生物素亲和素反应的放大技术ppt课件.pptx

生物素 亲合素放大技术 1 第二节亲合素 链霉亲合素的理化性质与标记一 理化特性二 亲合素 或链酶亲合素 的标记 第一节生物素的理化性质与标记一 活化生物素二 活化生物素标记蛋白质 2 第三节生物素 亲合素系统的特点一 灵敏度二 特异性三 稳定性四 适用性五 其他 思考题小结 第四节生物素 亲合素系统的应用一 生物素 亲合素系统基本类型及原理二 生物素 亲合素系统在酶免疫测定中的应用三 生物素 亲合素系统在荧光免疫技术中的应用四 生物素 亲合素系统在放射免疫测定中的应用五 生物素 亲合素系统在分子生物学中的应用 3 生物素 biotin 亲和素 avidin 是一对具有高度亲和力的物质 结合迅速 专一 稳定并具有多级放大效应 4 生物素 维生素H 动 植物组织中广泛分布 卵黄和肝含量高分子量小 244 31D I环为咪唑酮环 可与亲合素结合 环为噻吩环 C2上戊酸侧链的未端羧基是结合生物大分子的唯一结构 I咪唑酮环 噻吩环 羧基 可用于活化为其他衍生物 第一节生物素理化性质与标记 5 一 活化生物素 生物素侧链的末端羧基经化学修饰后制成带各种活性基团的衍生物 活化生物素 生物素化衍生物 为何要活化 6 活化生物素 活化生物素易与抗原 抗体 酶及核酸分子中相应基团偶联形成生物素化标记物 标记蛋白质氨基的活化生物素 标记蛋白质醛基的活化生物素 标记蛋白质巯基的活化生物素 标记核酸的活化生物素 7 活化生物素 标记蛋白质氨基的活化生物素 BNHS分子可与蛋白质赖氨酸 碱性AA 的氨基形成肽键BNHS适用标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质 生物素 N 羟基丁二酰胺 碳二亚胺 生物素羟基琥珀酰亚胺酯 BNHS 8 如何减小空间位阻 长臂活化生物素 BCNHS 生物素和N 羟基丁二酰亚胺之间添加了两个6 氨基已糖分子基团 形成连结臂 生物素与大分子基团的距离增加 更易发挥生物素的活性作用 生物素分子量小 当与抗体或酶形成生物素标记结合物后 由于大分子蛋白的空间位阻效应 可对生物素与亲和素的结合以及BAS的应用效果造成干扰 9 标记蛋白质醛基的活化生物素 生物素酰肼 BHZ 水合肼与生物素的合成物主要用于标记偏酸性糖蛋白肼化生物胞素 BCHZ 生物素与赖氨酸连接后 再与无水肼反应而成 除醛基外 BCHZ还可标记氨基 10 标记蛋白质巯基的活化生物素 马来酰亚胺 丙酰 生物胞素 MPB 能特异地与蛋白质巯基结合的活化生物素 11 标记核酸的活化生物素 光生物素 photobiotin 光敏物质侧链上连接的芳香基叠氮物基团 经光照后 变为芳香基硝基苯 可直接与腺嘌呤氨基结合 形成B 核酸探针 用于DNA或RNA的标记 生物素脱氧核苷三磷酸 如Bio dUTP 作为TTP的结构类似物 可采用缺口移位法 DNaseI和DNA聚合酶I 掺入到双链DNA中 BNHS和BHZ可直接标记核酸 但对碱基配对有影响 目前常用光生物素和生物素化dUTP作为标记核酸的活化生物素 12 特性 活化生物素通过侧链与蛋白分子连接 一个蛋白分子可被多个生物素标记 多价性 是BAS多级放大作用的物质基础 BNHS多标记抗体和中性或偏碱性的蛋白质 BHZ则多标记微酸性抗原 抗原 抗体标记后活性不变 可对标记材料 如酶 标记 碱性磷酸酶标记后 活性降低 二 活化生物素标记蛋白质 13 注意事项 选择活化生物素 依抗原或抗体分子所带可标记基团的种类 氨基 醛基或巯基 以及分子的酸碱性 控制生物素 蛋白质比例生物素 IgG用量比 mg mg 宜为2 1 IgG应用浓度0 5 5 g ml 生物素1 3个 Ag 3 5个 Ab 使用交联臂减少空间阻力 14 第二节亲合素 链霉亲合素的理化性质与标记 亲合素 avidin AV 和链霉亲合素 streptavidin SA 是生物素的天然特异性结合物 而且 二者均为大分子蛋白 因此几乎所有用于标记的物质均可以同亲合素 AV 或链酶亲合素 SA 结合 15 结构四亚基糖蛋白四肽链蛋白无糖基PI10 56结合位色氨酸色氨酸生物素44Ka10151015活性13 15U15 18U 亲合素 AV 链霉亲合素 SA 一 理化特性 SA表面所带正电荷少 且不含糖基 非特异性结合远低于AV 因此目前以SA标记的酶结合物更为常用 16 二 亲合素 链霉亲合素的标记 可标记AV SA的物质 酶 抗原或抗体 铁蛋白 胶体金 125I 异硫氰酸荧光素 FITC 等 HRP AV SA 酶标记蛋白的直接标记法 过碘酸钠法 戊二醛法 ABC SABC 通过与生物素化酶复合物中的生物素结合 间接地与酶形成结合物 AV SA B HRP ALPABC avidin biotin peroxidasecomlplex ABAP 17 第三节生物素 亲合素系统 BAS 的特点 灵敏度高 生物素标记蛋白具有多价性 且标记后的抗原 抗体生物活性不变 每个亲合素有四个生物素结合部位 可同时以多价形式结合到生物素化大分子衍生物和标志物上 