结题书修改版(刘亿云）

项目类别项目批准号BL05010附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：FMDV免疫活性串联片段在T4噬菌体表面的展示 申 请 人： 刘忆云 冯凯玲 廖为仪 所在院部： 动物科学学院 科技部 专业年级： 动物科学2003级 联系电话： 38675769 指导教师: 马静云 职称 讲师 立项日期： 二五 年 四 月 五 日 结题日期： 二六 年 四 月 五 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 填 表 说 明 一、 填写结题报告书前，请先咨询指导教师或有关专业教师。申请书的各项内容要求实事求是，逐条认真填写。表达明确、严谨，一律要求用打印稿件。 二 、申请书为A4复印纸，于左侧装订成册。一式三份（至少一份原件），由指导教师和所在院（部）审查并签署意见后报大学生科技创新活动项目指导中心。三 、一级标题三号宋体加粗，用“一、二、三”标示；二级标题四号楷体加粗，用“（一）（二）（三）”标示；三级标题四号仿宋加粗，用“1、2、3”标示；四级标题四号仿宋，用“”标示。示例：一、XXXX课题立项与研究的目的意义（一）XXXX课题立项与研究的目的的意义1、XXXX课题立项与研究的目的意义XXXX课题立项与研究的目的意义四、如表格不够，可以加附页。一、简表项目简况项目名称FMDV免疫活性串联片段在T4噬菌体表面的展示项目类别A、文科类； B、理科类；B申请经费1500元起止年月20055-20063项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字刘忆云女1985.22003生物工程动物科学37基因克隆冯凯玲女1984.32003生物工程动物科学36噬菌体展示廖为仪女1984.62003生物工程动物科学36ELISA建立指导教师情况姓名马静云性别女学位博士职称讲师研究方向分子病毒学营养与免疫授课名称基因工程实验技术、营养与免疫专题项目简介采用PCR的方法获得口蹄疫结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB，通过同源重组的方法将FB基因与SOC基因融合并展示在T4噬菌体的表面，获得重组的T4-FB噬菌体，对重组的噬菌体免疫原性进行研究，为下一步口蹄疫基因工程疫苗及诊断试剂盒的研制打下良好的基础。二、项目研究的内容与方法（一）基本内容：1、合成口蹄疫病毒VP1基因免疫活性串联片段，并将其克隆到T4噬菌体展示系统pSOC质粒中。2、通过同源重组的方法将免疫活性串联片段重组进T4噬菌体基因组中，并将其展示在T4噬菌体表面。3、以纯化重组T4噬菌体作抗原，对其免疫原性进行研究。（二）实施方案：1、FMDV 结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB的获得以实验室合成保存的质粒MA为模板，合成一对引物，通过PCR方法扩增得到结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB的cDNA片段。2、FMDV 结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB在T4噬菌体表面的展示将免疫活性串联片段FB基因克隆进T4噬菌体展示系统pSOC质粒中，与T4噬菌体SOC基因融合，通过同源重组整合到T4噬菌体基因组中，随后将其展示在T4噬菌体表面，获得FMDV免疫活性串联片段T4-FB。3、重组噬菌体免疫活性的研究以重组噬菌体为抗原，通过Western blot、ELISA等方法研究其免疫活性。三、项目研究过程与资料查阅情况（一）研究过程：以实验室合成保存的质粒MA为模板，合成一对引物，通过PCR方法扩增得到结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB的cDNA片段。将免疫活性串联片段FB基因克隆进T4噬菌体展示系统pSOC质粒中，与T4噬菌体SOC基因融合，通过同源重组整合到T4噬菌体基因组中，随后将其展示在T4噬菌体表面，获得FMDV免疫活性串联片段T4-FB。