（微生物学专业论文）丛枝菌根真菌对紫穗槐固氮能力的影响.pdf

中文摘要 中文摘要 丛枝菌根真菌( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a lf u n g i ，a m f ) 能与8 0 的陆生植物共生， 形成丛枝菌根( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a ，a m ) ，这种菌根结构在根内表现为丛枝状 的菌根结构，在根外表现为大量菌丝及孢子。大量菌丝的形成能够增大植物根系 与土壤的接触面积，促进植物对营养物质的吸收，促进植物生长。丛枝菌根真菌 能够侵染豆科植物紫穗槐( a m o r p h af r u t i c o s al ) ，形成丛枝菌根结构；根瘤菌 ( r h i z o b i a ) 也能够侵染紫穗槐，形成根瘤结构；三者可以共生，形成丛枝菌根真 菌紫穗槐一根瘤菌三重共生关系。 本试验主要研究丛枝菌根真菌对紫穗槐固氮能力的影响。试验测定了紫穗槐 根际土壤固氮酶活性、脲酶活性、叶片硝酸还原酶活性、土壤和植株氮素含量、 紫穗槐生物量、丛枝菌根真菌和根瘤菌对紫穗槐侵染的时空变化等指标。 试验结果表明单接种丛枝菌根真菌处理、双接种丛枝菌根真菌和根瘤菌处理 | 的固氮酶活性均低于单接种根瘤茵处理。双接种丛枝菌根真菌和根瘤菌处理的脲 酶、叶片硝酸还原酶活性显著高于对照和单接种处理。通过对紫穗槐植株和土壤 氮素含量的测定结果，表明丛枝菌根真菌能够增强紫穗槐的固氮能力。同时试验 结果表明双接种丛枝菌根真菌和根瘤菌能够促进紫穗槐生长，在苗高、根长和植 株鲜重方面都优于对照处理。通过光学显微镜和透射电镜观察，证明丛枝菌根真 菌早于根瘤菌侵染紫穗槐，而且丛枝菌根真菌和根瘤菌可以生长在紫穗槐根系相 同部位。 本试验可以为丛枝菌根真菌在生物固氮中的作用奠定一定的理论基础，在改 善豆科植物固氮能力，提高作物产量和降低化肥用量等方面具有一定的现实意义。 关键词：丛枝菌根真菌；紫穗槐；根瘤菌；固氮能力；侵染时空变化 黑龙江大学硕士学位论文 a b s t r a c t n e a r l y8 0 o fa l ll a n dp l a n tf o r mas y m b i o t i cr e l a t i o n s h i pw i t l la r b u s c u l a r m y c o r r h i z a lf u n g ia sa r b u s c u l a rm y c o r r h i z a t h i ss t r u c t u r ep e r f o r m e da sv e s i c u l a rw h i l e s p o r e so u t s i d eo ft h er o o t t h el a r g ea m o u n to fm y c e l i u mi n c r e a s et h ec o n t a c ta r e a b e t w e e nt h er o o ta n ds o i l ，s oa st oi m p r o v et h en u t r i e n ta b s o r p t i o no fp l a n tt oa c c e l e r a t e t h ep l a n tg r o w t h t h ea m f u n g ic o u l di n f e c tt h el e g u m ep l a n ta m o r p h af r u t i c o s al t o f o r mt h ea r b u s c u l a rm y c o r r h i z as t r u c t u r e ，s od ot h er h i z o b i at of o r mt h en o d u l e t h e s e t h r e ec o u l df o r mt h ea m f u n g i - a m o r p h a f r u t i c o s al - r h i z o b i at r i p a r t i t es y m b i o s i s t h ec o n t r i b u t i o no fn i t r o g e nf i x a t i o no fa m f u n g it oa m o r p h af r u t i c o s al w a s s t u d i e d t h i ss t u d yt e s t e dt h ea c t i v i t yo f n i t r o g e n a s ei nt h er h i z o s p h e r i cs o i l ，a c t i v i t yo f u r e a s ei nt h er h i z o s p h e r i cs o i l ，a c t i v i t yo fl e a fn i t r a t er e d u c t a s e ，n i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n