组织工程学天然高分子材料之胶原.ppt

组织工程学 天然高分子材料 胶原 骨组织的等级结构hierarchicalarchitechtureofbone 骨的等级结构 1 密质骨和松质骨 2 密质骨骨单位和哈氏管 3 骨层板和 4 胶原纤维组成的胶原纤维束 胶原纤维结构组成 胶原分子中间部分的氨基酸排列 a 每个第三个氨基酸残基是甘氨酸 x和y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基 b 甘氨酸是最小的氨基酸 c 三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内 而另外两个残基处于螺旋表面 d 脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合 增强分子的刚性 疏松结缔组织 成纤维细胞 巨噬细胞浆细胞 肥大细胞细胞 脂肪细胞未分化的间充质细胞白细胞组成 胶原纤维纤维 弹性纤维网状纤维蛋白多糖基质 纤维粘连蛋白组织液 typicalextracellularmatrix 细胞外基质 extracellularmatrix ecm ecm是细胞外大分子构成的网络 包括 胶原 非胶原糖蛋白 氨基聚糖与蛋白聚糖 弹性蛋白等 结缔组织中含量较高 影响细胞的存活 死亡 增殖和分化 collagen胶原 胶原是动物中的主要纤维蛋白 是所有多细胞动物 包括海绵体 无脊椎动物和脊椎动物的细胞外基质的主要结构成分 胶原原纤维占人和高等动物总蛋白量可高达30 其作用是保持组织完整以及提供每一个结缔组织所需要的特殊力学性能 人体中有16 左右是蛋白质 胶原占体内蛋白质总量的30 40 主要存在于皮肤 肌肉 骨骼 牙齿内脏和眼睛瞪部位 从生物医学角度 胶原在发育 伤口愈合 血小板活化和血管生成中具有重要作用 另外很多遗传病的起因也被证明是由于胶原发生了突变 而胶原在其合成 降解或免疫学方面的微小变化也可以引起许多疾病 胶原的结构 胶原是一类由20种常见的氨基酸合成而来的蛋白质 但是它在氨基酸组成 重复的序列模式 高度的翻译后修饰和特有的分子内交联上别具一格 天然的胶原蛋白是一个由3条具有左手螺旋的链相互缠绕形成右手超螺旋的分子 胶原的超螺旋结构是靠链间氢键以及螺旋和超螺旋的反向盘绕维持其稳定性的 原胶原 3条肽链形成的螺旋 含三种结构 螺旋区 非螺旋区及球形结构域 structuralfeatures allcollagenmoleculesaretrimersconsistingofthreepolypeptidechains called chains alongatleastpartoftheirlength thethreepolypeptidechainsofacollagenmoleculearewoundaroundeachothertoformaunique rod liketriplehelix 一个典型的胶原分子长300nm 直径为2 5nm 在每一条左手螺旋的胶原链内 每一圈螺旋需要3个氨基酸残基 胶原螺旋的螺旋度不象 螺旋那么高 胶原螺旋的左手性 以及胶原的许多刚性源于许多脯氨酸残基的立体限制 胶原分子的末端含有非螺旋部分 这一部分似乎对纤维形成过程中胶原分子的正确排列以及交联是必需的 典型的胶原螺旋在任一圈的第3个位置上都含有甘氨酸残基 胶原的特点是具有重复的 gly x y 序列 其中x常常是脯氨酸 而y是4 羟脯氨酸 它是脯氨酸的共价修饰衍生物 