（二）资料查阅情况：1 Collen T, Dimarchi R, Doel TR .1990. T cell epitope in VP1 of foot- and- mouth disease virus is immuno- dominant for vaccinated cattle.J. J. Immunol , 146: 749-755 2 Van Lieop MJC, Van Maanen K, Melonen RH, et al. 1992. Proliferative lymphocyte response to foot- and- mouth disease virus and three FMDV peptides after vaccination or immunization with these peptides in cattle.J.Immuonlogy , 75: 406-4133 Wong HT, Cheng SCS, Chan EWC, et al. 2000. Plasmids encoding foot- and- mouth disease virus Vp1 epitopes elicited immune responses in mice and swine and protected swine against viral infection J. Virology, 278: 27-354 Zamorano P, Wigdorovitz A, Peter- Filguerira M, et al. 1995. A 10- amino- acid linear sequence of VP1 of foot- and-mouth disease virus containing B- and T- cell epitopes inducesprotection in mice J. Virology, 212: 6146215 徐泉兴，尤永进，赵洪兴等，1998.“O”型口蹄疫病毒生物合成多肽苗免疫效力.上海农业学报，14（1）：1-36 徐泉兴，尤永进，葛艳等，2000.猪O型口蹄疫病毒基因工程疫苗免疫猪的免疫效力、安全性及抗体消长.中国预防兽医学报，22（增刊）：133-1367 马静云,曹永长,毕英佐，2004.口蹄疫病毒免疫活性串联片段FB的表达及免疫原性测定（英文）.生物化学与生物物理进展，31(5)：438-442四、项目成果完成形式和价值本研究中，将合成的该串联片段FB与T4噬菌体SOC基因重组为融合基因，置于T7启动子控制之下，经IPTG诱导，表达融合蛋白SOC-FB。噬菌体展示以及Western blot试验结果表明，融合蛋白SOC-FB具有良好的免疫原性，为下一步进行口蹄疫基因工程疫苗和诊断方法的研制奠定了良好的基础（见附录）。项目完成后形成论文一篇“FMDV免疫活性串联片段FB与T4噬菌体SOC基因的融合表达”，将在中国兽医科技2006年5月发表（已经收录）。五、经费使用情况项目申请的经费为1500元，实际使用超过5000元，主要用于试剂和耗品的购买，超出部分由指导教师科研经费补给。六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结 该项目研究重在采用PCR的方法获得口蹄疫结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB，通过同源重组的方法将FB基因与SOC基因融合并展示在T4噬菌体的表面，获得重组的T4-FB噬菌体，对重组的噬菌体免疫原性进行研究。为口蹄疫基因工程疫苗及诊断试剂盒的研制打下基础。在本次实验中，本小组成员在老师的带领下都认真的完成了研究工作，除了对口蹄疫病毒有了一些初步的认识之外，还掌握了基因工程的一些基本原理和基本实验操作能力，使得今后的研究工作有了一定的基础。 七、指导教师对项目完成情况的意见本项目小组成员在项目完成过程中能够认真学习,较好地掌握了基因工程的操作过程,基本达到立项时的指标；项目完成后认真查阅文献,能够初步完成论文的撰写。通过这个实验，项目组成员掌握了基本的实验技能和专业理论知识，对学术论文的撰写也有了一定的认识。