（微生物学专业论文）精氨酸高产菌株钝齿棒杆菌中argj基因的功能研究.pdf

摘要 摘要 l 一精氨酸( l a r g i n i n e ，l a r g ) 是一种半必需氨基酸，是生物体尿素循环的重要中间 代谢产物，对机体维持正常的生理功能有重要作用，因此l 精氨酸在医药、食品及化妆 品等领域有极为广泛的应用。 论文以钝齿棒杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ) j n p h 5 8 为研究对象，通过对其l 精氨酸合成途径中鸟氨酸乙酰转移酶编码基因a r g j 的功能分析，考察增强a r g j 基因的 表达量对重组钝齿棒杆菌产物l 精氨酸积累的影响。 cc r e n a t u mj n p h 5 8 是本实验室保藏的一株高产l 精氨酸突变株，本论文对其鸟 氨酸乙酰转移酶( o m i t h i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s ，o a t a s e ) 的催化功能类型进行了分析鉴定， 检测结果表明，cc r e n a t u mj n p h 5 8 的o a t a s e 是一个双功能酶，兼具线性途径中乙酰 谷氨酸合成酶和乙酰鸟氨酸酶的功能。 以不产l 精氨酸的cg l u t a m i c u ma t c c l 3 0 3 2 为对照，发现cc r e n a t u mj n p h 5 8 的o a t a s e 粗酶比活力高6 7 4 。为探讨其酶活力高的原因，将来源于两株菌的a r g j 基 因分别进行了克隆分析，并在大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) b l 2 1 ( d e 3 ) 中诱导表达，结果表 明，两株菌中o a t a s e 编码基因存在1 3 个碱基的差异，引起了3 个氨基酸残基的突变， 但纯酶活力分析发现，其粗酶比活力的差异与编码基因本身的差异无关，而与两株菌中 o a t a s e 的酶量差异有关。 o a t a s e 是由a 、d 两个亚基组成的异二聚体，在诱导温度低于1 6 时，o a t a s e 以 可溶性的亚基状态存在。对0 【、d 亚基进行分别表达的实验结果表明，单独的0 【、p 亚基 不存在o a t a s e 的催化活性，亚基分开表达再混合后也不再显示o a t a s e 的活力，说明 保守区的自动裂解对于o a t a s e 活性中心的形成是必须的。此外，对0 【、1 3 亚基的分别敲 除发现o a t a s e 也不再具备催化活性，基因缺失菌株不能合成l 精氨酸，g t 、d 亚基的缺 失阻断了l 精氨酸的合成通路。 基于以上研究，本论文将口叫基因在cc r e n a t u mj n p h 5 8 中进行了增强表达，构 建了重组穿梭表达质粒p j c l t a c a r g j 。与出发菌株相比，重组菌cc r e n a t u m ( p j c l t a c a r g j ) 的o a t a s e 粗酶比活力提高9 0 9 ，l 精氨酸积累量提高1 6 8 ，单位菌 体产酸量提高2 4 6 ，这表明，提高菌体中o a t a s e 的表达量可以增强l 精氨酸合成途 径的代谢通量。 关键词：l 精氨酸，钝齿棒杆菌，a r g j ，鸟氨酸乙酰转移酶，0 【、p 亚基 a b s t r a c t a b s t r a c t l a r g i n i n e ，as u b s t a i n t i a li n t e r m e d i a t em e t a b o l i t ei no m i t h i n ec y c l e ，i sak i n do f s e m i d i s p e n s a b l ea m i n oa c i d ，a n dh a ss i g n i f i c a n ta f f e c ti nm a i n t a i n i n gn o r m a lp h y s i o l o g i c f u n c t i o ni no r g a n i s m t h e r e f o r e ，l a r g i n i n eh a sn u m e r o u sa p p l i c a t i o n si nf o o df l a v o r , p h a r m a c e u t i c a l sa n dc o s m e t i c s l a r g i n i n eh y p e r - p r o d u c i n gm u t a n ts t r a i nc o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m j n p h 5 - - 8s t o r e di n t h i sl a bw a si n v e s t i g a t e di no u rs t u d y w ei d e n t i