（植物学专业论文）细胞色素b6f蛋白复合体中叶绿素a的性质和功能研究.pdf

摘要 摘要 细胞色素如，蛋白复合体( c y t o c h r o m e 如，c o m p l e x ，c y t 岛d 是光合膜 上参与光合作用原初反应过程的主要膜蛋白超分子复合体之一。莱茵衣藻和嗜 热蓝细菌的c y t 耵三维晶体结构均显示，每c y t 尻，单体分子含有1 分子 c h l o r o p h y lla ( c h la ) ，充分肯定了c h la 是c y t 如，天然成分的观点( k u r i s u e ta l ，2 0 0 3 ：s t r o e b e le ta l ，2 0 0 3 ) 。研究表明不同来源的c y t 如f 中c h l a 单线激发态寿命( 或荧光寿命) 并不一样，多数的研究结果认为c y t 尻，中c h l a 单线激发态寿命只有2 0 0 p s 左右，但是也有c y t 搿中c h l a 单线激发态寿命为 6 0 0 p s 的报道；而甲醇中游离c h la 的单线激发态寿命为4 n s 左右。针对c y t 饥f 中c h l a 单线激发态寿命快速淬灭的现象，d a s h d o r j 等( 2 0 0 5 ) 根据晶体结构推 测c y t 如f 中c h l a 单线激发态和邻近的c y t 反亚基上t y r 嘲残基发生电子交换 传递，从而快速淬灭c h l a 单线激发态，减少了三线态c h la 和单线态氧的产生， 并且认为这是c y t 彬保护自身不受单线态氧破坏的一种机制，但是这一推测缺 乏有力的证据。另外，c y t 舻中c h l a 的功能仍然未知。本文以菠菜c y t 历f 为。 对象，结合多种实验手段，测定了菠菜c y t 如f 中c h la 单线激发态寿命，并对 复合体中c h la 单线激发态淬灭的机理进行了深入研究。此外，我们还对复合 体中c h l8 可能的功能进行了初步地探讨。获得了如下的结果： 1 针对不同来源的c y t 彬中c h l a 单线激发态寿命( 或荧光寿命) 测定结 果不同的报道，仔细分析了其中的原因，发现除了样品来源的差异外，使用不 同的去垢剂可能是一个不可忽视的因素。在实验中，不同的研究者分别采用了 十二烷基麦芽糖苷( n - d o d e c y lb - d - m a l t o s i d e 。d d m ，) 和八烷基葡萄糖苷 ( n o c t y lb d g l u c o p y r a n o s i d e ，b o g ) 作为溶解样品的去垢剂。因此，本 文借助稳态吸收和稳态荧光光谱、瞬态光散射技术，c d 光谱和亚皮秒时间分辨 吸收光谱等技术，分别研究了这两种去垢荆对c y t 如f 结构和功能的不同影响。 结果表明，d d m 去垢剂能使c y t 岛，处于较好的分散体系中，其中血红素和c h la 分子处于特定的蛋白环境中，不会导致c y t 岛f 变性；而b 一0 g 去垢剂会使c y t 如，产生聚合现象，其中的血红素和c h l 日与蛋白环境的相互作用减弱，和d d m 相比其电子传递活性显著降低，c h la 单线激发态寿命延长，c h l 日更容易被光 细胞色素抚，蛋白复合体中叶绿紊口的性质和功能研究 破坏。通过这一工作，我们优化和确定了c y t 如f 的溶解条件，为下面的研究工 作打下了良好的基础。 2 利用t y r 的特异性修饰剂p - n i t r o b e n z e n e s u l f o n y lf l u o r i d e ( n b s f ) 对c y t 钳样品进行特性修饰，经原子吸收谱、荧光谱、c d 谱、质谱等方法对 修饰后的样品进行鉴定，并结合时间分辨飞秒吸收光谱技术，测得修饰后的样 品在6 6 0 n m 激发下c h la 单线激发态寿命延长，从而在实验上提供了t y r 与淬 灭c h l a 单线激发态有关的证据。但是对c y t 钳中c h la 瞬态吸收图谱仔细研 究表明，菠菜c y t 反，中c h la 单线激发态快速淬灭过程中并没有发现t y r 与 c h la 之间发生电子传递时所形成的c h l a 。以上结果表明，c y t 钳中c h la 单线激发态快速的淬灭确实和邻近的t y r m 有关，但是与d a s h d o r j 等提出的 c h l a 单线激发态和t y r m 残基发生了电子交换传递从而淬灭c h l a 单线激发态这 一想法不符，关于这一问题值得进一步深入研究。 3 红光和绿光对c y t 尻f 照射，c y t ，可以被还原，并且红光比绿光更容 易使c y t ，还原，暗示c y tf 的还原与c h la 的关系密切，有可能是c h la 被 激发后，其被激发的电子传给c y t ，对这一现象的进一步研究表明，c y t 如， 在光照条件下，c y tf 的还原与体系内c 。- p q 库的氧化还原状况相关，氧化型 的c 。- p q 可能介导电子从c h l a 传向c y t 厶由于在体内质体醌库的氧化还原状 态往往决定c y t 如f 的氧化还原状态，而通过对c y t 反f 不同氧化和还原状态的 吸收谱和荧光谱的研究表明，氧化态和还原态的c y t 绁中，c h la 与蛋白的 结合状态是有差异的。