签字： 年 月 日八、项目所在单位专家评审意见签字： 年 月 日九、主管部门审核意见 单位盖章 负责人签字： 年 月 日附录：FMDV免疫活性串联片段在T4噬菌体表面的展示摘要将FMDV免疫活性串联片段FB的cDNA片段插入表达质粒pSOC的EcoR I位点，获得重组质粒pSOC-FB。用pSOC-FB转化E. coli BL21(DE3)，获得表达FB蛋白的工程菌BL-SOC-FB。在1 g/mL IPTG诱导之下，BL-SOC-FB表达了融合蛋白SOC-FB，其分子量为19ku。SDS-PAGE检测表明，融合蛋白SOC-FB的最大表达量为细菌总量的24.5%。Western blot分析表明，大肠杆菌表达的SOC-FB能与FMDV阳性血清发生特异性反应。将串联片段FB克隆进穿梭质粒pRSOC中，通过同源重组的方法展示在T4噬菌体表面，将获得的重组噬菌体T4-FB作为包被抗原进行ELISA检测，结果表明，重组噬菌体能够与口蹄疫特异抗血清进行特异性结合，具有良好的免疫活性。关键词：口蹄疫病毒，免疫活性串联片段，T4噬菌体， 噬菌体展示1 前言口蹄疫（Foot and Mouth disease，FMD）是公认的动物疾病中的烈性传染病，该病的病原口蹄疫病毒（Foot and Mouth disease virus，FMDV）能引起牛、猪、羊、驼等偶蹄动物的口腔黏膜、舌面、蹄冠、指间或在乳房发生特征性的水泡性病变。口蹄疫在世界分布很广,是国际间相互传播流行蔓延的世界性流行性传染病。欧洲、亚洲、非洲、南北美洲、拉丁美洲以及大洋洲，历史上都有过发生。迄今为止只有新西兰在历史上是唯一未发生过口蹄疫的国家。澳大利亚、美国、日本、加拿大、墨西哥相继宣布消灭口蹄疫，后采取严格防范措施，禁止从有口蹄疫国家或地区输入动物及其产品，并因有四面环海的天然屏障,未再传入口蹄疫，属长期无口蹄疫国家。可是在现今国际贸易日趋繁荣、物资交流和旅游活动日益便捷的情况下，许多国家都有可能再度遭到口蹄疫的袭击。FMD的传播途径有空气、急性或持续感染的野生动物及感染的动物或动物产品、农具等。目前有效预防和控制本病的主要措施是定期进行大规模接种同种血清型的口蹄疫别能苗或弱毒苗。疫情一经爆发，要严格采取扑灭措施，并限制动物移动，进行免疫接种。口蹄疫病毒属于微RNA病毒科、口蹄疫病毒属，是正单股RNA病毒（小核糖核酸病毒科口疮病毒属，是细小的正链RNA病毒）。本病毒有七个血清型，70个以上的血清亚型，及很多抗原变异株（Mateu et al.，1988；Woodhouse et al.，2001）。七个血清主型，即A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3及Asia1型，各主型之间无交互免疫力。据流行情况，目前最常见的FMD是O型和Asia1型病毒引起的（Reid et al.，1998）。FMDV含有4种结构蛋白VP1、VP2、VP3、VP4,其中VP1携带引发宿主细胞对FMDV的免疫反应的关键性抗原表位,单独的VP1能够刺激机体产生中和抗体。在已发现的O型5个抗原位点中,有3个位于VP1上,其中140160位氨基酸处的G-H环是最主要的保护性抗原位点,空间构象比较复杂,具有较大的运动性,在其顶部形成了一个高度保守的Arg-Gly-Asp(RGD)序列,是FMDV的细胞受体位点。VP1的第140160和200213位氨基酸残基是2个主要的B细胞表位,能诱导抗FMDV的中和抗体,VP1的第141160位氨基酸残基中也含有至少一种T细胞表位,能诱导FMDV专一性的T细胞反应。HOC（Highly antigenic outer caspid protein）和SOC（Small antigenic outer caspid protein）蛋白是存在于T4噬菌体表面的2种衣壳蛋白，数量分别达到160和960拷贝，二者的缺失或突变不影响T4的装配。与其它噬菌体载体相比，T4噬菌体表达系统功能更为强大，外源蛋白与HOC或SOC 的N-端或C-端连接，以融合蛋白的形式展示在其衣壳表面，并保持外源蛋白相对独立的空间构象和生物学活性，对那些不易分泌表达或半衰期短的外源蛋白尤为适用。