i nf r o n da n ds o i l ，b i o m a s so f a m o r p h a f r u t i c o s al ，t h et i m e - s p a c ev a r i a t i o no fi n f e c t i o n o f a m fa n dr h i z o b i a t h er e s u l ts u g g e s t e dt h a tt h et h ea c t i v i t yo fn i t r o g e n a s ei nt h er h i z o s p h e r i cs o i lo f i n o c u l a t i o na ma n dd i p l i n o c u l a t i o n ( a mf u n g ia n dr h i z o b i a ) i sl o w e rt h a ni n o c u l a t i o n r h i z o b i a i ts u g g e s t e dt h a tu r e a s ea n dl e a fn i t r a t er e d u c t a s eo fd i p l i n o c u l a t i o n ( a m f u n g ia n dr h i z o b i a ) i sh i g h e rt h a nn o n - i n o c u l a t i o na n dt h ec o n t r o li nc e r t a i np e r i o d t h e n i t r o g e nf i x i n gc a p a c i t yo fa m o r p h af r u t i c o s a l i se n h a n c e ds u g g e s t e db yt h e d e t e r m i n a t i o no fn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o ni na m o r p h af r u t i c o s al a n dt h es o i l i ti sa l s o s h o w e di nt h er e s u l tt h a td i p l - i n o c u l a t i o n ( a mf u n g ia n dr h i z o b i a ) c o u l de n h a n c et h e g r o w t ho fa m o r p h af r u t i c o s al e s p e c i a l l yi nt h ea s p e c t so fh e i g h to fs e e d l i n g ，r o o t l e n g t ha n df r e s hw e i g h to ft h eh o s tc o m p a r e dt ot h ec o n t r 0 1 i ti sp r o v e dt h r o u g ht h e o b s e r v a t i o no fo p t i c a lm i c r o s c o p ea n ds c a n n i n ge l e c t r o nm i c r o s c o p yt h a tt h ei n f e c t i o n o fa mf u n g it oa m o r p h a f r u t i c o s al i se a r l i e rt h a nt h a to fr h i z o b i a , a n dp a r to fa m f u n g it i s s u ei sf o u n di n s i d et h er o o tw h e r et h en o d u l ef o r m s t h i ss t u d yw i l li m p r o v et h et h e o r yo fb i o l o g i c a ln i t r o g e nf i x a t i o nw i t ha r b u s c u l a r m y c o r r h i z a lf u n g i t h er e s u l t sc a l l b e u s e df o ri m p r o v i n gt h e b i o l o g i c a ln i t r o g e n u a b s t r a c t i i i i i i i i i i i i i i i i - - i i i i i i i i i i i i i i i i i i i i f i x a t i o na b i l i t yo fl e g u m ep l a n t i ti sr e a l l yh e l p f u lt oi n c r e a s et h ep r o d u c t i o no fc r o p a n dc u t t i n gd o w