f i e dt h ef u n c t i o n a lp a t t e r no fcc r e n a t u m j n p h 5 8a r g jg e n ei nl a r g i n i n eb i o s y n t h e s i sa n da n a l y z e dt h ee f f e c to fa r g jo v e re x p r e s s i o n o nt h eg r o w t ha n dl - a r g i n i n eb i o s y n t h e s i s w ea n a l y z e dt h ec a t a l y s a t e so fo m i t h i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s ( o a t a s e ) f r o mcc r e n a t u m j n p h 5 8 i ti n d i c a t e dt h a t ：o a t a s ei ncc r e n a t u mj n p h 5 8w a sa nb i f u n c t i o n a le n z y m e i t w a sr e s p o n s i b l ef o r t h ed e a c e t y l a t i o no fn a c e t y l o m i t h i n ea sa c e t y l o m i t h i n a s e ( a o a s e ) ( a r g e e n c o d e d ) i ne s c h e r i c h i ac o l i ，a n dc o u l da l s os y n t h e s i z ea c e t y l g l u t a m a t ea sa c e t y l g l u t a m a t e s y n t h a s e ( a g s a s e ) ( a r g ae n c o d e d li ne c o l i w ec o m p a r e dt h ec r u d eo a t a s es p e c i f i ca c t i v i t yo fc c r e n a t u mj n p h 5 8w i t hc g l u t a m i c u ma t c c 13 0 3 2 ，w h i c hc o u l dn o tp r o d u c tl a r g i n i n e a c t i v i t yo fc c r e n a t u m j n p h 5 8w a sh i g h e rt h a nt h a to fc g l u t a m i c u ma t c c 13 0 3 2b y6 7 4 t h e na r g jg e n e so f t h e s et w os t r a i n sw e r ec l o n e da n da n a l y z e d w h i l ei nt h es u b s e q u e n t l ye x p r e s s i o no fo a t a s e i nec o l ib l 21 ( d e 3 ) ，w ef o u n dt h a tt h eh i g ha c t i v i t yo fo a t a s ei ncc r e n a t u mj n p h 5 - 8 w a sd u et ot h ed i f f e r e n c eo fe x p r e s s i o no fa r g j ，i n s t e a do ft h ed i f f e r e n c eo ft h r e ea m i n o - a c i d r e s i d u e si np e p t i d ec h a i n w h e ni n d u c e dt e m p e r a t u r el o w e rt h a n16 ，o a t a s ee x i s t sa st w os o l u b l es u b u n i t s t h e s e p a r a t e l yc l o n e da n de x p r e s s e daa n dps u b u n i t s a b o l i s ha c t i v i t i e si no a t a s e ，w h i c h i m p l y i n gt h a ts e l f - c a t a l y z e dp r e c u r s o rc l e a v a g ei san e c e s s a r ys t e pt of o r ma c t i v eo a t a s e a d d i t i o n a l l y ，s e p a r a t e l yk n o c k i n go u to f0 【a n dps u b