本实验采用PCR的方法获得口蹄疫结构蛋白VP1基因免疫活性串联片段FB，通过同源重组的方法将FB基因与SOC基因融合并展示在T4噬菌体的表面，获得重组的T4-FB噬菌体，对重组的噬菌体免疫原性进行研究，为下一步口蹄疫基因工程疫苗及诊断试剂盒的研制打下良好的基础。2 材料与方法2.1实验材料2.1.1 质粒及菌株含有FB片段的质粒MB由本实验室保存；质粒pSOC为含有T4噬菌体小外壳蛋白基因soc的原核表达质粒（Ren et al, 1996），质粒pR为T4噬菌体整合质粒，E.coli E2，由任兆钧博士惠赠，本实验室保存； E. coli BL-21(DE3)、含pSOC质粒的E. coli DH5a含pR质粒的E. coli DH5a均由本实验室于-80保存。2.1.2血清和二抗猪O型FMDV阳性血清由广东省兽医防疫检疫站惠赠。抗猪IgG(二抗)购自基因公司。2.1.3酶类及其它试剂 Ex Taq DNA聚合酶（5u/L）、dNTPs（2.5mM each）、DNA Marker DL2000均为TaKaRa产品；E.Z.N.A. Plasmid inipreps Kit 和E.Z.N.A. Gel Extraction Kit 均为Omega产品；预染色的蛋白质分子量标准（Precision ProteinTM standards，Pristained，broad Range）为Bio-Rad产品；抗猪IgG（二抗）、硝酸纤维素膜购自基因公司。IPTG购自宝生物（大连）有限公司。2.1.4培养基及常用溶液LA液体培养基：Tryptone（OXOID公司）10g，Yeast Extract（OXOID公司）5g，NaCl 10g，加双蒸水定容至1,000ml，加入1L/mL AMP（100mg/mL），高压灭菌20min后4保存。SC培养基：先制备底层琼脂，取 胰蛋白胨 5.0g NaCl 10 g 琼脂 12g ddH2O 补至1000mL高压灭菌后冷却至55，加入1M Tris-HCl(Ph7.5)50 mL和25枸掾酸钠2H2O10mL，立即铺入无菌平皿，置4冰箱备用。 再制备顶层琼脂：取 胰蛋白胨 10.0g NaCl 5.0g 琼脂 7.0g ddH2O 补至1000mL高压灭菌后冷却至55，加入1M Tris-HCl(Ph7.5)50 mL和2.5枸掾酸钠2H2O10mL（必要时加入10mg/ mL溶菌酶20 mL或新鲜的E.coli E2菌液20mL），立即倒入底层琼脂上，凝固后置4冰箱备用。M9S培养基：取 Na2HPO412H2O 17.65g KH2PO4 3.0g NaCl 0.5g NH4Cl 1.0g GlucoseH2O 4.4g Casamino acode 5.0g 1M CaCl2 100mL MgSO4 0.5043g ddH2O 补至1000 mL105121高压灭菌15min，4冰箱保存备用。2.1.5 SDS-PAGE电泳试剂A液（丙烯酰胺贮存液）：30（w/v）丙烯酰胺，0.8（w/v）N，N-亚甲双丙烯酰胺，用三蒸水配制，避光，4贮存于棕色瓶中。B液（4分离胶缓冲液）：1.5mol/L Tris-HCl （pH8.8），0.4%SDS。4贮存。C液（4堆积胶缓冲液）：0.5mol/L Tris-HCl （pH6.8），0.4%SDS。4贮存。1SDS-PAGE电泳缓冲液：25mmol/L Tris-HCl，250mmol甘氨酸，0.1%SDS，将pH值调至8.3，室温保存。5SDS-PAGE电泳加样缓冲液：60 mmol/L Tris-HCl（pH6.8），14.4 mmol/L DTT，%2 SDS，0.1%溴酚蓝，25甘油。甲醇/醋酸溶液：90mL甲醇:水（1:1）和10mL冰醋酸混匀。考马斯亮蓝染色液：0.25g考马斯亮蓝溶解于100mL甲醇/醋酸溶液，Whatmam号滤纸过滤。2.1.6 Western blot 试剂转移缓冲液：25mM Tris,192mM甘氨酸，20（v/v）甲醇，0.037（w/v）SDS，用HCl调pH值至8.3。TBS缓冲液：150 mM NaCl，10mmol/L Tris-HCl（pH7.5）。封闭液：5（w/v）脱脂奶粉，0.2叠氮钠，0.5吐温20，用TBS缓冲液配制。1脱脂奶粉/ TBS：含0.5（w/v）BSA的TBS溶液，用于抗体（包括一抗、二抗）的稀释。