这些差异可能暗示着c h la 分子在行使其功能时与复合 体的氧化还原状态是有关系的。通过以上的结果，对c y t 绁中c h la 可能的 功能进行了假设。 4 此外，我们还发现c y t 具有明显的过氧化物酶活性。在0 1m m o l l 乙酸钠缓冲液，p h 3 6 ，2 5 ， h ：0 。 4 0 m m o l l 的条件下，其催化反应的速度 常数为= 2 6 1 2 m s ：对h 2 0 2 的i ( i i l 值为5 0 m m o l l ，对g u a i a c o l 的l ( i i i 值为 2 m o l l ；反应的最适p h 为3 6 ，最适离子强度为0 1 ，最适温度为3 5 。推测 c y t6 ，的这种过氧化物酶活性可能是在胁迫环境下使c y t 岛，中的血红素和c h l a 分子免受h 。o 。的破坏。 关键词：细胞色素6 ，蛋白复合体；叶绿素a ；单线激发态寿命；亚皮秒时间 分辨吸收光谱 i i 摘要 c h a r a c t e r i z a t i o na n df u n c t i o no fc h l o r o p h y l lai n c y t o c h r o m eb c f f r o ms p i n a c h c h e nx i a o - b o ( b o t a n y ) d i r e c t e db yp r o f k u a n g r i n g y u n ，p r o f l il i a n g b i t h ec ”o c h r o m e6 矿( c y t6 扔c o m p l e xi so n eo ft h et h r e ei n t e g r a t em e m b r a n e p r o t e i nc o m p l e xi nt h ep h o t o s y n t h e t i ce l e c t r o nt r a n s p o r tc h a i n a c c o r d i n gt o t h e x r a ys t r u c t u r ea n a l y s i s ( k u r i s ue ta l ，2 0 0 3 ；s t r o e b e le ta l ，2 0 0 3 ) ，o n ec h l o r o p h y l la ( c h la ) m o l e c u l ei sb o u n db e t w e e nh e l i c e sfa n dg o fs u b u n i ti v o ft h i sc o m p l e x t h ec h lai nt h ec o m p l e x ，h o w e v e r , h a sas m a l l e re x c i t e d - s t a t el i f et i m e ，m o s t p r o b a b l yd u e dt oq u e n c h i n gb yt h ee l e c t r o ne x c h a n g eb e t w e e nt h ec h la a n dn e a r b y a m i n oa c i d ( t y r l 0 5o fc y tb 6 ) ，t h a nt h a to ff t e ec h lai nm e t h a n o l ( 4 n s ) ，a n dt h u s r e d u c e st h ef o r m a t i o no ft h ec h iat r i p l e ts t a t e ( d a s h d o r je ta l ，2 0 0 5 ) t h i si s c o n s i d e r e da so n ek i n do fp r o t e c t i o nm e c h a n i s mo ft h ec h laa g a i n s ts i n g l e to x y g e n i nt h ec o m p l e xa l t h o u g ht h e r ea r en o ta n ye v i d e n c e sf o rt h em e c h a n i s ms t i l l a l s o ，t h e r o l e ( s ) o ft h i sc h lar e m a i n su n c l e a r i nt h i sw o r k ，t h ee x c i t e d - s t a t el i f et i m eo fc h l 口 i nt h ec y tb 6 f f i ：o ms p i n a c hw a sd e t e r m i n e d ，t h eq u e n c h i n gm e c h a n i s mo ft h ee x c i t e d s t a t eo fc l l lai nt h ec o m p l e xw