u n i t ss h i l la b o l i s ha c t i v i t i e si no a t a s e ， w h i c hr e s u l t e di nn ol a r g i n i n ep r o d u c t i o ni nd e l e t e ds t r a i n s a c c o r d i n gt ot h e s er e s u l t s w eo v e r e x p r e s s e da r g ji ncc r e n a t u mj n p h 5 8a n df o u n d t l l a tt h ec o n t e n to fl a r g i n i n ei ncc r e n a t u m ( p j c1 一t a c - a r g j lw a si n c r e a s e db y16 8 t h e o v e r e x p r e s s i o no fa r g ji n d e e de n h a n c e dt h em e t a b o l i cf l u xo fl - a r g i n i n eb i o s y n t h e t i c p a t h w a y k e y w o r d s ：l - a r g i n i n e ，c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ，口叫，o m i t h i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s ，a n dps u b u n i t s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 签 名：葛旁中匆 日 期： 例z ，2 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：薄象辛南导师签名： 日 期： 第一章绪论 第一章绪论 1 1l 精氨酸的性质及应用 1 8 8 6 年，s c h l u s 首次从植物羽扇豆苗中分离出晶体形式的精氨酸并对其进行了命 名，随后，h e d i n 于1 8 9 5 年从哺乳动物的蛋白质中也分离出了精氨酸【l 】。其分子结构 式( 图1 1 ) 于2 0 世纪初( 1 9 1 0 年) 已经清楚并能进行人工合成。作为一种条件性必需氨基 酸，精氨酸在生物体内以具有生理活性的l 型精氨酸形式发挥生物学功能。 l 精氨酸( l a r g i n i n e ，简写l a r g ) ，又名l q 一氨基6 胍基戊酸、胍基戊氨酸、阿及 宁，分子式为c 6 h 1 4 n 4 0 2 ，相对分子量为1 7 4 2 ，是一种含有胍基的碱性氨基酸【2 1 。它易 溶于水，微溶于乙醇，不溶于乙醚，等电点为1 0 9 7 ；从水中析出时为含2 分子结晶水 的白色棱形结晶；从乙醇中析出时为无色单斜片状结晶；具强碱性，水溶液能从空气中 吸收二氧化碳；加热至1 0 5 时脱去2 分子结晶水，2 3 0 时白色晶体变为棕色，2 4 4 时发生分解。 o o h n h 2 图1 - 1 精氨酸分子结构式 f i g 1 1c h e m i c a ls t r u c t u r eo fl - a r g i n i n e 1 1 1l 精氨酸的生物学意义 l 精氨酸是幼龄哺乳动物的必需氨基酸，是机体组织蛋白中最丰富的氮载体，是目 前发现的动物细胞内功能最多的氨基酸，在动物体内具有重要的生理生化功能：它是机 体合成细胞浆蛋白和核蛋白的重要前体，也是合成神经组织中胍基丁酸的前体物质【3 l ； 它是天门冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸、羟脯氨酸和聚胺( 腐胺、精胺及精眯) 等转化为高能 磷酸化合物磷酸肌酸的中间体；它还作为尿素循环的中间体，通过尿素循环解除氨 中毒，避免动物体内由于氨过量而造成的代谢紊乱【l 】。在生理活性方面，l 精氨酸还是 多胺和n o 等多种生物活性物质的合成前体，通过刺激生长激素、胰岛素和胰高血糖素 等激素的诱导分泌，参与机体内分泌调节和特异性免疫调节等生物学过程【4 】。 1 1 2l 精氨酸的应用 ( 1 ) l 精氨酸在医药工业的应用 1 9 9 8 年，诺贝尔医学奖授予了研究一氧化氮( n o ) 在细胞、组织间信使作用的三位 美国科学家，并由此引发了世界性的l 精氨酸研究热潮。研究表明：l 精氨酸是体内一 氧化氮合成的前体物质，通过l 一精氨酸一一氧化氮通路所产生的一氧化氮是许多生理功 能如血管松驰、抗血小板聚集、神经元活动等的重要递质，能够介导一系列免疫过程， 杀灭微生物，杀伤瘤细胞，对机体起着全方位的保护作用，对多种疾病均有较好的疗效 n h h m 人 nh 江南大学硕士学位论文 【5 】。l 精氨酸是临床上复方氨基酸输液的主要组成成分之一，对病毒性肝炎有显著的疗 效，并可作为氨中毒性肝昏迷的解毒剂及肝功能的促进剂。