显色液：在9mL0.01 mol/L Tris-HCl（pH7.6）缓冲液中溶解6mg二氨基联苯胺，加入1mL0.3氯化钴（CoCl2）,最后加入10L30双氧水（H2O2），混匀后立即使用。2.1.9主要仪器 PCR Express Gradient PRC HYBAID公司产品。 凝胶成像系统，法国VL产品。 6K15高速冷冻离心机，sigma公司产品。 遥控温床，美国Themo公司产品。 新芝超声破碎仪。2.2实验方法2.2.1免疫活性串联片断FB的PCR扩增2.2.1.1VP1免疫活性串联片断FB的设计及合成 根据相关文献资料（马静云，2003）关于FMDV VP1基因的序列分析结果，设计出免疫活性串联片段FB，合成后的串联片段包含FMDV VP1蛋白中的132-159位及200-213位氨基酸残基，为了提高免疫原性，将这两个肽段组成132159-200213-132159串联结构，在各肽段之间分别加入2、11个氨基酸，组成87个氨基酸的片断。FB片断以重组质粒MB的形式由动物科学学院基因工程实验室设计，上海基康生物技术有限公司合成。2.2.1.2 引物的设计与合成2.2.1.2.1免疫活性串联片断FB的引物设计 应用DNASTAR软件，根据合成后的串联片段基因序列设计一对特异引物FBS1/FBS2，用于从含有FB片断的质粒MB中扩增FB得到片段，该引物理论跨幅为261bp。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液FBS1：5-tgttgcactaacaacgtgcgtggc-3，在5端加上EcoR I 酶切位点FBS2：5-accacacggcggcagagtacgtt-3;，在5端加上EcoR I酶切位点2.2.1.2.2检测融合基因soc-FB的SOC-S引物设计应用DNASTAR软件，根据已发表的T4噬菌体小外壳蛋白（small outer capsid protein，SOC）基因序列，设计了另1个引物SOC-S用于检测融合基因SOC-FB,融合基因PCR产物大小约为460bp。合成后的引物用三蒸水稀释成25mmol/L溶液-20保存。引物序列如下：SOC-S：5-gaatcatatggctagtctcgcgg-3（Ren et al, 1996）。以上引物均由上海博亚生物公司合成。2.2.1.3 免疫活性串联片断FB的PCR扩增扩增FB片断的引物为FBS1,FBS2，模板为上海基康生物技术有限公司合成提供的还有FB片断的重组质粒MB，将重组质粒100倍稀释，用作PCR反应的模板。PCR反应体系共100L, PCR反应体系为 10buffer 10L dNTPs 4L FBS1 1L FBS2 1L 模板 2L Ex Taq 0.5L ddH2O 补至100L 将上述反应体系分别混匀后离心，在PCR Express Gradient PCR仪上执行如下反应程序：94预变性3min，一个循环；9440s，5240s，721min，30个循环；72后延伸20min。PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测。2.2.1.4 PCR产物的回收与纯化 按Omega公司的胶纯化试剂盒说明书进行，将PCR产物电泳后，尽可能小地切下含目的基因片断的凝胶，加入3倍体积的Binding Buffer，50水浴10min使胶溶化。将上述液体加到离子交换柱中，10,000r/m离心1min，弃去液体，离子交换柱用洗液洗两次，10，000r/m离心1min以甩干残留的洗液，最后用适量洗脱缓冲液洗脱核酸，并电泳检测回收效果。2.2.1.5 PCR产物的加尾在0.5mL微量离心管中加入下列组分（共10L） 10buffer 1L dATP 0.5L 纯化的PCR产物 7.5L Taq DNA聚合酶 1L混匀离心后，70反应30min.2.2.1.6 PCR产物与载体的连接 连接反应体系为（共6L） 加尾的PCR产物 4L pSOC 1L salt solution 1L 混匀离心后，于22-23连接10min。连接产物直接用于转化。2.2.1.7 E. coli DH5a感受态细胞的制备参照姜泊等（1996）的分子生物学常用实验方法。用CaCl2法制备感受态细胞。