血红蛋白电泳及其临床应用.doc

血红蛋白电泳及其临床应用鄢盛恺中国医学科学院 中国协和医科大学 北京协和医院检验科，北京100730早在60多年前Pauling等（1949）在研究镰状红细胞贫血患者的血红蛋白（hemoglobin，Hb）时就发现其与正常人不同，证实这种异常的Hb在缺氧条件下是产生红细胞镰变和溶血性贫血的原因，并提出了“分子病”这一新概念。引起了人们对Hb结构异常及异常Hb与遗传性贫血之间关系的重视。近年来，由于生化技术和分子生物学技术的不断发展，相继发现和鉴定了许多新型异常的Hb。电泳技术作为分离与鉴定Hb最简便、准确的方法之一，广泛用于临床遗传性贫血（如地中海贫血）、异常血红蛋白病等疾病的临床诊治。1 概述 Hb的主要生理功能是将氧气从肺部运送到组织，同时将组织释放的二氧化碳带回到肺部完成氧气和二氧化碳的交换。Hb是由珠蛋白和亚铁血红素连接成的一种结合蛋白质。每一个Hb是由4个多肽链组成，而每一肽链又和一个铁卟啉结合。和血红素连接的珠蛋白是一种组蛋白，每一个珠蛋白分子由4条肽链组成，每一条肽链和一个血红素结合，构成一个Hb单体或称为亚单位。因此，每个Hb分子是由4个Hb单体聚合而成的四聚体。现在已知人类的红细胞中存在3种正常的Hb，即HbA、HbA2和HbF。从正常Hb中已发现、链、和4种不同肽链。这些Hb由均由一对链和一对非链组成。正常成人Hb的非链称为链，而胎儿Hb中的非链称为链。HbA含量最多，它由两条链和两条链组成；HbA2（占3%）由两条链和两条链组成。HbF正常含量是Hb的2%，由两条链和两条链组成。除HbA、HbA2和HbF外其他的各种Hb常被称为异常Hb。全世界目前已报道的异常Hb达450余种，而且每年还有新的发现。如美国最常见的两种Hb变异体是HbS和HbC，而Hb Lepore， HbE， HbA2 G-philadelphia等几类很少见。现已证实这些异常Hb的不同之处不在于亚铁血红素部分，而在于珠蛋白部分化学结构的差异。主要类型有：肽链中氨基酸的顺序略有差异。此类型最为多见，约占90%。如HbS（HbAHbS是由于2222S），HbC（HbAHbC是由于2222C）；各肽链的重新组合或某些正常肽链的缺失。如HbH（HbAHbH是由于224） ，Hb Barts（HbAHb Barts 是由于224） ；Hb肽链的融合。如Hb Lepore是链的一半（N端）与链的一端（C端）融合而成；肽链中氨基酸增多，可在中间嵌入或在C端延长。等。以前发现的Hb皆以英文字母命名，由AQ（B除外，加上S）。随着新发现的Hb越来越多，字母不够用，现规定从Q以后的字母不能再用以命名，而以发现地或实验室命名。 临床实验室常用的分离和鉴定Hb的方法有醋酸纤维素薄膜电泳、琼脂糖凝胶电泳、柱层析和一些有关的化学试验。地中海贫血是一种常染色体显性遗传病，是我国南方最常见和危害最大的遗传病之一。应用电泳法鉴别患者血液中Hb的类型及含量对于贫血类型的临床诊断及治疗具有重大意义。全自动电泳分析系统的引进将为临床诊断地中海贫血及异常Hb病提供准确的实验室方法和依据。近年来分子生物学技术已用于因异常Hb引起的遗传性疾病的基因诊断中。I-12 Hb电泳2.1 原理 Hb的分离和鉴定方法很多，其中以电泳法最为常用且最为重要，很多异常Hb都是首先用电泳法发现的。其原理是Hb中的珠蛋白和其他蛋白质一样为两性电解质，在不同的缓冲液中可带正或负电荷，在电场中向阴极或阳极移动。由于不同的蛋白质之间（正常Hb与异常Hb）其等电点、分子大小、形状及所带电荷的不同，其移动速率不同（电泳迁移率不同），在一定的支持介质中可借以分离。不同的电泳方法具有不同的电场强度、pH、缓冲液或支持物。2.2 常用方法 最常用的方法是碱性缓冲液电泳。