对创伤后机体补充适当的外 源l 精氨酸，可以促进伤口愈合，提高免疫功能。此外，l 精氨酸还有抗动脉粥样硬化、 调节血压的功能，还可以提高人体生长激素( h g h ) 的分泌量，延缓衰老【6 】。 ( 2 ) l 精氨酸在食品工业的应用 近几年，国外开发的旨在提高运动员的耐力、爆发力及高速反应能力的饮料甚多， 它们多以补充能量和滋补强壮为主要目的，在饮料中添加氨基酸已成为一大趋势，其中 添加l 精氨酸的已不在少数，美国和日本在这方面的竞争尤为激烈。例如：可口可乐公 司推出的“阿格里乐”运动员饮料，便是含0 0 2 l 精氨酸的饮品；日本明治乳业生产的 运动饮料也是含0 0 2 l 精氨酸的饮料【7 】。在食品工业中，l 精氨酸是配制营养支持用 和特殊治疗用要素膳的重要原料，l 精氨酸l 谷氨酸盐还可用作忌钠患者的调味品。 ( 3 ) l 精氨酸在其他领域的应用 除了在医药、食品领域的应用，l 精氨酸还可用作化妆品、饲料行业的添加剂。以 l 精氨酸为原料制备的阳离子表面活性剂具有抗菌性强、毒性低的特点，是食品、化妆 品等的优良防腐剂。此外，l 精氨酸与尿囊素做成复合剂，因溶解性增加，已用于化妆 品和药物。还有人合成了以甘氨酸脯氨酸一精氨酸为主要成分的聚合物，用作表面活性 剂和黏合剂。 1 2l 精氨酸的生产现状 1 9 8 6 年，全球l 精氨酸的需求量为1 0 0 0 吨。1 9 9 6 年，全球l 精氨酸的生产量为 1 2 0 0 吨。1 9 9 9 年，日本农林水产省颁布l 。精氨酸作为新的饲料添加剂用氨基酸。统计 表明，当今世界上采用发酵法生产的l 精氨酸总量达2 2 0 0 吨，其中仅日本的生产量就 高达1 0 0 0 吨。 目前，世界上l 精氨酸的主要生产国为日本( 生产厂家：田边制药、味之素和协和 发酵) 。韩国的氨基酸生产发展也很快，其味元公司年产l 精氨酸能达2 0 0 吨。日韩欧 美等国都在积极开发重组菌株生产l 精氨酸的技术，但目前真正投入生产的不多。目前， 国际上采用发酵法生产l 精氨酸产量能达到5 6 ，提取率达到8 5 ( 日本) ，但我国采 用发酵法生产l 精氨酸产量只能达到2 5 ，提取率为7 5 8 , 9 1 。 随着市场需求量的增加，我国也陆续建设了精氨酸的生产装置，但基本是加工精品 l 精氨酸，即将外国的粗品l 精氨酸提纯精制后配制成复合的氨基酸输液原料，而且产 量也非常有限，目前主要依赖进口。 1 3l 精氨酸在生物体内的合成途径 在微生物中，由l 谷氨酸到l 精氨酸的合成有三种途径：线性途径、循环途径以 及一个近年来新发现的稀有途径【1 0 , 1 1 1 ( 图1 2 ) 。在线性途径中，l 精氨酸合成的第一步反 应由乙酰谷氨酸合成酶( a c e t y l g l u t a m a t es y n t h a s e ，a g s a s e ) ( a r g a 编码) 催化谷氨酸加上乙 酰基团生成乙酰谷氨酸，第五步乙酰鸟氨酸的脱乙酰反应由乙酰鸟氨酸酶 ( a c e t ) r l o m i t h i n a s e ，a o a s e ) ( a r g e 编码) 催化完成，从谷氨酸到鸟氨酸的合成经历五步反应 2 第一章绪论 形成一系列的中间体，并消耗一分子的乙酰辅酶a 。采用这种线性途径合成l 一精氨酸的 微生物有大肠杆菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 1 1 2 j 、铜绿假单胞菌( p s e u d o m o n a sa e r u g i n o s a ) u 3 j 及古 细菌中的硫化裂片菌( s u l f o l o b u ss o t f a t a r i c u s ) u 4 j 等。在循环途径中，乙酰鸟氨酸的脱乙 酰反应由鸟氨酸乙酰转移酶( o r n i t h i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e s ，o a t a s e ) ( a r g j 编码) 催化， o a t a s e 在脱乙酰的同时把从乙酰鸟氨酸上脱下的乙酰基团转移给谷氨酸，生成乙酰谷 氨酸，综合了线性途径中a g s a s e 和a o a s e 的功能。由于o a t a s e 实现了乙酰基团的循 环利用，使微生物体内的乙酰辅酶a 闲置出来，可用于生物体内其他重要的代谢，所以 这一途径又称为经济循环途径，采用这一途径的微生物有嗜热脂肪芽孢杆菌( b a c i l l u s s t e a r o t h e r m o p h i l u s ) ”】、酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 1 6 j 、奈瑟氏淋球菌( n e i s s e r i a g o n o r r b o e a e ) t 1 7 】及大部分原核生物。