nt h ea m o u n to fc h e m i c a lf e r t i l i z e r k e yw o r d s ：a r b u s c u l a rm y e o r r h i z a lf u n g i ；a m o r p h af r u t i c o s al ；r h i z o b i a ；n i t r o g e n f i x a t i o nc a p a b i l i t y ；t i m e - s p a c ev a r i a t i o no fi n f e c t i o n - ! i i 攻读学位期间发表的学术论文 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得墨蕉堑太堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。 学位论文作者签名：签字日期：年月日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解墨蕉、江太堂有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本 人授权墨蕉婆太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。 学位论文作者签名：导师签名： 签字日期：年月日签字日期：年月 e t 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 通讯地址： 电话： 邮编： 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 丛枝菌根真菌概述 丛枝菌根真菌( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a lf u n g i ，a m f ) 是一种专性共生真菌，可以 和自然界中绝大多数植物形成互惠共生联合体【1 1 。丛枝菌根真菌分布广泛，从南极 到北极都有丛枝菌根真菌的分布【2 】。可存在于农田、森林、沙漠、煤渣、盐碱地、 贫瘠土壤、湿地【3 】、火山、极地海岛、退化草原等生态环境中，能够侵染约8 0 的 陆生植物，形成共生关系丛枝茵根( a r b u s c u l a rm y c o r r h i z a ，a m ) 。地球上9 0 的维管植物都能形成丛枝菌根【4 】，这种共生的丛枝菌根结构能够扩大根系吸收范围 【5 1 ，改善植物的营养状况，促进植物生长，提高作物产型6 1 ，提高植物的抗逆性和 抗病性，同时对于自然界中植物之间碳的迁移、对于维持寄主植物的多样性和植 物资源分布有重要作用，对于维持生态系统的功能和稳定性有重要意义【7 1 。迄今丛 枝菌根真菌尚不能完全在离体条件下纯培养 8 1 ，只能将其接种在活体根系上，与寄 主植物一起生长发育，才能得到其繁殖体【9 1 。 十九世纪中期，u n g e r ( 1 8 4 0 ) 和r y l a n d ( 1 8 4 2 ) 相继发现水晶兰( m o n o t r o p a 坳印f 们l ) 的根部常常被一层浓密的真菌菌丝体包围，并推测这些真菌是水晶兰 的寄生菌【1 0 】。俄国人k a m i e n s k i ( 1 8 8 1 ) 认为水晶兰根系上的真菌给植物提供了营养， 并非寄生，它们之间具有共同生活的关系。后来a n t o n 提出“共生 ，即“一起 生活”( 1 i v i n gt o g e t h e r ) ，这一概念的提出对菌根研究具有划时代和深远的意义【l l 】。 德国植物病理学家f r a n k ( 1 8 8 5 ) 首次使用菌根一词【12 1 。1 8 8 5 1 9 5 0 年，内生菌根 研究在欧洲大陆发展，在观察描述等方面都有成果，对兰科植物菌根研究取得重 大成果。1 9 5 0 1 9 6 0 年，研究丛枝菌根真菌的方法基本确立。创立“纯盆培养法” 来分离土壤中或根系内的丛枝菌根真菌。采用“湿筛技术 从土壤中分离出丛枝 菌根真菌孢子【1 1 1 。1 9 6 0 1 9 7 0 年，n i c o l s o n 和g e r d e m a n n ( 1 9 6 8 ) 描述了丛枝菌根真 菌的第一个种，g e r d e m a n n ( 1 9 6 8 ) 研究丛枝菌根与土壤中磷吸收的关系，同年发 表“菌根与植物生长 的综述文章，肯定了菌根对植物生长的积极作用【1 3 】。s a f i r 黑龙江大学硕士学位论文 ( 1 9 6 8 ) 开始研究丛枝菌根真菌与植物病原菌的关系和丛枝菌根超微结构。 1 9 7 0 1 9 8 0 年，p h i l l i p s 等( 1 9 7 0 ) 改进了根系透明和染色方法，可以通过显微镜快 速镜检。对丛枝菌根的生理生化代谢的研究也全面展开。s a f i r ( 1 9 7 1 ) 发表“菌 根增强大豆水分运输 的论文，开始探索丛枝菌根真菌与植物水分状况的关系【1 4 】。 分类学上也取得一定进展。