脯氨酸和4 羟脯氨酸的总和占胶原分子中残基数的四分之一 除了4 羟脯氨酸外 5 羟赖氨酸也常出现在胶原分子中 一条链上的每一组 gly x y 中的甘氨酸残基的酰胺氢原子都能与一个相邻链上的残基x的羰基氧原子之间形成分子内氢键 脯氨酸和羟脯氨酸残基在胶原的结构中起着至关重要的作用 这些残基的有限的构象松弛度不仅可以防止 螺旋的形成 而且可以使得胶原螺旋和胶原纤维本身显示出点刚性 羟脯氨酸残基的羟基参与形成的氢键将使胶原三股螺旋更稳定 胶原分子中间部分的氨基酸排列 a 每个第三个氨基酸残基是甘氨酸 x和y通常是脯氨酸和羟脯氨酸残基 b 甘氨酸是最小的氨基酸 c 三股螺旋使得甘氨酸残基指轴内 而另外两个残基处于螺旋表面 d 脯氨酸和羟脯氨酸的残基与多肽链结合 增强分子的刚性 甘氨酸gly 脯氨酸pro 羟脯氨酸hyp 原胶原分子二级结构 原胶原形成胶原纤维 胶原纤维电镜图 胶原类型 在原纤维中发现了20种胶原 其中5种含量最丰富的胶原类型是 i型胶原是骨 腱 角膜和韧带中的主要胶原 最高可达体内所有胶原的90 ii型胶原在软骨 玻璃体和脊索中形成原纤维 iii型胶原与i型胶原并存于结缔组织 v型和vi型为异三聚体 与其他三种胶原共存于原纤维中 由成纤维细胞 软骨细胞 成骨细胞 上皮细胞分泌 在rer上合成 形成三螺旋之前于pro及lys残基上进行羟基化修饰 羟化反应由脯氨酰4羟化酶 p4h 脯氨酰3羟化酶催化 p3h vc是酶的辅助因子 vc缺乏导致坏血病 交联 由侧向相邻的lys或hyl残基氧化后所产生的两个醛基间进行缩合而成 交联后后形成不溶性纤维 原胶原呈阶梯状排列 电镜下可见间隔67nm的横纹 胶原的体内合成 翻译 collagenfibrilbundles abranchingassemblyunitintendonmorphogenesis temimageofcollagen 胶原的一般生化特性 变性 胶原变性是指三股螺旋之间的氢键断裂 螺旋解开 形成单链无规则线团 因而发生性质的改变 比如粘度下降 沉降速度增加 浮力上升 紫外吸收增加等 加热 改变胶原溶液的ph值或受有机溶剂 如乙醇 尿素 甲酰胺及丙酰胺等 等影响 均可使胶原变性 通常把50 胶原分子发生变形的温度称为变性温度td denaturationtemperature 由于这一现象和结晶的熔解相类似 故又称为熔点或熔解温度 胶原的变性温度与羟脯氨酸的含量呈正相关 其它生化特性 天然胶原除非先经尿素处理使之变性 否则不易溶于碱 弱酸及一般浓的中性盐类 等电点为ph7 7 8 在强碱下长时间浸渍 其等电点会下降至ph4 7 5 3 并伴有溶解现象 胶原不溶于水 但可溶于热水 膨润的胶原经加热后 会产生不可逆收缩 加热至63 65 时 纤维长度变为原来的1 9 若再加热 三股螺旋分开 发生热变性 形成明胶 未变性的胶原可被酸性红染成红色 变性者则否 胶原的提取 牛肌腱胶原的制备 将湿重100克牛肌腱洗净 0 5 tris处理后取出肌腱进行切片 用75 酒精溶液进行消毒处理 用灭菌蒸馏水冲洗后用匀浆器匀浆 再用灭菌蒸馏水洗涤 以5000r min离心15分钟 收集沉淀再悬浮于生理盐水中1小时 以5000r min离心15分钟 再将肌腱悬浮至于1 5l含水果蛋白酶2mg的0 05mol l的醋酸溶液中 在4 下慢慢搅拌消化72小时 以5000r min离心15分种 将上清液用0 lmol l的naoh调节ph值至中性 加入nacl至最终浓度达2 5mol l左右 