此外，近年来在野油菜黄单胞菌( x a n t h o m o n a s c a m p e s t r i s ) 1 8 】中发现了一个新的途径，如图1 2 所示：乙酰鸟氨酸不经过脱乙酰生成鸟 氨酸的环节，而是由a r g f 编码的乙酰鸟氨酸氨甲酰转移酶( a c e t y l o m i t h i n e c a r b a m o y l t r a n s f e r a s e ，a o t c a s e ) 催化生成乙酰瓜氨酸，乙酰瓜氨酸再由a r g e 编码的酶 脱乙酰生成l 瓜氨酸。 采用线性途径的微生物，其l 精氨酸合成途径的第一个酶：a g s a s e 是终产物l 精 氨酸反馈抑制的靶目标【l9 】；而采用循环途径的微生物，被l 精氨酸抑制的关键酶是合 成途径的第二个酶：乙酰谷氨酸激酶( a c e t y l g l u t a m a t ek i n a s e ，n a g k ) t 2 0 】。谷氨酸棒杆菌 图1 2l 精氨酸的生物合成途径 f i g 1 - 2b i o s y n t h e t i cp a t h w a yo fl - a r g i n i n e 口曙a ：乙酰谷氨酸合成酶；a r g b ：乙酰谷氨酸激酶；孵c ：乙酰谷氨酸半醛脱氢酶；a r g d ：乙酰鸟 氨酸转氨酶；a r g e ：乙酰乌氨酸酶；口，g f ：鸟氨酸转氨甲酰酶；a r g f ：乙酰鸟氨酸氨甲酰转移酶； a r g g ：精氨酸琥珀酸合成酶；a r g h ：精氨酸琥珀酸酶；a r g j ；乌氨酸乙酰转移酶 江南大学硕士学位论文 ( c o r y n e b a c t e r i u mg l u t a m i c u m ) 被l 精氨酸抑制的关键酶是n a g k ，此酶不仅被l 精氨酸 反馈抑制亦被其反馈阻遏【2 1 1 。原核微生物的l 精氨酸生物合成基因都受a r g r a h c r 基 因编码的同一阻遏蛋白的调控i 1 0 1 。2 0 0 1 年，cg l u t a m i c u m a t c c l 3 0 3 2 全基因组序列的 公布及其相关代谢网络调控机制的研究，为我们利用谷氨酸棒杆菌中l 精氨酸合成相关 基因簇的信息来研究本实验室遗传背景未见报导的钝齿棒杆菌奠定了基础。 1 4l 精氨酸生产的国内外研究进展 目前国际上，日本、德国和美国在氨基酸产量、品种和技术水平上居世界领先地位。 在l 精氨酸的发酵生产方面，日本具有世界领先水平，其产酸能稳定在6 0g l 左右， 糖酸转化率也在2 5 左右。我国l 精氨酸的生产水平远远落后于日本、德国等发达国 家。目前我国现有的l 精氨酸生产厂家仍多采用水解天然蛋白质的方法，该法操作费时， 收率低，稳定性不好且环境污染严重。 1 4 1l 精氨酸在传统诱变育种方面的研究进展 传统的诱变育种是指以葡萄糖、甘蔗、糖蜜等廉价原料为碳源，在代谢控制育种理 论的指导下，通过筛选营养缺陷型和结构类似物抗性突变株选育生产菌株。在l 精氨酸 生产上主要是以亚硝基胍为诱变剂对大肠杆菌和棒杆菌属的菌，如谷氨酸棒杆菌、黄色 短棒杆菌及我国应用较多的钝齿棒杆菌等进行的选育。 资料表明，早年国外多采用传统的诱变选育方法，用物理化学等诱变剂对菌株进行 多次逐级诱变。筛选用的抗性药物有：( 1 ) l 精氨酸结构类似物，如：d 精氨酸、高精氨 酸、精氨酸氧肟酸等，以解除l 精氨酸自身的反馈抑制和反馈阻遏；( 2 ) 嘌呤或嘧啶结 构类似物，如：5 羟基尿嘧啶，6 氮尿嘧啶等；( 3 ) 氟乙酸、氟柠檬酸、重氮丝氨酸，以 增加l 精氨酸的前体氨基酸谷氨酸的合成量。目前，日本的l 一精氨酸生产能力最强， 产酸6 0g l 。 我国最早开展l 精氨酸发酵法生产研究的是中国科学院微生物研究所，但是所选育 的菌株产酸水平较低，不能满足工业化生产的需要。8 0 年代，中科院的龚建华【2 2 】等以 谷氨酸棒杆菌a s l 5 4 2 为出发菌株，筛选获得一株能积累l 精氨酸的菌株，产酸3 4 l 。 上海工业微生物研究所苏令鸣【2 3 】等筛选黄色短杆菌，产酸31 3 l 。“十五”期间，江南 大学课题组与无锡晶海氨基酸有限公司合作，诱变获得了一株高产l 精氨酸菌株“钝齿 棒杆菌s y p w 5 0 1 1 ”，该菌株在5 0 0l 发酵规模上l 精氨酸产量可达4 5g , r l ，糖酸转化 率3 0 左右，为国内目前所报道发酵法生产精氨酸水平最高的菌株之一【z 4 乃】，但是该菌 株产酸不稳定，尚不能用于工业化生产。由此可见，在我国，l 精氨酸的生产成本高， 无法与国外同类产品相比，市场上的l 精氨酸基本依赖进口。 1 4 2l 精氨酸在基因工程育种方面的研究进展 随着近代分子克隆技术的发展，生产氨基酸的基因工程菌的研究开始起步，日本和 美国在此方面的研究较多。1 9 7 9 年，前苏联首次成功地构建了生产苏氨酸的基因工程菌， 1 9 8 3 年，日本首次构建了生产l 精氨酸的基因工程菌，通过将与精氨酸生物合成有关 4 第一章绪论 的基因导入谷氨酸棒杆菌或短杆菌中，提高精氨酸的产量。2 0 0 3 年，日本和德国分别独 立完成了氨基酸生产菌株谷氨酸棒杆菌a t c c l 3 0 3 2 的全基因组测序，对其3 0 0 2 个编码 蛋白质的基因功能进行了注释，并进一步利用基因工程、代谢工程和蛋白质组学等技术 对生产菌株进行了大量的改造。 