1 9 8 0 - 2 0 0 0 年，各种专著和学术会议在全世界许多国家 兴起，例如1 9 9 0 年出版的m y c o r r h i z a 学报和世界菌根会议是其中很有代表性的。 不少国家建立了具有集菌根真菌保藏、研究、开发和应用功能为一体的“中心”。 在丛枝菌根真菌实际应用方面，研究土壤肥料和丛枝菌根真菌对植物生长的关系 以期使用生物肥料取代化学肥料【1 5 】，获得健康农田土壤以利于作物生长【1 6 1 ；研究 在石油和重金属等污染环境中生长的丛枝菌根真菌有助于在污染土壤中植物的生 长和土壤的改良f 1 7 , 1 8 , 1 9 】，应用丛枝菌根真菌改善生态环境2 0 ，2 1 1 等。近来，越来越多 的各相关领域的科学家参与到丛枝菌根真菌的研究中来。在改进试验方法上，毕 银丽等( 2 0 0 7 ) 改进了湿筛法和曲利本兰染色法，更利于野外采集样品时迅速分 析土壤中的孢子密度1 2 2 。丛枝菌根真菌的研究方法已达到分子水平，利用分子生 物学方法鉴定丛枝菌根真菌及其在土壤中的群落结构，如用d g g e 技术研究土壤 中丛枝菌根真菌的群落结构【2 3 1 ，证实a m 真菌对植物病原菌的抑制效应【2 4 1 ，采用 分子水平研究干旱胁迫条件下丛枝菌根真菌中编码结合蛋白的正调节基因【2 5 】等。 我国在5 0 年代末对马尾松菌根首先开展了研究，主要集中在外生菌根对松属 植物生长的影响方面。7 0 年代末开始了内生菌根即丛枝菌根的研究。8 0 年代后进 展迅速，在丛枝菌根的分类与资源【2 6 1 、生理效应【2 7 1 和生态学2 8 1 等方面开展了系统 研究工作；对主要造林树种中的菌根应用技术达到国际先进水平；在菌根研究技 术方面，李晓林等( 1 9 9 2 ) 建立了格网分室盆栽体系以测定丛枝菌根真菌接种势 的新方法【2 9 1 ；提出了菌根真菌诱导植物抗病性的理论 3 0 1 。目前，国内有关丛枝菌 根真菌提高作物产量品质，提高植物耐盐性【3 1 ，3 2 3 3 1 、高温耐受性和促进植物在污 染土壤中生长【3 5 州，改善土壤质i t 3 7 】和生态环境1 3 明等方面的研究屡见报道。 第1 罩绪论 1 2 丛枝菌根真菌的生态生理 1 2 1 丛枝菌根真菌的生态分布 在对早期陆生植物地下器官化石研究中，描述过与菌根真菌极为相似的真菌， 表明根和菌根真菌或许是一起进化的，在它们起源的生物群落里可能恰当地结合 起来以适应生存的需要。丛枝菌根真菌分布广泛，从南极到北极都可以找到丛枝 菌根真菌的分布。从全球角度以及茵根类型来看，热带以丛枝菌根为主；亚热带 是外生菌根和丛枝菌根混合分布；温带针叶林主要是外生菌根；极地分布着杜鹃 花科植物菌根等【2 1 。与植物具有的丰富物种资源相似，由于进化历程和生存条件的 差异，a m 真菌也具有丰富的种质资源。不同的丛枝菌根真菌与宿主植物的亲和 性不同；且环境条件对菌根形成和效应影响很大【3 9 】。这些真菌几乎在所有的陆生 生态系统中都有，被认为是陆生生态系统中的第二大生物量组分。茵根有着广泛 的分布，从水生到沙漠、从低地热带雨林到高地，甚至树冠的附生植物上以及严 重胁迫的环境中都有菌根关系的存在。 迄今世界范围内已报道丛枝菌根真菌新种1 7 4 个，其中无梗囊霉属 ( a c a u l o s p o r a ) 3 4 个，原囊霉属( a r c h a e o s p o r a ) 3 个，内养囊霉属( e n t r o p h o s p o r a ) 5 个，巨孢囊霉属( g i g a s p o r a ) 9 个，球囊霉属( g l o m u s ) 9 3 个，类球囊霉属 ( p a r a g l o m u s ) 2 + ，盾巨孢囊霉属( s c u t e u o s p o r a ) 2 8 个。这一数目比1 9 8 8 年s e h e n c k 和p 6 r 6 z 的统计结果增加了5 0 个【3 9 1 。迄今我国已经报道了7 个属9 9 种a m 真菌( 记录种 8 7 个，新种1 2 个) ，包括无梗囊霉属2 1 种，原囊霉属2 种，内养囊霉属3 种，球囊霉 属5 6 种，巨孢囊霉属3 种，类球囊霉属1 种，盾巨孢囊霉属1 3 种 7 1 。 。1 2 2 丛枝菌根真菌的分类及类型 分类学方面，m o r t o n 和b e n n y ( 1 9 9 0 ) 提出一个新的丛枝菌根真菌分类系统 新立球囊霉目( g l o m a l e s ) ，下分两个亚目：球囊霉亚目( g l o m i n e a e ) 和巨孢囊霉亚目 ( g i g a s p o r i n e a e ) ，共包括3 科6 个属。 根据菌根着生于植物根系的特点，菌根分为外生菌根、内生菌根、内外生菌 根3 个主要类型。内生菌根又分为丛枝菌根、杜鹃类菌根和兰科菌根。丛枝菌根 黑龙江大学琢士学位论文 是最普遍的一种类型【4 q 。内生菌根真菌菌丝穿八到高等植物的根部细胞里，在细 胞内进行繁殖，也有苗丝附着于根系表面，此即内生苗根p “。 丛枝菌根( a m ) 的孢子在土壤或根中形成，根中菌丝线状或卷曲状蔓延。其 胞内菌丝体呈泡囊状和丛枝状，如图1 - 1 所示。并非所有类型的该类真菌都形成泡 囊结构，但都形成丛枝结构【4 ”，如图1 2 所示。 