a si n v e s t i g a t e d ，a n dt h ef u n c t i o no ft h ec h iaw a sa l s o p r o p o s e db a s e do ns o m ee x p e r i m e n t sd a t a 1 d i f f e r e n te x c i t e d - s t a t el i f et i m e so fc h iai nd i f f e r e n tc y t6 矿s o u r c e sw e r c o b t a i n e di ns o m er e p o r t s b u tt h et w od e t e r g e n t s ，n - d o d c c y lp d m a l t o s i d e ( d d m ) a n dn - o c t y lp - d g l u c o p y r a n o s i d e ( b o g ) ，w e r eu s e dr e s p e c t i v e l yi nt h er e p o r t s s o t h ee f f e c t so ft h et w od e t e r g e n t so nt h es t r u c t u r ea n df u n c t i o no ft h ec y tb d w e r e i n v e s t i g a t e db ys t e a d - s t a t ea b s o r p t i o n ，f l u o r e s c e n c e ，c d ，d y n a m i cl i g h ts c a t t e r i n g ， a n dt i m e r e s o l v e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p yi nt h i sw o r kf i r s t l y t h er e s u l t sa r ea s f o l l o w s ：t h ed d m d e t e r g e n td i s s o l v e st h ec y tb d b e t t e rt h a np - o od e t e r g e n td o e s ； d d mc a l lk e e pt h ec y t6 矿i nn a t i v es t a t e ，u n d e rw h i c ht h eh e m e sa n dc h ia e x p e r i e n c es p e c i f i ce n v i r o n m e n t , w h i l et h ep 一0 gm a k et h ec o m p l e xi nd e n a t u r e d s t a t ei ns o m es o r t ，u n d e rw h i c ht h ec a t a l y z e de l e c t r o nt r a n s f e ra c t i v i t yo ft h ec o m p l e x i i i 细胞色素饥，蛋白复合体中叶绿素a 的性质和功能研究 b e c o m e sl o w e r , t h eb i n d i n gs t a t e so fh e m e sa n dc h law i t ht h ec o m p l e xa r ea l t e r e d ， t h ee x c i t e d s t a t el i f et i m eo fc h iai sd e l a y e da n dt h ec h lai sp r o n et ob eb l e a c h e d u n d e rl i g h t s ot h ed d md e t e r g e n ti su s e di nt h i sp a p e rt oc a r r yo u tn e x ts t u d y 2 i no r d e rt ot e s tt h ep r o p o s e dq u e n c h i n gm e c h a n i s mo fe x c i t e d - s t a t ec h lai nc y t 6 矿b y 恤n e a r b yt y r l o fc y tb 6 ，t h es p e c i f i cm o d i f y i n ga g e n t f o r t y r , p - n i t r o b e n z e n e s u l f o n y lf l u o r i d e ( n b s f ) ，w a su s e dt om o d i f yt h ec y tb j t h e m o d i f i e dc y tb w a si n v e s t i g a t e db yt h es t e a d ys t a t ea