早期用醋纤膜作为支持介质，在碱性环境下（pH8.48.6）可快速分离HbA、HbA2和HbF及其他多种变异体。可是不能将HbS与HbD和HbG分开，因为后3种Hb 在这一电泳系统中具有相同的迁移率。同样，在碱性条件下，HbC、HbE、HbO与HbA2也有相同的迁移率。1976年美国疾病预防与控制中心（CDC）和美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）曾推荐用醋酸纤维素薄膜电泳（Helena实验室的方法与之基本相同）作为异常Hb检测的初级试验。现多用分辨率更高的琼脂糖凝胶进行电泳分析。而酸性缓冲液（pH6.06.2）电泳可用来分离那些在碱性缓冲液电泳中不能分离开的Hb，如HbS及HbC。在此酸性条件下，HbD、HbO（或HbE）与HbS及HbC可明显的分开。电泳后Hb可用丽春红S、酸蓝或氨基黑10B进行染色，将电泳区带与已知的对照比较，并用光密度计进行扫描定量。对于一些特殊的Hb如HbS、HbA2、HbF和不稳定Hb（如HbM、HbH、HbE等）可分别采用溶解度试验、柱层析法、碱变性法（Singer法）及不稳定试验（异丙醇试验）进行鉴定。珠蛋白链电泳、等电聚焦和氨基酸序列分析可用来证实稀有的Hb存在，多用于研究。目前已有多种自动化电泳分析仪可应用于临床常规Hb电泳，如Helena 公司的REP、SPIEF等型号，Sieba公司的HYDRASYS。其中碱性缓冲液电泳为常用筛选方法。2.3 电泳结果2.3.1 碱性缓冲液电泳 在碱性缓冲液中所有Hb均向阳极移动，其移动顺序为：HbHHbA3 HbA1HbFHbS/HbD/HbGHbC，HbA2/HbC/HbE/HbOCA1CA2（CA1为碳酸酐酶1，CA2碳酸酐酶2）。正常人可见4条区带：HbAHbA2CA1CA2（若用联苯胺染色，CA1与CA2则不显色）。在点样处有一条蛋白带，它是非Hb成分，为细胞基质和膜蛋白。2.3.2 酸性缓冲液电泳 在酸性缓冲液中，HbA、HbD、HbE和HbG向阴极移动，而HbF比它们更靠近阴极。HbC向阳极移动得最快，HbS也向阳极移动，但比较接近点样点。2.3.3 结果报告 有两种报告方式：定性：将染色后的电泳胶片用质控胶片对比即可判断胶片有无Hb。定量：染色后的电泳胶片用光密度计扫描，报告各条带的百分比值。各区带参考值，根据不同年龄有不同的范围。例：正常成人： Hb（A+F）94.5%98.5% HbA2 2.5%3.5%新生儿(1个月)： HbA 12%40% HbF 6%93% HbA2 0.1%1.0%婴儿（3个月）：HbA 1.00%65.00% HbF34.3%82.95% HbA2 0.042%婴儿(6个月)： HbA 86%98% HbF 0.84%10.7% HbA2 0.87%2.9%I-23 临床意义 足月的初生婴儿血液中的约70%80%的Hb为HbF，同时也存在少量的HbA和HbA2。不久HbF浓度迅速下降，同时HbA相应增加，绝大多数于出生后6个月至2年后，HbF降至成人的正常水平。HbA2增高是轻型地中海贫血的一个重要特征。HbA2减低见于缺铁性贫血及其它Hb合成障碍性疾病（常见如地中海贫血）。电泳发现异常Hb如HbH、Hb Barts、HbC-S、HbK等则可确诊为相应的Hb分子病。据广东省人民医院资料统计，该院一年所做Hb电泳5800人次（所有产前检查及贫血待查病人），共检出地中海贫血和异常Hb病患者1375人，阳性率23.7%。其中（1）地中海贫血基因携带者（HbH病患者、PCR确诊-地中海贫血、新生儿Hb Barts区带者）1018人，阳性率17.6%。（2）-地中海贫血基因携带者327人，阳性率5.6%。(3)异常HbJ、HbK、HbN、HbG、HbD和HbE共30人占总人数0.52%。