根据参与共生的真菌和植物种类及它们形成共生体系的特点，菌根分成7 种类 型，即丛枝苗根、外生菌根、内外菌根、浆果鹃类菌根( a b u m i dm y c o r r h i z a s ) 、水 晶兰类菌根( m o n o t r o p o i dm y c o m z a s ) 、欧石楠类苗根( c r i c o i dm y c o r r h i z a s ) 和兰科菌 根( o r c h i dm y c o r r h i z a s ) 。 ir n ”气 ll l 飞1 nl 。 l - l i 圈_ l i ii 礤獭 图1 - 1 宿主根皮层中的a m 真菌【1 i f i g , 1 - 1 a m f u n g i i n t h ec o r l e x o f h o s t m o t 图1 2 根细胞中的丛枝3 i f i gi 一2 a r b u s e u l eo f a a m f u n g u s i n ar o o tc e l l ，4 - 。k 瓣 。曩：溪霉絮l 黑龙江大学硕士学位论文 最后完成菌根的整个发育周期 4 4 1 。菌丝呈扇形向根表面生长，最后与根系完全接 触。当萌发的菌丝与适宜的根系接触识别后，才能形成侵染结构。 丛枝菌根真菌菌丝一般为比较粗大的厚壁菌丝，直径可达2 0 3 0 1 a m ，与尚未 木质化的植物根系接触后，能迅速分枝成直径仅2 7 9 m 的薄壁菌丝，加紧与植物 根系充分接触。厚壁菌丝与薄壁菌丝都具有侵入植物的能力，当它们与寄主植物 充分接触并相互作用后4 2 - - 4 8 h ，可形成附着泡。从附着泡产生可侵入根系的菌丝， 称为菌丝锥，进入根内形成侵入点；有的不形成附着泡则直接通过根系表皮或通 过根毛侵入，尤其是当根内菌丝长出根外沿着根表面生长时，真菌与寄主植物之 间不需再次识别过程即可直接进入根内。根外菌丝沿着根表面匍匐生长，多处发 生分支，形成多个侵入点。 侵入根系皮层的菌丝可同时向两个方向生长扩展：一是从根系外皮层细胞向 内皮层细胞以胞间菌丝和胞内菌丝的分枝生长方式进行横向生长发育，但不侵染 中柱组织；二是沿根系生长的方向以胞间菌丝、胞内菌丝或( 和) 根表菌丝形式 进行纵向快速生长扩展，有时可一直侵染扩展到根冠细胞。根上菌丝可生长到距 根1 0 c m 远的土壤中。丛枝菌根真菌的菌丝在根内双向扩展的同时，真菌组织不断 分化和发育，形成丛枝、泡囊等器官。 胞间茵丝通过拉开植物细胞壁并使其质膜缩陷而进入植物细胞，丛枝的扩展 便从植物细胞的胞间菌丝分出的侧枝开始生长发育。最初的胞间菌丝称为丛枝的 主干，丛枝主干侵入的先端被植物的细胞壁物质并列地连续包围成一个厚层。菌 丝穿过细胞壁后，细胞的原生质膜立即将进入的菌丝包围起来。这时进入细胞的 先端菌丝开始二分叉式生长。在侵入的根系皮层细胞内菌丝连续二分叉形成树枝 状或花椰菜状结构，即所谓的丛枝结构，它负责进行菌根真菌和宿主植物之间的 物质交换，由植物向真菌转运碳水化合物，并将矿质营养尤其是磷素和水分提供 给植物【4 5 1 。 1 2 4 菌根真菌对宿主植物营养吸收的促进作用 菌根关系的重要作用是菌丝延伸到远离根围的土壤中将营养直接运输给植 第1 章绪论 i i i i i i i i i i i 宣i m mmi mmm-mmmi i i i i i i i i i 物。丛枝菌根真菌形成大量根外菌丝，从土壤中吸收营养和水分并通过根内菌丝 运达宿主。吸收菌丝的直径一般较草本植物根毛小得多，直径分别为2 5 1 t m 和 1 0 2 0 “m ，这种大小允许真菌共生体伸达除最细小的土壤孔隙外的所有土壤，尤其 是高粘性或有机土壤。丛枝菌根真菌趋向于形成一个扇形菌丝体，由菌丝干( t r u n k ) 或匍匐菌丝辐射发出的二叉状分支菌丝组成。高度分支的细小菌丝进入土壤，吸 收从邻近土壤或有机基质中释放出的营养。有些情况下，菌丝也分泌一些酶，能 够分解复杂的有机物质。每条根约有1 0 0 c m 长的吸收菌丝。由于真菌的表面积与 体积的比值很大，能高度与土壤接触，较无菌根植物能吸收到更多的营养和水分 【1 3 】。菌丝索能伸入土壤中达数米之远，甚至同种真菌将同种或不同种的植物联系 起来【4 6 1 。菌丝桥( h y p h a l l i n k ) 能将植物群落内相同或不相同种植物的根系联系起来 进行物质和能量的交流，也可将不协调环境中植物群落或群丛间的根系联系起来 进行资源的再分配，高营养地块中植物被菌根菌丝与低营养地块中的植物相互联 系起来，以减轻物种间竞争而共同存在。 丛枝菌根真菌能促进植物根系对磷、铜、锌、镉等矿质元素及养分吸收【4 7 4 扪。 植物接种丛枝菌根真菌可以增加植物根际土壤中的磷酸酶活性【4 9 】，从而增加植物 对土壤中磷元素的吸收，同时还能显著增加植物对土壤中水分和其它矿质元素的 吸收【5 0 】。 丛枝菌根真菌可以调节植物激素的合成和分配【5 。丛枝菌根真菌在正常供水 和干旱条件下均能显著提高玉米和棉花植株叶片和根内玉米素、生长素和赤霉素 的含量，并降低脱落酸的含量【1 1 】。 丛枝菌根真菌能改善植物的根际微生物环境并增强植物的抗病性5 2 1 。丛枝菌 根真菌对青枯菌有抑制效应【5 3 1 ，接种摩西球囊霉( g 1 m o s s e a e ) 能明显减轻玉米 纹枯病的发病率和病情指数，减轻病害【5 4 1 。 