国际上，k a t s u m t a 掣2 6 】采用棒状杆菌属、短棒杆菌属的菌为宿主，以实验中构建的 穿梭质粒p e n a r l 为载体，携带来源于大肠杆菌的编码乙酰谷氨酸激酶的基因a r g b 来提 高l 精氨酸的产量，实现利用异源基因在棒状杆菌和短棒杆菌中的生产。1 9 9 8 年， s a v c h e n k o 2 7 j 等研究了丑s t e a r o t h e r m o p h i l u s 的串联基因a r g c j b d 的启动子强度，通过 控制合成l 精氨酸相关基因a r g c j b d 操纵子的表达来提高精氨酸产量。日本味之素公 司菅美贵子等通过增加精氨琥珀酸合成酶基因拷贝数，破坏缺失棒状茵中参与l 精氨酸 生物合成的编码精氨酸阻遏物的基因提高l 精氨酸产量。 在国内相关报道不多，2 0 0 6 年，中国科学院微生物研究所克隆了钝齿棒杆菌a s l 5 4 2 的n 乙酰谷氨酸激酶基因a r g b ，并将其在棒杆菌中进行了表达，l 精氨酸积累提高约 2 5 蝌2 引。江南大学通过p c r 扩增获得了钝齿棒杆菌s y p w 5 0 1 1 菌株精氨酸合成相关基 因簇中的a r g c j b d ，并在ec o l i 中成功表达【2 9 1 。 1 5 乌氨酸乙酰转移酶的研究进展 1 5 1 鸟氨酸乙酰转移酶的功能 在不同的微生物中，a r g j 基因编码的鸟氨酸乙酰转移酶( o m i t h i n ea c e t ，r l t r a n s f e r a s e s ， o a t a s e ) 有单功能和双功能两种类型。 单功能的o a t a s e 只具有对乙酰鸟氨酸的脱乙酰功能，即相当于线性途径中乙酰鸟 氨酸酶( a o a s e ) ( a r g e 编码) 的功能；双功能的o a t a s e 兼具线性途径中a o a s e 和乙酰谷 氨酸合成酶( a g s a s e ) ( a r g a 编码) 的功能【1 1 1 ，在催化乙酰鸟氨酸脱乙酰的同时能够把脱下 的乙酰基团转移给谷氨酸生成乙酰谷氨酸。 1 5 2 乌氨酸乙酰转移酶的研究进展 1 9 7 8 年，s h i n n e r s 等人对g o n o r r b o e a e 的l 精氨酸合成途径中几个相关的酶进行 了活性分析，建立了o a t a s e 酶活性的显色反应检测方法【3 0 】。 1 9 9 2 年，m a r t i n 等人对g o n o r r b o e a e 的a r g j 基因进行了克隆及同源性分析【l 7 。 1 9 9 6 年，s a k a n y a n 等人提出cg l u t a m i c u m 中a r g j 基因编码的o a t a s e 是一个单功 能的酶1 2 1j 。 1 9 9 7 年，c r a b e e l 等人对sc e r e v 括i a e 中编码o a t a s e 的a r 9 7 基因序列及催化功能进 行了分析，阐明了酿酒酵母中l 精氨酸的合成遵循经济循环途径，其o a t a s e 是一个双 功能酶【1 6 j 。 2 0 0 0 年，m a r c 等人对三株嗜热菌( m e t h a n o c c o c u s j a n n a s c h i i 、t h e r m o t o g an e a p o l i t a n a 及b a c i l l u ss t e a r o t h e r m o p h i l u s ) 的o a t a s e 进行了动力学机制的分析，并对其a r g j 基因的 功能类型进行了鉴定【3 。 江南大学硕士学位论文 2 0 0 1 年，m a r c 等人对嗜热脂肪芽孢杆菌中的o a t a s e 进行了深入研究，提出o a t a s e 中a t m l 保守序列的自身裂解位点在a ( 丙氨酸) 和t ( 苏氨酸) 之间，其中苏氨酸残基在 活性中心的形成中有着至关重要的作用【l 5 1 。 2 0 0 7 年，x u 等人对多种微生物中l 精氨酸的代谢途径进行了酶学和起源进化上的 分析，对部分菌中a r g j 基因的功能型进行了分类【1 。 1 6 立题意义与研究内容 1 6 1 立题意义 提高l 精氨酸产量最重要的策略之一就是提高生产菌株中l 精氨酸合成途径的代 谢通量。借助于基因克隆与表达技术，将l 精氨酸生物合成相关基因导入生产菌株中， 通过增加基因剂量、强化表达，可以达到提高l 精氨酸产量的目的。鸟氨酸乙酰转移酶 是l 精氨酸合成相关基因簇a r g c j b d f r g h 中的一个重要基因，对其进行增强表达可以 提高生产菌株中l 精氨酸的积累量。 在微生物中，l 精氨酸的合成途径有三种类型，确定生产菌株中l 精氨酸合成的具 体代i 勇 途径是对其代谢途径进行基因改造，构建出高产l 精氨酸生产菌株的一个基本前 提。a r g j 基因是l 精氨酸合成途径中的一个重要基因，决定l 精氨酸的代谢途径。a r g j 编码的o a t a s e 有单功能和双功能两种类型，目前国际上关于l 精氨酸生产菌株钝齿棒 杆菌( c o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ) 中o a t a s e 的具体功能尚无研究报道。 