3.1 -地中海贫血 是由于珠蛋白基因缺失或突变，导致珠蛋白肽链合成障碍所致。我国多数是珠蛋白基因缺失。3.1.1 静止型-地中海贫血 无临床症状、体征、无贫血，红细胞形态正常。HbA2和HbF正常，新生儿期可出现1%3%Hb Barts，出生后3个月消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.2 标准型轻型 患者无症状。呈轻型小细胞低色素性贫血。有轻度红细胞形态改变。HbA2含量为正常低限（1.5%2.5%），/约1.4/1，HbF正常。新生儿期Hb Bart 可达5%8%，6个月完全消失。父母任一方有-地中海贫血。3.1.3 HbH病 临床表现有轻、中度贫血，2/3以上病例有肝脾肿大，常反复出现黄疸。在妊娠、感染及使用氧化剂时，Hb显著下降。父母双方常有-地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓中红细胞系统增生极度活跃。HbH明显增高（2.540），HbA2及HbF含量正常。Hb电泳可出现HbH区带。红细胞渗透脆性试验降低，红细胞包涵体阳性。3.1.4 Hb Barts 胎儿水肿综合征 临床表现：该病为-地中海贫血中最严重者，胎儿常于妊娠后期死亡或早产。胎儿生下时，全身水肿，皮肤苍白，黄疸，肝脾肿大，常于产后数小时内死亡。父母双方均有HbH病或标准型-地中海贫血。实验室检查：有溶血性贫血的特征，骨髓红系增生活跃。红细胞形态靶形红细胞明显增多，外周血可见有核红细胞。Hb电泳：Hb Bart成分80，抗碱Hb增加，出现少量Hb Portland或少量HbH。3.2 -地中海贫血 是由于珠蛋白链合成减少或完全不能合成所致。完全不能合成珠蛋白链的地贫基因称为0，合成减少的称为+。3.2.1 重型 临床表现：又称库利氏贫血（Cooleyanlsnua）患者症状严重，多在儿童期夭折。少数症状较轻，可活至成年，此型又常称为中间型。库利氏贫血在婴儿期69个月开始出现贫血，黄疸、肝脾肿大。儿童患者发育不良、智力迟钝、骨骼改变如颧骨隆起，眼距增宽，鼻梁低平。线可见外板骨小梁条纹清晰呈直立的毛发样等。多在幼儿时死于重度贫血或感染。若能生长超过10岁，可出现个体矮小，性功能、甲状腺及甲状旁腺等功能低下，可继发血色病，出现心律系乱、心力衰竭、肝硬化、糖尿病等。父母常均有轻型-地中海贫血。实验室检查： Hb30。I-33.2.2 轻型 临床表现：无症状或有轻度分血症状，肝脾无肿大或轻度肿大。父母一方为-地中海贫血杂合子。实验室检查：Hb稍降低或正常，外周血少量靶形细细胞。HbA13.5，HbF轻度增加（不超过5）。3.2.3 中间型 临床表现：症状和体征介于重型和轻型-地中海贫血之间。实验室检查：同重型-地中海贫血。遗传学：父或母均为-地中海贫血杂合子状态。根据临床表现，小细胞低色素性贫血，Hb电泳及HbF、HbA2含量测定有家族史，一般不难作出诊断。3.3 异常Hb病 异常Hb病指因正常成人HbA的产生受到部分或完全的抑制，被另一种或几种异常的Hb部分或完全取代而产生的病症，例如HbS和HbC等常与溶血性贫血、镰状红细胞或靶形红细胞等特征联系在一起。实际上，某些异常Hb的存在，并不引起生理上的任何特征，也并不是所有异常Hb携带者都有特殊的临床表现。有些异常Hb携带者，可以终生健康地生活，仅在居民普查或因其它疾病就医时才被发现。当然，这些Hb变异体仍有其生物化学、遗传学及人类学意义。那些有临床意义的异常Hb，涉及到预防，治疗等一系列问题。早期发现的一些Hb变异体，如Hb、等，多出现在溶血性贫血患者身上。现在看来，有一些可能伴有地中海贫血。镰状细胞贫血是由纯合子HbS引起的是一种很