因此 BAS具有多级放大作用 反应的灵敏度高 稳定性高和特异性强 AV SA与生物素结合的亲和常数比抗原 抗体反应至少高1万倍 二者的结合呈高度专一性和不可逆性 且酸 碱 变性剂 蛋白溶解酶 有机溶剂以及反应试剂的高度稀释均不影响其结合 因此 BAS稳定性高 特异性强 18 第三节生物素 亲合素系统 BAS 的特点 适用性广泛 BAS的多级放大作用 以及既可偶联生物大分子 又可连接标记材料 使BAS不仅用于微量抗原 抗体及受体的定量 定性检测及定位观察研究 亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离 纯化 其他 可制成通用试剂 如生物素化二抗等 反应试剂可高度稀释 特别是与一抗偶联使用可大幅减少一抗用量 降低实验成本 实验所需时间不长 19 第四节生物素 亲合素系统的应用 生物素与亲合素之间结合的亲合力高 特异性强 各自均可以与各型大小分子结合 以及二者在结合反应时具有的多级放大作用等优越性 使BAS及其相关技术被广泛应用在各种标记免疫分析技术领域中 尤其为标记免疫检测自动化分析做出了极大的贡献 20 一 生物素 亲合素系统基本类型及原理 BAB法 Ag B AbAg Ab BA SAAg Ab B A SAB EAg Ab B A SA B E特点 以游离A SA分别连接B Ab和B E 21 BA法 也称标记亲合素 生物素法 labeledavidin biotin LAB Ag B AbAg Ab BA E SA EAg Ab B A SA E特点 以A E SA E代替BAB法中的A SA 省却了加B E的步骤 22 3 ABC法 A B EA B E ABC Ag B AbAg Ab BABCAg Ab B ABC特点 将BAB法中的A先与B E结合 制备成复合物ABC 网络了大量酶分子 使该法的检测灵敏度显著提高 23 BAB与ABC成员相同 反应顺序不同 24 此外 按待检反应体系中所用的是生物素化第一抗体或生物素化第二抗体 BAS分为直接法和间接法 BAS实验方法及反应层次 25 二 生物素 亲合素系统在酶免疫测定中的应用 BAS在ELISA中的应用 BAS用于固相化抗原 抗体的制备AV SA先包被固相载体 抗原 抗体先与生物素结合AV SA B反应而使抗原 抗体固相化 BAS用于ELISA的终反应放大BA ELISA BAB ELISA ABC ELISABAS在均相酶免疫测定中的应用 B E AA B E 酶因活性中心受空间位阻作用而失活 反应系统 B E Ag A Ab 限量 标准Ag 待检AgAg A和待检Ag竞争结合限量Ab 若AgAg AbAg AAg A B E酶活性变化与待测标本中抗原浓度呈负剂量相关 酶活性降低 26 三 生物素 亲合素系统在荧光免疫技术中的应用 BAS用于荧光抗体技术可明显提高方法的灵敏度和特异性 通常采用BA法 即用荧光素直接标记亲合素 或链酶亲合素 也可采用游离亲合素 或链酶亲合素 搭桥 两端分别连接生物素化抗体和荧光素标记的生物素 BAB法 或荧光标记的抗亲合素 或链酶亲合素 抗体的夹心法 BAS用于时间分辨荧光免疫分析也可以将反应信号放大 27 四 生物素 亲合素系统在放射免疫测定中的应用 BAS主要与免疫放射分析 IRMA 检测体系偶联 用于对终反应的放大 BA法 BAS也可用于IRMA反应后B F成分的分离 28 五 生物素 亲合素系统在分子生物学中的应用 以生物素标记核酸探针进行的定位检测用BAS制备的亲和吸附剂进行基因的分离纯化将免疫测定技术与PCR结合建立免疫 PCR immuno PCR 用于抗原的检测如DNA B SA ProA IgG Ag Ag和DNA间建立对应关系 从而将对蛋白质的检测转化为对核酸的检测 抗原抗体反应的特异性与PCR技术的高度敏感性相结合 其检测灵敏度可达10 21mol水平 是迄今最敏感的分析方法 29 思考题 生物素的分子结构特点是什么 生物素通过什么结构 形式与生物大分子相连结 亲合素或链霉亲合素的分子结构 理化性质有何特点 为什么亲合素 链霉亲合素具有 桥联 作用 亲合素 链霉亲合素可以被哪些示踪剂标记 为什么生物素 亲合素系统具有放大作用 生物素与亲合素或链霉亲合素的结合是否与抗原抗体结合相同 生物素 亲合素系统放大的是反应过程还是单一检测信号 生物素 亲合素或链霉亲合素如何与标记免疫技术联接 如何将生物素 链霉亲合素放大系统用于所有双位点ELISA 30 小结 生物素 亲合素 链霉亲合素 系统具有的多级放大独特效应 可极大地提高分析测定的灵敏度 二者之间的高亲和 高特异结合以及既可偶联生物大分子 又可连接标记材料的特性 使该系统在标记免疫分析技术领域中的应用具有很强的稳定性和适用性 该系统有二种基本类型 以游离亲合素为中间物 分别连接包含生物素化大分子的待检反应体系和标记生物素的BAB法或ABC技术 另一类是直接用标记亲合素连接生物素化大分子反应体系进行检测的BA法或LAB 此外 按生物素化第一抗体或生物素化第二抗体 又分为直接法或间接