o a t a s e 中有一个高度保守的a t m l 序列，其中a ( 丙氨酸) 和t ( 苏氨酸) 间易自身裂 解，形成。【、d 两个亚基。对0 【、1 3 亚基分别扩增表达以及敲除，可以了解o a t a s e 生物 催化反应的具体作用机制，在此基础上可以进一步提高生产菌株中o a t a s e 的活力，增 强l 精氨酸合成途径的代谢通量，最终实现现有l 。精氨酸生产菌种产酸水平的提高。 1 6 2 研究内容 本论文的主要研究内容如下： 1 鉴定了cc r e n a t u mj n p h 5 8 中a r g j 基因的功能类型，并以不产l 精氨酸的c g l u t a m i c u ma t c c l 3 0 3 2 的a r g j 基因为对照，对cc r e n a t u mj n p h 5 8 的a r g j 基因进行了 克隆分析以及酶活检测，比较了cc r e n a t u mj n p h 5 8 和cg l u t a m i c u ma t c c13 0 3 2 两株 菌中o a t a s e 编码基因及酶催化活性的差异，找出了cc r e n a t u mj n p h 5 8 能高效积累 l 精氨酸的可能原因。 2 对双功能酶o a t a s e 的催化作用机理进行了初步研究。对o a t a s e 全酶中a 、b 两 个亚基进行了分别表达，并检测了仅、p 亚基单独作用时的酶活，另一方面对a 、p 亚基 进行了分别敲除，对基因敲除菌进行了催化活性分析和发酵产酸分析。 3 研究了a r g j 基因的过量表达对重组菌cc r e n a t u m ( p j c l t a c 。a r g j ) 生长和产物l 精氨酸积累的影响。以出发菌cc r e n a t u mj n p h 5 8 为对照，分析比较了钝齿棒杆菌重 组菌和出发菌o a t a s e 酶活性以及发酵特性的差异。 6 第二章材料与方法 第二章材料与方法 2 1 菌株与质粒 本研究所用菌株与质粒见表2 - 1 表2 1 菌株和质粒 t a b l e2 - 1t h es t r a i n sa n dp l a s m i d su s e di nt h i sw o r k 菌株质粒相关特性 菌 e s 砌p 厂触招疗b l 2l ( d e 3 ) 株 c d 缈p 6 叩胞一删咖砌记删 峨c c1 3 0 3 2 质 粒 r e c a l ，e n d a l ，g y r a 9 6 ，t h i - i ，h s d r l 7 ，s u p e 4 4 ，r e l a l ， a ( 1 a c - p r o a b ) l f t r a d 3 6 ，p r o a b + ，l a c l q ，l a c za m 15 】 f 。，o m p t ，凰豳b ( r a - ，m b - ) ，d c m ，g a l , k ( d e 3 ) ，p l y s s ，c m r 常用模式菌株 c d ，) 册p 6 竺等，7 删伽甩础删h i s ，s g r ，d a r c ，h a 心，工业用菌株 州p h 5 8 一 p m d l 9 - t p e t - 2 8 a p j c i - t a c t - a r g j p e t - 2 8 a - a r g j p j c1 - t a c - a r g j t v e c t o r ，2 7 k b ，a m p r ，l a c z ec o l i 表达载体，k m r ，h i s 标签，t 7 启动子 c g l u t a m i c u m ec o l i 穿梭表达载体，t a c 启动子，k m r 重组t 载体，a m p r 重组表达质粒，k m r ，h i s 标签，t 7 启动子 重组穿梭表达质粒，t a c 启动子，k m r p k l 9 m o b s a c b 自杀载体，k m r ，蔗糖敏感 _ _ - _ l 一_ _ _ - _ - - - _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ l - _ _ _ l _ - _ _ l _ _ - _ 一_ - _ - _ - - - _ _ - l _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ - _ _ - _ _ _ - - _ _ - _ - _ _ - _ _ - _ _ _ _ i _ _ _ _ - _ _ - _ - _ - - - - _ _ - _ - - _ _ 一 2 2 培养基与培养方法 2 2 1 培养基 2 2 1 1l b 培养基( g l ) 蛋白胨1 0 ，酵母粉5 ，n a c l1 0 ，p h7 0 。固体和液体培养基在需要时加入硫酸卡 那霉素至5 0p g m l ，氨苄青霉素至1 0 0 肛g m l ，固体培养基添加2 的琼脂，用于大肠 杆菌培养。 