丛枝菌根真菌能够提高植株对环境胁迫的耐受力【5 0 l 。在干旱胁迫条件下，随 着菌根侵染率的提高，连翘幼苗叶绿素和脯氨酸含量增加，s o d 活性增强，丙二 醛含量和膜透性降低，苗木枯死率下降。菌根真菌通过促进苗木快速累积游离脯 氨酸。提高s o d 酶活性，减缓干旱对细胞膜的破坏，延缓了植物受伤害的速度， 黑龙江大学硕士学位论文 提高连翘幼苗的抗旱性【5 引。 丛枝菌根真菌能够全面改善宿主植物的生长状况【5 6 】。姚青等( 2 0 0 0 ) 接种菌 根真菌显著地促进了玉米、大豆、三叶草的生长，菌根真菌提高作物的叶绿素含 量，进而增加叶片光合速率。菌根真菌不同程度地促进作物根系对磷的吸收效率， 导致含磷量和吸磷量显著地高于不接种对刚5 7 j 。 丛枝菌根真菌能够改善生态环境。t i a n 等通过研究证明丛枝菌根真菌能够通 过改善植物生长和土壤质量来修复退化的草原【5 8 1 。丛枝菌根真菌在生态系统中的 作用表现在以下几方面：( 1 ) 植被恢复 5 9 1 ，促进水土保持，预防地质灾害【6 0 】；( 2 ) 增 强和维持生态系统的多样性和稳定性；( 3 ) 影响植物群落的发生、种类组成和演替； ( 4 ) 土壤改良；( 5 ) 促进根际微生态系统养分的循环【1 1 】。 1 2 5 菌根与氮循环 氮是一切生命的要素，是蛋白质、核酸、核蛋白质、叶绿素、维生素、生物 碱和植物激素的重要组分。植物含氮量约占植物体干物质重的o 3 5 ，含量的 多少与植物种类、器官、发育阶段有关。氮素的最大贮库是大气圈。氮素在大气 圈、生物圈、水圈和土壤圈之间的输入和输出组成氮素的生物地球化学循环【6 1 1 。 土壤中的氮素来源主要包括四个方面：施入土壤中的化学氮肥和有机肥料， 动植物残体的归还，生物固氮，雷电降雨带来的n h 4 + 一n 和n o r n 。生物固氮 是生命科学中的重大基础研究课题之一，它在生产实际中发挥着重要作用：为植 物特别是粮食作物提供氮素、提高产量、降低化肥用量和生产成本、减少水土污 染和疾病、防治土地荒漠化、建立生态平衡和促进农业可持续发展1 6 2 】。 菌根在氮循环中的作用已经成为生物固氮研究的一个新着眼点。 m i i l b a n k ( 1 9 7 2 ) 较早提出某些裸子植物根系中的丛枝菌根是少有的真核生物固氮系 统【6 3 1 。茵根通过几种方式影响氮循环。当它们生物量很大时，真菌和细根( f i n e r o o t ) 将固定大量的氮以促进自身的生长。丛枝菌根真菌菌丝由于扩大了吸收表面积能 吸收较多的土壤氮并转运给植物。另外，菌根真菌含有分解有机氮的酶，从而改 变土壤中的氮形式。自然生态系统中，土壤中大部分的可利用氮是氨基酸，不是 第1 章绪论 硝酸盐。菌根真菌很容易从土壤中将n h 4 + 运输给植物删。这在氮素离散分布的地 方很重要。 丛枝茵根促进宿主植物对氮素吸收的主要机制有：舢胛菌丝能够促进氮的 运输，也可以直接吸收铵，并同化成氨基酸：a m f 的侵染可改变植物根系分泌 物组成，提高某些固氮微生物的活性：a m f 菌丝能够产生某些水解酶，如磷酸 酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和几丁质酶等，也可提高植物体内硝酸还原酶 的活性；黼可促进豆科植物根瘤菌的生长发育，增加根瘤数，提高固氮能力 6 5 】。菌根提高结瘤和固氮速率在豆科已有报道，认为菌根促进的固氮作用可以通 过植物间的菌丝桥来实现。此外，丛枝菌根真菌促进根瘤固氮，可以促进植物对 氮素的吸收。这是由于菌根增强作物吸收磷等营养元素，根瘤因与丛枝菌根共生 后生长受促进、光合产物积累增多以及植物微量元素和激素的供应状况改善。 1 3 根瘤菌概述及固氮机理 根瘤菌是一类能与豆科植物共生结瘤固氮的土壤微生物。人类经过1 0 0 多年的 不断研究，已发现了能与根瘤菌共生结瘤固氮的豆科植物达28 3 9 种 6 6 1 。根瘤菌是 一类广泛分布于土壤中的革兰氏阴性细菌，与相应的豆科植物及少数非豆科植物 根系共生，能将空气中的分子态氮还原为植物可利用的氨，同时根瘤菌从豆科植 物获得其生长繁殖所需的能量和营养物质【6 7 , 6 s 】。1 8 8 8 年，德国人黑里格尔和维尔 法特证实了只有结瘤的豆类才能利用空气中的分子态氮。同年，荷兰人拜耶林克 将从根瘤中分离出的根瘤菌进行了纯培养 6 9 1 。在人工培养基上，最适合根瘤茵的 氮素营养是可溶性有机氮化物，根瘤菌虽然可以吸收无机氮化物( 如硝态氮和铵 态氮) ，但如果培养基中只有无机氮化物时，一般生长不好。在一定条件下，根瘤 菌也可用分子态氮作氮素营养【7 0 1 。 根瘤菌与豆科植物的共生结瘤固氮对自然界的氮素循环和生态平衡起着十分 重要的作用。在大气中氮气的含量约为7 9 ，现在研究表明没有植物能够自己固氮， 一些植物通过与微生物共生，尤其是与根瘤菌共生来达到固氮的目的【7 ，将大气 中的分子态氮转变为氨态氮。这些氨除满足根瘤菌本身的需要外，还可为宿主提 黑龙江大学硕士学位论文 i i 供生长发育可以利用的含氮化合物。同时，根瘤茵及其所固定的氮化合物，可以 提高土壤的含氮量，在间作和轮作上具有重要的意义。