓度的选择可以是不一样的， 确定方法主要遵循耐药性研究常用检测浓度即可。 ( 4 ) 指纹图谱库预包含菌株数量的确定：指纹图谱库预包含菌株数量是指计划 7 绪论 从各粪便源分离得到的菌株数量值。一般情况下，各源预分离菌株数量值相差不 会很大。国外研究中指纹图谱库包含菌株数量多少不一，从几百到几千不等【3 7 郴】。 该数值的确定目前在国际上还没有统一的规定，该值的选择与研究区域范围大小 及污染源抗性表型可能的复杂程度有关，研究范围越大，污染源抗性表型情况越 复杂，菌株数量也应相应地适当增加，如此才能使分离的菌株具有对该区域内各 潜在污染源抗性的普遍代表性，以后的溯源分析才能越准确。从使指纹图谱库具 有区域内各源代表性考虑，菌株数量越多越好，但菌株数量过多容易引起指纹图 谱库归类能力的降低，而且还无谓的增加实验成本。因此，有关于菌株数量的确 定在综合考虑各影响方面的基础上适量即可。 1 2 1 2 实际操作建库 根据前期拟确立的各参数因子进行指纹图谱库的实际构建，按照实际操作顺 序完成以下三个实验过程，包括粪便源样本的获取、指示因子的分离鉴定、指示 因子抗生素抗性特征检测。 ( 1 ) 粪便源样本的获取 为实现使指纹图谱库具有空间代表性的目的，粪便源样本要在研究区域内尽 量宽广的范围内进行采集，采样点的选取不能太过集中，要尽量分散和全面。所 采集的样本方式不是完全一定的，可以根据粪便源需要而定。比如，采集人源样 本最好不要直接采集单个体的粪便，考虑到样本代表性和实验效率的提高，可以 采集城市生活污水样本。再如，如果某条河流的源头是受人类影响很小的树林， 若要采集野生动物粪便中指示因子，可以直接从河流的树林流经段采集水样样本。 ( 2 ) 指示因子的获取 从每个样本中分离指示因子的数量没有明确规定，当从粪便样本中直接分离 菌株时，一般从每个样本中分离和6 株为宜【舢6 l ，太多则所分离菌株的抗性特征 重复性会增高，太少则提高了实验成本。当从生活污水样本中分离人源指示因子 时，分离数量则可以根据指纹图谱库的数量需要而定。 ( 3 ) 抗生素抗性指纹的获取 当前的临床微生物药敏试验的方法主要有以下几种：k i r b y b a u e r 药敏纸片扩 散法( 简称k b 法) 、定量测定稀释法( 包括微量肉汤稀释法和琼脂稀释法) 、抗生素 浓度梯度法( e t e s t 法) 和自动化仪器等。 8 基于a r a 方法m s t 监测技术的验证研究 1 2 i 3 建库数据转换 指纹图谱库建立的实验部分完成以后，将各粪便源指示因子的抗生素抗性特 征转化为计算机可识别的二进制数据模式，即将耐药数据标记为“i ”，将敏感或中 敏的数据标记为“o ”，以满足接下来利用计算机数据处理程序对指纹图谱库进行分 析的需要【4 7 侧。 1 2 2 a r a 指纹图谱库的分析 指纹图谱库的建成只是a r a 方法应用的第一步，还需要对所建立的包含各源