b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c e s p e c t r o s c o p y , c ds p e c t r o s c o p y a n dm o d i y o t o fm a s s s p e c t r u m a n dt h e n e x c i t e d s t a t el i f et i m eo fc h iai nm o d i f i e dc y t6 矿w a sd e t e r m i n e db yt h e t i m e - r e s o l v e da b s o r p t i o ns p e c t r o s c o p y t h er e s u l t ss h o w st h a tt h ee x c i t e d s t a t el i f eo f t h ec h iai sp r o l o n g e di nt h em o d i f i e dc o m p l e x b mt h en e x tt r a n s i e n ta b s o r p t i o n s p e c t r u mo ft h ec b lai nt h ec o m p l e xd i dg i v en oe v i d e n c ef o rt h ec h la a n i o n r a d i c a lf o r m e db yt h ee l e c t r o ne x c h a n g eb e t w e e nt l l ec l l laa n dt y r l o s d u r i n gt h e q u e n c h i n go fe x c i m d - s t a t ec h iai n t h ec o m p l e x t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tt h e q u e n c h i n go fe x c i t e d - s t a t ec l l la i nt h ec y tb o ri sr e l a t e dt ot h en e a r b yt y r l b u tt h e e l e c t r o ne x c h a n g eb e t w e e nt h e md o e sn o th a p p e n 3 i na d d i t i o n ，t h ec y tf w o u l db er e d u c e du n d e rl i g h ta n dt h ec o m p l e xw a se a s i e r t ob er e d u c e du n d e rr e dl i g h tr a t h e rt h a nu n d e rg r e e nl i g h t ，w h i c hi n d i c a t e dt h e r e d u c t i o no fc y tfi sr e l a t i v et ot h ec maf o rt h ec h la p r e f e r st oc a p t u r er e dl i g h t i n s t e a do fg r e e nl i g h t t h ef u r t h e rs t u d ys h o w st h a tt h er e d u c t i o no fc y t f u n d e rl i g h t i sd e p e n d e do nt h er e d o xs t a t eo ft h ec 1 0 - p qp o o lf o rt h eo x i d a t e dc 1 0 - p qw o u l dh e l p t h ee l e c t r o nt r a n s f e rf r o mc h lat oc 1 0 - p qw h i l et h er e d u c e dc 1 0 - p q h 2n o t a l s ot h e s t a t e so fc h lai nt h ed i f f e r e n tr e d o xs t a t eo fc y tb 寸a r ed i f f e r e n tb yt h es t e a d ys t a t e a b s o r p t i o na n df l u o r e s c e n c es p e c t r o s c o p y , w h i c hi m p l i e st h a tt h ef u n c t i o no fc h la i n t h ec y tb j i sr e l a t e dt ot h er e d o xs t a t eo ft h ec o m p l e x 4 f i n a l l y , t h ep e r o x i d a s e l i k ea c t i v i t yo ft h ec y tb dw a si