豆科植物根瘤菌共生固氮， 作为自然界最为重要的生物固氮途径之一，在提高农作物产量、降低化肥用量和 生产成本、减少水土污染和土传病害、建立生态平衡等方面发挥着重要的作用【7 2 l 。 根瘤的形成一般分为3 个步骤：根瘤菌识别、附着、侵入。豆科植物的根 系在土壤中生长发育，刺激相应的根瘤茵在根际中大量增殖。甚至可以使2 - 3 c m 远的根瘤茵吸附在根毛的表面。特定的豆科植物和相应的根瘤菌可以相互识别。 这种识别与根瘤菌细胞表面多糖类物质与豆科植物分泌的植物凝集素的识别有关 1 7 0 1 。侵染的最初反应之后根毛卷曲，根瘤菌进入根毛，并形成侵染线；原始根 瘤的形成。根瘤菌与根毛相互作用形成侵染中心，进而发育为根瘤。形态上变成 粗杆状或球状，甚至为“t ”、“y 形一这种变大的形态称为类菌体，类菌体 形成固氮能力，根瘤形态建成。上述特征对快生根瘤菌表现特别突出【7 3 1 。 人们对根瘤菌固氮的作用机制进行了探索。1 9 6 6 年，m o r t e n s o n 等从巴氏梭菌 和维涅兰德固氮菌的细胞抽提液中，分离出两种固氮蛋白钼铁蛋白和铁蛋白； b u m s 等( 1 9 7 0 ) 获得固氮钼铁蛋白的白色针状结晶。根瘤的固氮功能主要是固氮 酶起作用，探索和揭示固氮酶的固氮机理具有重要的意义。 7 0 年代后，科学家陆续从固氮酶的萃取液中分离并提纯了固氮酶的两个组分， 即钼铁蛋白和铁蛋白。这两种蛋白质单独存在时都不具备固氮作用，只有两者形 成复合体后，才具备催化氮还原成氨的能力【1 7 4 1 。钼铁蛋白又称为钼铁氧还蛋白或 固分子氮酶，是真正意义上的“固氮酶”；铁蛋白又称固氮铁氧蛋白或固分子氮还 原酶，其实质是一种“固氮酶的还原酶”。 由于氮分子具有键能很高的三键( n - - - n ) ，要打开它需要很大的能量，故只有在 固氮酶催化下，n 2 才能还原为n i - 1 3 。每还原1 分子n 需要6 个电子和6 个氢离子。 固氮酶钼铁蛋白有三种状态，即氧化态、半还原态和完全还原态；铁蛋白有两 种状态，即氧化态和还原态。当半还原态的钼铁蛋白和还原态的铁蛋白组合在一 起时，成为稳定固氮的复合体系。这时还原态铁蛋白的电子传递到半还原态钼铁 蛋白上，使它成为完全还原态；铁蛋白本身被氧化，随后再由细胞中电子传递链 第1 章绪论 所提供的电子还原a 氮的还原发生在钼铁蛋白，与铁蛋白发生复杂的反应【7 1 1 。完 全还原态的钼铁蛋白络合分子氮，同时a t p 水解成a d p 十p i ，释放出大量能量， 使电子和氢离子同氮结合，生成两分子氨。过程如图1 5 所示，图中a 蛋白为铁 蛋白，b 蛋白为钼铁蛋白。在这个反应过程中固氮酶钼铁辅因子( f e m o c o ) 起关键 作用，它是固氮酶的活性中心。 e + h ，一、 ，、 ， 广一1 ， 、 ， 、，一， 蛋白 乙炔 z 烯 图l - 5 崮氮酶崮氮原理 f i g 1 5p r i n c i p l eo fn i t r o g e nf i x a t i o nb yn i t r o g e n a s e 不同种类的固氮微生物都有共同的固氮基因( i l i f ) 控制着固氦特性遗传，m f 基 因和固氮酶只存在于固氮菌中。在根瘤茵中除了固氮基因外，还存在结瘤基因 ( n o d ) 、使宿主的根毛变形弯曲的基因( h a e ) 、根瘤起始基因( n o i ) 和产生色素的基因 0 i 曲等。根瘤菌中的i l i f 基因和结瘤基因等都定位在质粒上【7 5 1 。 1 4 紫穗槐概述 紫穗槐( a m o r p h a f r u t i c o s al ) 又名绵槐、鼬荻、紫翠槐，是多年生豆科丛生落 叶小灌木。原产北美，2 0 世纪2 0 年代末作为观赏绿化树种引入我国上海，现已在 东北、华北、西北进行推广。在海拔10 0 0m 以上的平原、丘陵、山区多有栽植。 它适宜生长在温度为1 0 1 6 ，年降水量5 0 0 - - - 7 0 0m m 的地方，在华北平原，长 势较好；在黑龙江省密山2 5 的地方，在宁夏中卫年降水2 1 3 咖的干旱地区也 能生长【7 6 1 。 因为紫穗槐有发达的根系，稠密的须根和密生的根瘤，所以有很强的扩张力。 生长快，萌芽力强，枝叶茂盛也是它的另一优点。在一般情况下，当年生高可达1 米以上，次年就可开花结实，平茬之后当年高达1 5 2 米7 7 l 。 黑龙江大学硕士学位论文 i 紫穗槐具有耐盐碱、耐旱涝、适应性强、生长迅速等生物学特性。经济价值 方面，紫穗槐是良好的蜜源植物和庭院观赏绿化树种；能够防风固沙，保持水土， 改良土壤：作为大型家畜的饲料和高效优质的绿肥；其根茎叶中可提取作为驱虫 剂的甙( c 1 2 h 2 0 0 i o ) ：枝条柔软通直，可用于编制艺术篓、篮，并可作为纺织材料和 造纸、人造棉的原料；荚果和叶可提取甘油、润滑油、芳香油；种子可入药，治 疗习惯性流产【7 3 】。 紫穗槐作为豆科植物具有适应性强、生长迅速、固氮能力好等特剧7 9 1 。它的 这种固氮能力与根瘤菌的存在有关。接种根瘤菌的紫穗槐的株高、干、鲜重比不 接种的对照组和加氮对照组均有增加【8 0 1 。老参地轮作紫穗槐能够促进土壤中氮化 细菌和硝化细菌的存在与活动，使土壤肥力增加，给人参提供可给态的有机或无 机氮素营养【8 l 】。 