2 2 1 2 钝齿棒杆菌感受态细胞培养基( g l ) 蛋白胨1 0 ，酵母粉5 ，n a c l1 0 ，甘氨酸3 0 ，t w e e n 8 01 ，p h7 0 。 2 2 1 3 钝齿棒杆菌酶活检测培养基( g l ) 葡萄糖5 ，蛋白胨1 0 ，酵母粉5 ，n a c l1 0 ，p h7 0 。 2 2 1 4 斜面培养基( g l ) 葡萄糖2 0 ，蛋白胨1 0 ，牛肉膏l o ，酵母粉5 ，n a c l5 ，琼脂2 0 。p h7 o 7 2 ， 7 江南大学硕士学位论文 1 2 l 灭菌2 0m i n 。 2 2 1 5 摇瓶种子培养基( g l ) 葡萄糖3 0 ，玉米浆2 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 0 ，k h 2 p 0 4l ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，尿素1 5 。p h 7 0 7 2 ，1 2 1 灭菌2 0m i n ，摇瓶装液量3 0 m l 2 5 0 m l 。 2 2 1 6 摇瓶发酵培养基( g l ) 葡萄糖1 5 0 ，蛋白胨1 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 45 0 ，k h 2 p 0 41 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 2 ，m n s 0 4 h 2 0o 0 2 ，生物素8 1 0 一，l 一组氨酸5 0 x 1 0 4 ，c a c 0 33 0 。p h7 0 - - 7 2 ， 1 1 5 灭菌7m i n 。摇瓶装液量2 0 m l 2 5 0 m l 。 2 2 1 7 发酵罐发酵培养基( g l ) 葡萄糖10 0 ，玉米浆4 0 ，( n h 4 ) 2 s 0 42 0 ，k h 2 p 0 41 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0 o 0 2 ，m n s 0 4 h 2 0o 0 2 ，生物素5 1 0 ，l - 组氨酸5 0 x 1 0 4 ，氨水控制p h7 o 7 2 ，1 2 1 灭菌1 0m i n ，装液量3 l 5 l 发酵罐。 2 2 2 培养方法 2 2 2 1 棒杆菌：3 0 振荡培养过夜，往复式摇床转速为1 2 0r m i n 。 2 2 2 2 大肠杆菌：3 7 振荡培养过夜，往复式摇床转速为1 2 0r m i n 。 2 2 2 3 斜面活化培养：3 0 培养2 4 h 。 2 2 2 4 种子培养：从斜面上挑取一环菌体接入液体种子培养基，3 0 ，于往复摇床上 ( 1 2 0r m i n ) 培养1 4 1 6h 至对数生长后期( 检n o d 5 6 2 至0 6 ) 。 2 2 2 55 l 三联体全自动发酵罐分批发酵：5l 发酵罐中装液量3l ，接种量5 ，3 0 ， 通风量3l m i n ，流加氨水控* | j p n = 7 0 ，以植物油消泡，溶氧自动显示，控制搅拌转速为 6 5 0r m i n ，发酵9 6h 。 2 3 主要试剂与工具酶 2 3 1 生化试剂 葡萄糖、蔗糖、n a c l 、( n h 4 ) e s 0 4 、k h e p 0 4 、m g s 0 4 7 h 2 0 、m n s 0 4 h 2 0 、f e s 0 4 7 h 2 0 、 n a 2 h p 0 4 、n a i l 2 p 0 4 、茚三酮、双乙酰、甲萘酚、正丙醇、冰乙酸、氨水、无水乙醇、 牛肉膏、生物素、l 鸟氨酸、l 谷氨酸等均为国药产分析纯或化学纯试剂。蛋白胨、酵 母粉为o x i d e 公司产品。轻质碳酸钙、玉米浆由无锡晶海氨基酸有限公司提供。氨苄 青霉素、硫酸卡那霉素由上海生工生物工程技术服务有限公司提供。n 乙酰鸟氨酸、n 乙酰谷氨酸、乙酰辅酶a 购自s i g m a 公司。 2 3 2 蛋白质相关试剂 丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、t e m e d 、过硫酸铵( a p s ) 由伯乐( b i o r a d ) 公司提供； t r i s 、甘氨酸、小分子量蛋白质标准、s d s 、咪唑、i p g t ( 异丙基硫代p d 半乳糖苷) 、 b r a d f o r d 蛋白定量检测试剂盒为上海生工生物工程技术服务有限公司产品。 8 第二章材料与方法 2 3 3 工具酶及其他试剂 限制性内切酶b a m hi 、s a li 、髓d 对、t 4d n a 连接酶、r t a qd n a 聚合酶、p y r o b e s t t m d n ap o l y m e r a s e 购自t a k a r a 公司；g f t a q 酶、s f t a q 酶购自北京博大泰克生物基因 技术有限责任公司；细菌基因组d n a 提取试剂盒、小量质粒抽提试剂盒及琼脂糖凝胶 回收试