n v e s t i g a t e di nt h e p r e s e n c eo fh y d r o g e np e r o x i d e ( h 2 0 2 ) a n dg u a i a c 0 1 n 圮o p t i m a lc o n d i t i o n sf o r p e r o x i d a s ea c t i v i t y o ft h e c o m p l e xi n c l u d e ：p h3 6 ，i o n i cs t r e n g t ho 1 ，a n d t e m p e r a t u r e3 5o c ma p p a r e n tk mv a l u e sf o rh 2 0 2a n dg u a i a c o la r e5 0m m m o l l a n d2m m m o l l ，r e s p e c t i v e l y 1 1 1 ev a l u eo ft h eb i m o l e c u l a rr a t ec o n s t a n tk o b si sa b o u t 2 6 4 - 1 2 m s qa n dt h ek 哪i sa b o u t5 0m i n ( 2 0m m o l lg u a i a c o l ，10 0m m o l ls o d i u m i v 摘要 p h o s p h a t e ，p h3 6 ，2 5 0 c ，【h 2 0 2 发现蓝 藻s y m e c h o c y s t i sc y t 绁的各亚基解离后，c h la 能够选择性地结合在c y t 尻 1 1 细胞色素6 。，蛋白复合体中叶绿素丑的性质和功能研究 亚基上。线二色( l d ) 光谱测定表明：在蓝藻的c y t 如f 中c h la 分子的q 。跃迁 与膜表面相平行( b a l de ta l ，1 9 9 2 ) ：在莱茵衣藻的c y t6 中c h l a 分子的q x 跃迁与膜平面呈固定角度( 4 1 2 。) ( s c h o e p pe ta l ，2 0 0 0 ) 。研究发现，伴 随质子释放和r i e s k e f e - s 蛋白解离都会发生c h la 波谱红移( j o l i o ta n d j o l i o t ，1 9 9 5 , b r e y t o ne ta l ，1 9 9 7 ) ，而质子释放和r i e s k e f e s 都与q 。位点 有关，所以推测c h la 有可能结合在q 。位点附近。晶体结构显示c y t 晚f 中的c h l a 分子位于亚基i v 的f 螺旋和g 螺旋之间，与h e m eb l 所处平面平行，相距约 1 6a ，其尾部位于q o 位点附近。目前关于c y t 如f 中c h la 的功能则一无所知。 c y t 如f 中的类胡萝卜素多为b - - c a r 。在蓝细菌s y m e c h o c y s t i s 的c y t 饥， 中为b c a r 一4 一酮( w e n ke ta l ，1 9 9 8 ) ，而在菠菜的c y t 如，中通过共振拉曼光 谱技术鉴定则为9 一顺式( 9 - c i s ) 一b - c a r ( y a ne ta l ，2 0 0 1 ) 。而来源于假根羽 藻的c y t 中的c a r 分子为9 一c j ，q - c a r 分子( l ie ta l ，2 0 0 5 ) 。晶体结构 显示c y t 中的9 一c j ，b - c a r 分子处于p e tl 与p e tm 中间的跨膜区域，与 b 、e 及p e tg 的螺旋接触。b - c a r 可能在小亚基与蛋白的组装方面起一定的作 用( c r a m e re ta l ，2 0 0 5 ) 。 1 2 6 单体s q _ - 聚体 c y t 岛f 在结构和生理功能上是否以二聚体的形式存在目前仍有争论，但多 数人倾向于认为二聚体是其天然的生理功能结构。c h a i n 和m a l k i n ( 1 9 9 1 ) 及 b r e y t o n 等( 1 9 9 7 ) 发现，c y t 如，可以二聚体和单体的形式存在，并且在一定 条件下会发生由二聚体向单体的转化，但由单体向二聚体转化的实例迄今尚未 见有报道。h u a n g 等( 1 9 9 4 ) 用电子显微镜观察负染的c y t 岛f 颗粒和用非变性 凝胶电泳证明，c y t 耵多以二聚体的形式存在，二聚体的活性比单体高5 倍。 p i e r r e 等( 1 9 9 5 ) 用温和的分离、纯化方法从莱茵衣藻分离到的高纯度、高活 性的c y t 岛，为二聚体，在其二维晶体中亦为二聚体。但许多研究者的工作亦证 明纯化的c y t 岛，单体和二聚体未与脂质体重组前均有较高的活性，重组后二者 的电子传递活性均严重降低，加入解偶联剂i i r 氯苯腙羰基氰化物( c a r b o n y l c y a n i d em - c h l o r o p h e n y l h y d r a z o n e ，c c c p ) 后二聚体的电子传递活性能够完全 恢复，而单体的活性则仅有2 5 的恢复；在蓝藻的c y t 岛f 中单体和二聚体均 有发现( h u a n ge ta l ，1 9 9 9 ；w e n ke ta l ，1 9 9 8 ；p o g g e s ee ta l 。