搅拌过夜 在中性条件下进行盐沉淀 以5000r min离心15分种 沉淀即主要为1型胶原蛋白 将沉淀用冷的灭菌蒸馏水作短时间洗涤 然后溶解在0 05mol l的醋酸溶液中 以0 05mol l的醋酸溶液作透析外液在10 下透析2天 然后在ph为7 4的含130mmol l的nacl溶液中透析 物理改性方法 通过物理手段对胶原蛋白改性有紫外线照射 重度脱水 射线照射和热交联等方法 胶原溶液如被紫外线照射 将在分子间产生交联 粘度增加 生成凝胶 目前常用的紫外线改性胶原膜的方法是将胶原膜放在铝箔上 距离254nm紫外灯20cm高度 照射1 5h 对经紫外线照射的胶原膜进行力学性能和胶原酶试验表明 交联胶原膜的收缩温度ts和抗胶原酶解的能力均显著高于未交联胶原膜 重度脱水也是胶原蛋白物理改性中常用的方法 该法是通过脱水导致胶原分子间交联 从而增加变性温度 改善胶原的性能 物理方法改性胶原蛋白的优点是可避免外源性有毒化学物质进入胶原内 缺点是胶原交联度低 且难以获得均匀一致的交联 化学改性方法 主要是通过化学交联进行改性 交联剂按交联键发生的部位可分为两种 一种是分子内交联 它是在同一个螺旋内两条肽链之间形成的交联键 这类交联键主要影响交联产物的变性温度和拉伸强度等性能 另一种是分子间交联 它是在两条相邻的螺旋间的肽链中形成的交联键 这类交联键主要影响交联产物的溶胀性和表面延伸性 当两条微纤维之间的距离小于交联剂分子的长度时 交联也可以在两条相邻的微纤维之间发生 目前常用的化学交联剂有戊二醛 1 6 己二异氰酸酯 hdi 碳二亚胺 edc 叠氮二苯基磷 dppa 酰基叠氮化物 聚环氧化物以及京尼平等 将制备的胶原膜或者海绵置于0 25 戊二醛溶液中预交联10min后 浸泡于含0 25 戊二醛的0 05mol l醋酸溶液 于4 交联24h pbs缓冲液漂洗3次 化学交联 戊二醛交联法 戊二醛是到目前为止应用最广泛的蛋白质交联剂 其水溶液在室温下就能高效地与胶原缩氨酸链上的氨基反应 形成稳定交联 是一种同型双功能交联剂 其两个醛基可分别与两个相同或不同分子的伯氨基形成schiff碱 将两个分子以五碳桥连接起来 高浓度的gta与胶原分子赖氨酸或羟赖氨酸残基e2氨基反应 形成分子间交联 戊二醛与蛋白质交联的特点是活性高 反应快 产物稳定 对沸水 酸 酶的抵抗能力强 但有细胞毒性 且其用量难以控制 化学交联 edc交联法 1一乙基一3 3一二甲基氨基丙基 一碳化二亚胺 edc 是化学性质极为活泼的化合物 能使氨基和羧基之间形成酰氨键 其既可与羧基结合 也可与氨基结合 通常羧基与edc反应生成中间产物 再与另一分子的氨基反应而形成偶联物 edc反应的ph为5 9 一般胶原交联选择ph7左右 4 或室温24h 化学交联 edc交联法 将胶原海绵浸入50ml含50mmol l的2 n 吗琳 乙撑磺酸 mes 的体积分数为40 的乙醇溶液中 室温下浸泡30min 加入 edc 65mg和n 基唬拍酞亚胺 nhs 15mg 摇动使之溶解 室温下反应数小时 分别用无菌0 lmol lna2hp04 1mol lnacl和蒸馏水冲洗胶原海绵 再次冷冻干燥 应用 胶原可以用于制造止血海绵 创伤辅料 人工皮肤 手术缝合线 组织工程基质等 胶原在应用时必须交联 以控制其物理性质和生物可吸收性 戊二醛和环氧化合物是常用的交联剂 残留的戊二醛会引起生理毒性反应 因此必须注意使交联反应完全 胶原交联以后 酶降解速度显著下降 应用 作为药物和基因输送系统 缓释剂是指能够延缓药物释放 