紫穗槐的须根茂密且质地柔软，木质化程度低，根部易于染色和压片，显微 镜下观察效果好，加之上述各种生理优点，因此选作本试验的植物材料。 1 5 丛枝菌根真菌一豆科植物一根瘤菌三重共生关系 豆科植物根际微生态系统中共同繁衍着大量的丛枝菌根真菌和根瘤菌，它们 在长期进化过程中与豆科植物形成了丛枝菌根真菌豆科植物根瘤菌三重共生的 关系。这种现象的发现最早可以追溯到1 0 0 年前，人们在金龟树( p i t h e c o l o b i u m m o n t a n u m ) 的根际发现菌根真菌与固氮细菌的共存。由于丛枝菌根真菌、根瘤菌、 豆科植物之间不存在严格的专一性，使这种共生体系成为自然界中一种普遍的生 物学现象，在自然生态系统和实践应用中发挥着重要的作用7 2 1 。 豆科植物能同时被丛枝菌根真菌和固氮细菌侵染，但是由于丛枝菌根真菌具 有的专性共生特性，这两个共生体系最初极少同时研究【8 2 1 。c r u s h ( 1 9 7 4 ) 发现并 证实了丛枝菌根真菌可以促进豆科植物的生长、根瘤的形成和固氮，开始了它们 之间相互作用的研究。近年来大量研究证实，双接种丛枝菌根真菌与根瘤菌的效 果优于单接种，双接种能明显提高宿主植物生长和营养的综合指标：改善宿主植 物的磷素营养状况，提高土壤有机磷的利用率和根瘤菌的结瘤固氮能力，并最终 第1 章绪论 _ i i 促进宿主植物的生长发育【8 3 1 ，双接种还能增加植物的抗逆性和抗病性堋。在三重 共生关系的信号方面，也就是分子水平研究上也出现很多成果。在大豆和扁豆根 上添加结瘤因子后发现能够促进a m 真菌的定殖。在截形苜蓿眦t r u n c a t u l a ) 上接种 结瘤因子既能促进侧根的形成，又能促进丛枝菌根的形成；在截形苜蓿上添加a m 真菌的一种扩散性物质后也能促进侧根的生长，同时也有利于根瘤的形成【8 5 1 。 我国许多研究者对各种豆科作物进行丛枝菌根真菌和固氮菌双接种试验，李晓 鸣( 1 9 9 4 ) 试验证明丛枝菌根真菌和根瘤菌双接种处理根瘤数比对照增加5 6 ， 比单一接种根瘤菌增加2 2 ，双接种固氮酶活性比对照增加6 4 ，比接种根瘤菌 增加1 8 嗣。在人工纯培养的条件下对刺槐同时接种丛枝菌根真菌苏格兰球囊酶 ( g c a l e d o n i u m ) 矛d 刺槐根瘤菌，结果发现刺槐株高、地径、生物量、侧根数分别比 对照增加4 6 、1 0 2 、2 1 3 、8 2 ，结瘤量、固氮酶活性分别比单接种固氮菌增 加5 0 0 、4 5 1 ，菌根侵染率高达1 0 0 。可见同时接种丛枝茵根真菌和固氮菌无 论是对刺槐生长、结瘤固氮还是菌根真菌侵染的促进作用都是显著的【明。在丛枝 茵根真菌和根瘤菌对蚕豆吸收氮的作用研究中，双接种处理蚕豆株高、叶绿素含 量、根瘤数和根瘤质量显著增加，生物量比对照增加2 1 5 1 双接种比单接丛枝茵 根真菌蚕豆菌根侵染率提高1 2 0 ；相对于对照，双接种使氮吸收速率提高2 2 o ， 吸收有机氮增加4 4 8 ，高于单接种丛枝菌根真菌。丛枝菌根真菌和固氮微生物双 接种对改善作物生长有重要意义【踮】。在根瘤菌与丛枝菌根真菌双接种对大豆植株 生长作用的研究中，双接种与不接菌对照、单接根瘤菌对照、单接丛枝菌根真菌 对照相比，双接种显著促进大豆植株的生长和生物量的提高；接种丛枝菌根真菌 可增加根瘤菌的结瘤数；接种根瘤菌也可提高丛枝菌根真菌的根段侵染率【8 9 1 。宋 福强等( 2 0 0 7 ) 采用分室隔网人工纯培养手段，用g 1 m o s s e a e 、g i i n t r a r a d i 卯s 两种丛枝菌根真菌以及根瘤菌接种紫穗槐，结果表明这两种丛枝菌根真菌不但可 以与紫穗槐形成菌根，同时还诱导紫穗槐产生大量的根瘤，增强紫穗槐的固氮能 力嗍。 以上研究说明，丛枝菌根真菌、根瘤茵和豆科植物之间具有互利互惠的协同 增效作用：对豆科植物双接种，其含氮量均高出单接种，a m 真菌对豆科植物固氮 黑龙江大学硕士学位论文 i 的作用是可以肯定的，其机理是改善了磷营养【9 1 1 ，即丛枝菌根真菌提供给根瘤固 氮作用所需的磷素，提高植株的固氮能力，同时植株固氮为丛枝菌根真菌提供良 好的氮素营养，提高植株中丛枝菌根真菌的侵染率。但是当土壤高磷含量时，三 重共生体系不能够促进固氮瞰】。 1 6 本研究的目的及意义 目的：本试验是在丛枝菌根真菌侵染紫穗槐后，通过测定植物根际土壤中固 氮酶活性，研究紫穗槐将空气中氮气转化为可利用氮素的能力；再通过测定紫穗 槐根际土壤中脲酶活性，研究紫穗槐根系负责氮素吸收的酶活性；通过测定叶片 硝酸还原酶活性，研究植物体内硝态氮转化能力；通过土壤和植株氮素含量测定， 研究生物固氮的最终效果。通过每一时期测定的各处理之间的各种酶活性横向比 较，每个处理各种酶活性测定结果在不同时间的变化情况以及各处理植株最终固 氮量，确定丛枝菌根真菌是否能够提高紫穗槐固氮能力。通过对紫穗槐生物量的 测定，研究丛枝菌根真菌对紫穗槐的促生作用。通过对丛枝菌根真菌对紫穗槐根 系侵染率的测定，紫穗槐根部根瘤形成情况的观察以及对紫穗槐根系和根瘤进行 透射电镜照相分析，研究丛枝菌根真菌和根瘤菌侵染紫穗槐根系的时空变化。 意义：丛枝菌根真菌对紫穗槐的固氮酶活性影响未见报道，本试验可以填补 此项空白。丛枝菌根真菌紫穗