1 9 9 7 ；c h a i na n d m a l k i n ，1 9 9 5 , b o e k e m ae ta 1 1 9 9 4 ) 。 1 2 第一章前言 虽然在体内c y t 甜是否必须以二聚体的形式行使其生理功能尚无定论，但 在线粒体的c y t6 白二聚体结构中，两个单体的b 。血红素之间的距离和单体中的 两个血红素( b 。和b 。) 之间的距离是相等的( 2 1 a ，f e - f e ) ，所以并不能排除两 个单体间能够传递或共享电子的可能性( x i ae ta l ，1 9 9 7 ) 。 1 2 7o y t 以厂的晶体结构研究 一些研究人员曾先后获得了来自莱茵衣藻c y t 如，的8a 分辨率的二维晶体 结构( m o s s e re ta l ，1 9 9 7 ) 、来自菠菜c y t 岛，的2 0a 分辨率的二维晶体结构 ( d i e t r i c ha n dk u h l b r a n d t ，1 9 9 9 ) 和来自嗜热蓝藻( m l a m i n o s u s ) c y t 如f 的 9a 分辨率的三维晶体结构( h u a n ge ta l ，1 9 9 9 ) 。2 0 0 3 年，美国科学家和法国 科学家分别从嗜热蓝藻膨l a m i n o s u s 和单细胞的淡水绿藻，莱茵衣藻c r e i n h a r d t i i 中获得了分辨率为3 1 a 和3 0a 的c y t6 ，的三维晶体结构 ( k u r i s ue ta l ，2 0 0 3 , s t r o e b e le ta l ，2 0 0 3 ) 。 c y t 埘二聚体在囊腔侧约为1 2 0x7 5a ，在基质侧约为9 0x5 5a ，跨膜长 度约为1 0 0a 。每个单体分子含有4 个大亚基，4 个小亚基，共1 3 个跨膜a 一螺 旋。除含有1 分子的c h la 和1 分子的9 一c j 广b - c a r 分子外，还发现在c y t 岛 亚基上结合有1 个新型的血红素c l ( h e m ec l 或称h e m e x ) 高分辨率的c y t 绁三维晶体结构的解析，使我们对c y tw 的组成和空间 结构有了更为详细、全面的认识。c y t 如，的三维晶体结构在肯定许多已有的光 谱学和动力学研究结果的同时，也提出了诸如c y t 玩f 蛋白复合体中h e m ec 。的 结构与功能，c h la 分子和类c a r 分子存在的生理意义等一系列的新问题。因此， 认真分析c y t 如，三维晶体结构，尽快解决出现的新问题对更加深入系统地了解 c y t 尻f 的生理功能具有十分重要的意义。 1 3c y t 岛尹的生理功能 与线粒体呼吸链中的c y tb c ，相似，类囊体膜中c y t 尻，的主要生理功能是 进行电子传递及与此相伴随的质子跨膜转运，由此建立膜两侧间质子梯度为合 成a t p 提供原动力。同时，c y t 岛，还参与调节激发能在两个光系统之间的分配 及光合作用产物n a d p h 与a t p 的比例，使光合作用在变化的环境中保持最佳效 能。另外，还有报道认为c y tw 可能参与细胞凋亡的调控作用( d a v i e se t 1 3 细胞色素饥，蛋白复合体中叶绿素日的性质和功能研究 a l ，1 9 9 0 ( a ) ；1 9 9 0 ( b ) ) 。 1 3 1 在光合电子传递及质子转运中的作用 大多数的研究者认为，c y t 甜催化电子传递和质子转运的分子机理部分或 完全遵循“q 一循环”模型，此模型最初是m i t c h e l l ( 1 9 7 5 ) 于1 9 7 5 年依据对 c y tb c ，的研究成果提出的，以后经过许多人的多次改进，现已成为解释线粒体 c y tb c ，和光合细菌c y tb c ，功能机制的标准模型，也被一部分人用来解释c y t 饥f 的电子传递和质子转运机制( w i k s t r s ma n ds a r a s t e ，1 9 8 4 ； c r o f t sa n d w a n g ，1 9 8 9 ；a l l e n ，2 0 0 4 ) 。 按照改进后的q 一循环模型( 图1 - 8 ) ，c y t 耵上有两个质体醌( p q ) 的结 合部位( q o 和q ，) ：醌氧化中心q 。是还原态质体醌( p q h ：) 结合并被氧化的部位， 醌还原中心q 。是氧化态质体醌( p q ) 结合并被还原的部位；q 。在膜的p - s i d e ， 即类囊体膜的内侧( 囊腔侧) ，q r 在膜的另一侧，n - s i d e ，即基质侧。p q h ：在q o 被氧化时，它的第一个电子( e ) 循高电位电子传递路径传递，即p q h 。一 r i e s k e f e - s 一c y t 产p c ；而它的第二个电子则循低电位电子传递途径传递， 先到低电位的c y t b ( b o ，再跨膜到高电位的c y tb ( b 。) 