持续释药8小时以上的一类制剂 胶原材料不仅生物相容性好 而且可通过降解机制控制药物释放的速度 在生物材料领域有较多研究应用 在药物缓释剂中 胶原或变性胶原明胶主要被用作药物载体 赋型剂或缓释壳层等 缓释系统的形式有多种 如膜 海绵 片 微胶囊等 早在20世纪70年代 国外就有用无端肽再生胶原制成的0 01一0 5mm膜 对吸收的药物可缓慢释放的报道 随后 又相继对胶原药物缓释体系进行了研究 胶原可吸收性缓释药膜 伤口控释抗生素 缓释微胶囊已有报道 应用 组织工程 胶原不仅可生物降解 促进细胞生长代谢 还可与其他天然高分子 无机或有机材料以及生物材料复合 这些优点使其在组织工程中优势明显 近年 胶原在组织工程中的应用研究主要有以下几方面 活性人工皮肤作为各类组织培养系统的支架 胶原与其它化合物或聚合物复合后 可用于矫形外科或修复骨缺损 目前 一般是利用胶原与羚基磷灰石结合制成复合材料植入人体修复骨缺损 国内外有不少胶原复合物在骨组织工程中应用的报道 表明胶原在骨组织工程中有3种作用 作为支架材料 可为骨细胞的生长提供支架和促进新骨生存 胶原的止血作用 具有覆盖陶瓷或金属植入物的功能 例如透明质酸一胶原复合物系统作为注射骨替代材料 经动物及临床实验证实 复合物比单一或胶原具有更强的骨诱导性 胶原壳聚糖复合膜用于人工角膜 生物矿化 biomineralization 生物矿化是指在生物体内形成矿物的过程 与普通水溶液中无机盐的形成不同 生物体内矿物的形成 是在特殊反应介质 有机基质和细胞的参与下完成的 生物膜所具有的高度有序环境对矿物晶体产生定向诱导 控制其成核 生长和聚集等过程 其矿化机理涉及有机大分子预组织 界面分子识别 生长调控和细胞加工等 由于生物矿化过程的复杂性 目前常用脂质体 囊泡 胶束 微乳液 自组装膜 sams 单分子膜和液晶等体系作为模板 模拟有机基质的调控作用和生物大分子的指导作用 自组装 self assembly 所谓自组装 是指基本结构单元 分子 纳米材料 微米或更大尺度的物质 自发形成有序结构的一种技术 在自组装的过程中 基本结构单元在基于非共价键的相互作用下自发的组织或聚集为一个稳定 具有一定规则几何外观的结构 自组装过程并不是大量原子 离子 分子之间弱作用力的简单叠加 而是若干个体之间同时自发的发生关联并集合在一起形成一个紧密而又有序的整体 是一种整体的复杂的协同作用 纳米 羟基磷灰石 胶原复合材料的制备和表征 自组装的方法制备nhac的新思路 这种方法的思路是在胶原分子自组装的同时制备纳米相的羟基磷灰石 胶原复合材料 按照这种方法得到的材料从成分上和结构上都和天然骨有着很大的相似性 相对于传统胶原 羟基磷灰石复合材料来说 由于此材料中羟基磷灰石是纳米相 材料具有更好的生物学性能 作者对这种材料的理化性能进行了表征 并讨论了动力学因素对nhac材料制备过程的影响 制备方法1 在酸溶的胶原溶液中缓慢滴加含有po43 的溶液 po43 的量为每克胶原0 055mol滴加的同时搅拌 胶原溶液的浓度为0 02g 30ml 2 搅拌同时缓慢滴加含ca2 的水溶液于步骤1制备的溶液中 加入的ca2 量与第1步中加的po43 的摩尔比为ca p 1 66 3 搅拌时缓慢滴加naoh溶液至ph值为6 8 ph值用试纸或ph计测定 在ph值为5 6时开始出现沉淀ph值为7时出现白色悬浊液 4 静置溶液1 2天 除去上清 离心分离出沉淀 用去离子水反复清洗三次后 放入冻干机内冰冻干燥 随后研磨制成干粉 样品的分析测定对得到