挑取DH5a单菌落接种于3mL LB液体培养基中，37振摇培养过夜；取1 mL培养好的菌液接种于含有100 mL LB液体培养基的500 mL三角瓶中，37激烈振摇（215r/m）培养2-2.5h，待OD600值达到0.3-0.4时，立即将三角瓶取出置于冰浴中10min，4 3,000r/m离心10min，彻底弃去上清液，菌体用10mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬，冰浴15min，再于43,000r/m离心10min，弃去上清液，取4 mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体，4过夜，即可用于转化。2.2.1.8 连接产物转化DH5a感受态细胞取上述制备的感受态细胞50L，加入2.2.2.6中制备的连接产物2L，混匀后冰浴30min，42热休克50s，迅速转移到冰浴中冷却2min，加入400L不含抗生素的LB液体培养基，于37摇床中以150r/min振摇培养90min；取200L菌液涂布于含Amp（100mg/L）的LB平板中，37培养过夜。2.2.1.9 重组质粒的鉴定从上述过夜培养的平板中挑取五个单菌落，接种于3mL含Amp（100mg/L）的LB液体培养基中，37振摇3h后，分别用PCR和酶切反应进行鉴定。直接以菌液作为模板，分别用两对引物FBS1/FBS2、SOCS/ FBS2进行扩增进行PCR鉴定。反应体系为10buffer2L，dNTPs1L,引物各0.2L，TaqDNA聚合酶0.5L，菌液1L，用三蒸水补至20L。反应程序同2.2.2.3。PCR产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测，两对引物同时扩增出目的片段的为阳性转化子。对PCR鉴定为阳性的菌落，用E.Z.N.A. plasmid Minipreps试剂盒抽提质粒，按试剂盒说明书进行操作。离心沉淀3mL细菌，弃上清，细菌沉淀用250L溶液重悬，加入250L溶液，轻轻地颠倒几次混匀，室温静置2min后，加入350L溶液，颠倒混匀，12,000r/m离心10min，将上清加入离子交换柱中，12,000r/m离心1min，弃去滤液，离子交换柱用洗液洗两次，然后用适量洗脱缓冲液将质粒洗脱，取部分重组质粒用EcoR I和Nde I进行酶切鉴定。反应液组成为：（共20L）10bufferH 2LEcoR / Nde I 1L重组质粒 4LddH2O 13L离心混匀后，于37反应2h，反应产物用1琼脂糖凝胶电泳进行检测。将含有FB基因的重组质粒命名为pSOC-FB，并送上海基康生物技术有限公司和上海博亚生物技术有限公司进行序列测定。2.2.2融合蛋白SOC-FB的表达用CaCl2法（2.2.1.8）制备E. coli BL-21（DE3）感受态细胞，用经测序鉴定的重组质粒pSOC-FB转化E. coli BL-21（DE3），用PCR方法特异性扩增FB条带以对重组子进行检测。将含有质粒pSOC-FB的大肠杆菌命名为BL-SOC-FB。挑取单个BL-SOC-FB菌落，接种于3 mL LA液体培养基中，37振摇培养过夜；取出菌液，置于4冰浴过夜。按1%比例接种LA液体培养基，37振摇培养。当OD600 = 0.5左右时，加入IPTG，使IPTG终浓度达到1.0 g/mL，然后分别在不同时间取样检测表达产物。2.2.3融合蛋白的SDS-PAGE检测将细菌悬液于6 000 r/m离心10 min，取沉淀。加入一定量的TE缓冲液，重悬细菌。然后用新芝超声破碎仪处理，20 khz，处理3 s，间歇10 s，重复10次。加入等体积2 X加样缓冲液后，将样品保存在4冰箱备用。蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）电泳按蛋白质技术手册中的方法进行（汪家政等，2000）。按以下比例配制15的分离胶10mL：A液： 4mLB液： 2.5mL ddH2O 3.5mL 10%过硫酸铵 0.05mLTEMED 0.005mL混匀后立即小心地将分离胶注入准备好的玻璃板间隙中，为堆积教留有足够的空间，在其顶层加去离子水以阻止空气中的氧气对凝胶聚合的抑制作用。