。b 。与q o 同在膜的一侧， 而b 。和q ，同在膜的另一侧。p q h ：在失去2e 一的同时，它的两个质子被释放到附 近的p - s i d e 间质中，因此p q h 。被氧化成了p q 。b h ( 被还原的b 。) 随后把存在 于q r 部位的p q 还原成p q - ( 半醌阴离子) ，下一个p q h ：氧化时产生的b - h 及来自 n s i d e 间质的2 盯再进一步把p q 。还原成p q h ：。这样，每2 个p q h ：在q o 被氧化 成2 个p q 时，就有2e 一向前( c y tf 方向) 传递，2e 。向b 。跨膜传递，在q r 产 生1 个p q h ：，同时向p - s i d e 释放4 h * 而从n - s i d e 吸收2 h + 。这就是一个q 一循 环过程，其总效果是氧化1 分子p q h ：为p q ，向前传递2e 。，跨膜转运4 矿，旷 e 比值等于2 。也就是说，c y t 岛f 每向前传递1 个电子就伴随着两个质电子 的跨膜转移。 1 3 2 对激发能分配及光合产物的调控作用 除传递电子和转运质子外，c y t 绁还具有调节激发能在p s i i 和p s i 之间 的分配，以维持光合作用原初过程高效转能的功能及调节光合产物a t p n a d p h 比例的作用( a n d e r s o n ，1 9 9 2 ) 。早在2 0 世纪6 0 年代初期，光合作用两个光反 应以串联方式协同进行的电子传递“z 链 图式确立之后，人们就意识到光合作 1 4 第一章前言 圈卜8c y t 缸，催化类囊体膜上电子传递和质子转运功能的示意图 ( a ) c y t “r 催化反应在类囊体膜上的位置：( b ) o o 位点的反应；( c ) qr ( q - ) 位点的反应；( d ) c y t 岛，整体的结构功能示意图( 引自a 1 f e n 2 0 0 4 ) 。 细胞色素6 。，蛋白复合体中叶绿素a 的性质和功能研究 用原初过程的光能转化效率取决于色素吸收的激发能在两个光系统之间的均衡 分配。6 0 年代末已经证明，光诱导小球藻细胞内“状态i 和“状态i i ”的相 互变换是光合作用为适应环境光质、光量快速变化的重要调节机制( i z a w aa n d g o o d 。1 9 6 6 ：b o n a v e n t u r aa n dm y e r s1 9 6 9 ：m u r a t a ，1 9 6 9 ) ，且这种变换过程 受捕光色素蛋白复合体( l h c i i ) 磷酸化脱磷酸化的控制( b e n n e t te t a l ，1 9 8 0 ；b a r b e r ，1 9 8 2 ) 。当p s i i 相对于p s i 被光照过分激发时，l h c i i 激酶 被激活，使l h c i i2 5k d 蛋白磷酸化。磷酸化的l h c i i 从位于基粒膜的p s i i 脱落下来，转移到基质膜区与p s i 结合，从而使分配到p s i i 的激发能减少而分 配到p s i 的激发能增多，完成从“状态i 到“状态i i 的转变。相反，当p s i 相对于p s i i 被过度激发时，就会发生从“状态i i 到“状态i 的转变，使激 发能有利于向p s l l 分配。过去一直认为l h c i i 激酶的活性受p q 库氧化还原状 态的控制，但后来通过突变体的研究证明，实际上控制l h c i i 激酶活化和“状 态i i 与“状态i ”相互转换的是c y t 如例如：在衣藻和高等植物中均已发 现缺失c y t 牡的突变体只能处于“状态i ，而不能向“状态i i 转变。此后， 通过生物化学方法及分子生物学技术亦进一步证明了这一结论。v a l l o n 等 ( 1 9 9 1 ) 采用部分分离与免疫细胞化学显微技术相结合的方法证实，玉米和衣藻 基质片层中c y t 如，的数量在“状态i i 时显著地多于在“状态i 的情形下， 这说明随着从“状态i 转变为“状态i i ，伴随有c y t 钳从基粒膜向基质膜 的迁移，而且这种重新分配的c y t 历，的相对数量( 3 0 - - - 4 0 ) 多于l h c i i ( 1 0 2 0 ) 。c y t 尻，在状态转换过程中能够在不同的膜区移动，这分别有利于线性 电子传递和循环电子传递，调节a t p 和n a d p h 。的合成。g a l 等( g a le ta l ，1 9 8 8 ； 1 9 9 2 ) 发现，在粗提的c y t 历，样品中存在有l h c i i 激酶活性。v e n d e r 等( 1 9 9 5 ) 在体外发现，当c y t 如，的q o 位点能够保持有1 个p q h ：分子，就可以使l h c i i 激酶保持活化状态，从而推测当c y t 如，的高电位电子传递链完全处于还原态、 q o 位点能够获得1 个p q h ：时，即可导致l h c i i 激酶的活化。z i t o 等( 1 9 9 9 ) 发 现，将莱茵衣藻形成q o 位点的关键序列p e w y ( 位于亚基i v 上的e pl o o p 区) 突 变为p w y e 后，p q h ：p q 在q o 位点的结合和l h c i i 激酶的活性会同时丧失，突变 体只能处于“状态i 的状态。这一发现直接说明p q h ：在q o 位点的结合是l h c i i 激酶活化的必须条件。h a s e l 等( 2 0 0 1 ) 发现，在粗提的c y t 彬制剂中含有 一种核基因编码的1 5 2k d 蛋白能够在状态转换过程中被可逆地磷酸化，可以 与c y t 如，一同在状态转换时在类囊体膜的基粒区和间质区之间移动，并发现该 1 6 第一章前言 蛋白在缺失c y t 钆f 的突变种中消失。因此，他们认为该蛋白是c y t 尻，的第5 个大亚基，在氧化还原控制的短期和长期光合器适应环境变化的过程中可能起 信号传导的作用。最近m a o 等( 2 0 0 2 ) 通过b o 、p b q 和d b m i b 三种醌类化合物对 蓝细菌状态转换调节激发能分配影响的研究亦证明，c y t 彬参与了此调节过程。 此外，还有大量的实验证据表明，c y t 岛，参与使植物适应天气、季节变化等因 素引起的慢光变化的调节过程。进一步研究和揭示这些调控作用的分子机理， 对于阐明光合高效转能的分子机制和提高光合效率的生物改造工程均具有重要 的意义。 1 4c h ia 单线激发态淬灭的途径及c y t 岛厂中c h ia 单线态淬灭机制 的研究 1 4 1c h ia 单线激发态淬灭的途径 叶绿素( c h l o r o p h y l l ) 是一类绿色的色素，在高等植物中，叶绿素包括叶 绿素a ( c h la ) 和叶绿素b ( c h l6 ) 两种。叶绿素的主要功能是吸收和传递光 能，只有少数的c h l 昂具有光敏化的特性，能进行光化学反应，成为反应中心 c h la 。叶绿素的共同特征是分子中含有一个卟啉环和一个长链的叶绿醇，卟啉 环中的四个n 原子分别和m 9 2 + 配位。c h la 对光波的吸收主要分为两个区域( 蓝 区和红区) 。在通常情况下，未被光活化的叶绿素分子处在它的最低能级状态， 即基态。当吸收一个红光光子被激发以后，跃迁到单线激发态，处于这种高能 状态的分子是不稳定的( 寿命约为1 0 川秒) ，它一般通过下面几种途径去激发， 释放能量回到稳定的基态( 匡廷云，2 0 0 3 ) ： 1 非辐射去激发：能量以热的形式耗散以这种形式从第一单线激发态回到基 态发生的时间尺度为纳秒范围。 2 发生荧光和磷光：当叶绿素分子从第一激发态回到基态时，会伴随着荧光的 发射。其寿命为1 0 叫秒。每1 0 0 个吸收了光的叶绿素分子中约有3 0 个会发射荧 光。叶绿素的磷光是由其激发的三线态回到基态时发出的，它的寿命较长，在 1 0 - 3 一- 1 0 _ 2 秒，但强度只有荧光的1 。 3 系间窜跃：叶绿素的激发三线态一般由激发单线态经系间窜跃而产生。通常 情况下，激发三线态在发射磷光之前就会被一些淬灭剂所淬灭而回到基态，最 1 7 细胞色素良厂蛋白复合体中叶绿素日的性质和功能研究 典型的淬灭剂为氧分子，它能和三线态叶绿素发生能量传递而形成活性很高、 对生物体破坏很强的单线态氧。 4 激发能传递：激发态的分子把其激发能传递给邻近的分子而回到基态，这一 过程中没有光子的释放和交换。光系统i i 捕光天线中的色素分子之间就是以这 种方式传递激发能的，其机理以f o s t e r 机制、电子交换的d e x t e r 原理和激子机 制为主，传能时间在飞秒和几个皮秒之间。 5 电荷转移：象激发能传递一样，电荷转移发生在激发态的分子和基态分子之 间，不过与激发能传递不同的是，激发态分子中被激发的电子发生了转移。电 荷转移的时间发生的时间尺度很广，从皮秒到秒不等，这主要与发生电荷转移 的分子之间的距离有关。这方面最典型的例子就是光系统光反应中心受激的c h l a 分子进行的原初电荷分离反应。 以上这几种过程有可能同时发生并且相互竞争。比如抑制原初光化学反应 ( 反应中心c h l 日的电子传递) 可以使荧光发射增强，因此荧光产率变化的测 定已成为光能转换研究中一种重要的监测手段。叶绿素分子对蓝光有更强的吸 收，蓝光光子的能量可以使色素分子跃迁到更高的激发单线态( 第二单线激发 态) ，但是这种高能分子更不稳定( 寿命只有1 0 - 1 2 s 左右) ，它迅速的经过许多 小阶段( 如亚稳态) ，以非辐射的方式去激发失去部分能量而跃迁到第一单线激 发态，这种跃迁过程甚至在荧光发射和光化学反应之前就已经完成，因此这部 分能量对光合作用是无意义的。 1 4 2c y tb o f 中c h i 宣单线激发态淬灭的研究 p e t e r m a n 等( 1 9 9 8 ) 对c y t 绁中c h l a 的吸收和荧光特性进行了比较详细的 研究。最近d a s h d o r j 等( 2 0 0 5 ) 在p e t e r m a n 等研究基础上对c y t6 ，中c h l a 单线激发态的寿命进行了检测，结果表明c h l a 单线激发态的寿命很短，在2 0 0 p s 左右。c y tw 中的c h la 单线激发态的快速淬灭与其结合在蛋白复合体中的蛋 白微环境有关。参照c y t 钳的晶体结构，c h la 的单线激发态的快