聚合完成后倒掉覆盖液体，用去离子水洗凝胶上部数次，尽可能用滤纸吸干凝胶顶端的残余液体。配制5堆积胶4 mL： A液 0.67 mL C液 1.0 mL ddH2O 2.3 mL10%过硫酸铵 0.03mLTEMED 0.005mL待堆积胶聚合完成后，用去离子水冲洗梳孔以除去未聚合的丙烯酰胺，将灌制好的凝胶放入电泳槽，加入1电泳缓冲液，加2.2.2中制备的样品（样品在加样前煮沸2min后离心片刻），采用C-E电泳仪，电泳缓冲液采用Tris-甘氨酸系统。开始时的电压为8V/cm凝胶，待染料进入分离胶后，将电压增加到15V/cm凝胶，继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源，取下凝胶，用至少5倍体积的考马斯亮蓝染色液浸泡，放摇床上室温缓慢旋转34小时；换掉并回收染色液，用甲醇/醋酸溶液脱色直到背景无色为止。将脱色后的凝胶用VL凝胶成像系统存相，同时用凝胶成像系统BioID+程序对电泳结果进行扫描分析蛋白条带的含量。2.2.4融合蛋白的western blot分析SDS-PAGE完成后，将聚丙烯酰胺凝胶置于转移缓冲液中平衡30 min。将硝酸纤维素膜和滤纸切成和凝胶一样大小，置转移缓冲液中湿润5 min。按照以下顺序放置滤纸、凝胶和硝酸纤维素膜到阴极板上：湿润的厚滤纸、已经平衡的聚丙烯酰胺凝胶、湿润的硝酸纤维素膜、湿润的厚滤纸。盖好阳极电极板后，以100 V电压转移60 min。转移完毕后，取出硝酸纤维素膜和聚丙烯酰胺凝胶，将硝酸纤维素膜置于一有盖塑料盒内，加入封闭液，室温封闭过夜。用清洗缓冲液洗3次后，加入1：100倍稀释的猪抗FMDV阳性血清，37孵育1 h，用清洗缓冲液洗3次后，加入1：100倍稀释的辣根过氧化物酶（HRP）标记的羊抗猪IgG，室温孵育1 h。用清洗缓冲液洗硝酸纤维素膜3次，加底物，室温染色。待显色完全后，用蒸馏水冲洗硝酸纤维素膜，终止反应，于VL凝胶成像系统中进行存相。2.2.5 FB基因的T4噬菌体表面展示2.2.5.1FB基因与穿梭质粒pR的重组按常规方法将FB克隆至pR质粒的EcoR位点，分别转化TOP10感受态细胞，用PCR方法筛选连接方向正确的阳性克隆。2.2.5.2FB片段与T4-Z1的重组将重组质粒pR-FB转化E2感受态细胞，重组E2菌培养至OD值0.4-0.5，用缺陷型噬菌体T4-Z1感染，取5l点样于SC平皿，用灭菌牙签挑取单个噬菌斑，在SC平皿上点“梅花斑”，经过夜培养后刮下顶层琼脂，浸泡于磷酸盐缓冲液中。以浸泡液为模板，用PCR筛选阳性克隆。重组噬菌体命名为T4-Z1-FB，用M9S扩大培养，测定噬菌体滴度，按文献方法浓缩纯化。2.2.5.3 重组噬菌体T4-Z1-FB的检测取纯化的T4-Z1-FB用ELISA检测。3 结果与分析3.1重组表达质粒的鉴定本实验FB片段是以单一EcoR I酶切位点进行克隆的，所以在重组的质粒中有正向和反向两种插入方式。为了确定插入方向的正确与否，采用PCR方法，在检测插入片段的同时，又检测融合基因。因为SOC基因存在于pSOC质粒中EcoR酶切位点上游，FB基因插入pSOC质粒的EcoR I位点之后，FB和SOC基因融合，形成SOC-FB融合基因。因此用FB两端的一对特异性引物FBS1/FBS2检测FB的同时，还采用引物SOC-S/FBS2检测融合基因SOC-FB，只有用两对引物扩增在相应位置都出现目的条带，才可以初步确定为正确的克隆。在6个插入FB的阳性克隆中有5个是方向正确的（图1）。重组质粒分别用EcoR I和NdeI进行消化， EcoR I酶切的产物有两个条带，其中一条为260bp左右，另一条约为4800bp。NdeI酶切位点只存在于pSOC质粒中，所以用NdeI酶切的产物有单一的条带，均与预期的相符（图2）。图1 SOC-FB重组子的PCR筛选左：FB片段 PCR产物, 长度为260 bp；右：SOC-FB融合基因PCR产物，长度为500bp。Fig.1 PCR amplification of recombinant plasmidsM： DNA Marker DL2,000；1-6：1-6号克隆的第一次PCR鉴定; 7-12：1-6号克隆的第二次PCR鉴定1-6:First PCR amplification of 6 recombinant plasmids; 7-12:Second PCR amplification of 6 recombinant plasmids图2 重组质粒pSOC-FB的酶切鉴定Fig.2 Identification of recombinant plasmid pSOC-FBby restriction endonuclease digestion 1：EcoR I消化的重组质粒pSOC-FB，DNA条带大小分别为4 800 bp和260 bp；2：Nde I消化的重组质粒pSOC-FB，DNA条带大小约为5000 bp；M：DNA分子量标准。M:DNA marker；1: pSOC-FB digested with EcoRI； 2: pSOC-FB digested with Nde I3.2重组表达质粒的表达用经测序鉴定的重组质粒pSOC-FB转化E. coli BL-21（DE3）受体菌，挑取单个阳性菌落进行PCR鉴定。用1对特异性引物FBS1/FBS2转化菌中检测FB，从所有阳性菌落中扩增到预期大小的DNA片段。将pSOC-FB阳性转化菌命名为BL-SOC-FB。取BL-SOC-FB在LA液体培养基中培养至OD=0.5左右时，加入IPTG诱导融合蛋白SOC-FB的表达，用SDS-PAGE鉴定表达产物。SDS-PAGE结果表明（图3），IPTG能较好地诱导SOC-FB融合蛋白的表达，表达产物分子量约为19ku，与预期相符，表达量随诱导时间的增加而增加，诱导2小时能检测到SOC-FB融合蛋白，诱导4小时后表达量趋于稳定，SOC-FB融合蛋白最大表达量占细菌总蛋白的24.5%。图3 SOC-FB融合表达产物的SDS-PAGE检测M、蛋白质分子量标准；1：空质粒对照； 25：重组质粒pSOC-FB诱导2-5h的表达产物。Fig.2 SDS-PAGE analysis of the FB expression productsM: Protein molecular weight (standard) ;1: Expression products of E.coli containing pSOC; 2-5: Expression products of E.coli containing recombinant plasmidspSOC-FB induced 2h to 5h.3.3表达产物的western blot检测先经15%SDS-PAG电泳，然后转移到硝酸纤维素膜上，采用特异性FMD抗血清对SOC-FB蛋白进行了western blot检测。结果表明，在硝酸纤维素膜上检测到一条大小约19ku特异性条带（图4），说明表达的融合蛋白能与FMDV阳性血清发生特异性反应。 图4 表达产物的 Western blot分析Fig.4 Western blot analysis of expressed productsM：预染色蛋白质标准；1-3：表达产物M：Pristained protein standards ；1-3：Expressed products3.4 FB基因的T4噬菌体表面展示3.4.1重组噬菌体T4-FB的PCR鉴定采用PCR技术，用特异性引物D1/D2以不同的噬菌体梅花斑浸泡液为模板进行的PCR扩增结果，（图5）从图中可以看到2号、11号、14号、15号噬菌体梅花斑浸泡液成功地扩增出基因片断，PCR产物于1琼脂糖电泳时，可见大小约为250bq的DNA条代，为所需扩增的T4-FB片断。说明2号、11号、14号、15号噬菌体梅花斑浸泡液可用于噬菌体扩增培养。图5重组噬菌体T4-FB的PCR鉴定Fig.5Identification of recombinant phagocyte T4-FBM：DNA分子量标准；2,11,14,15：PCR产物M：DNAmarker ；2,11,14,15：PCR products3.4.2 重组噬菌体T4-FB的ELISA检测将重组噬菌体T4-FB作为包被抗原与12份口蹄疫阳性血清进行检测，结果OD450值(P)都在0.8以上，与阴性血清OD值(N)的比值都在2.1以上（表1）,说明重组噬菌体T4-FB与口蹄疫抗血清能够发生特异性结合。表1 重组噬菌体T4-FB的ELISA结果血清样品OD450P/N值血清样品OD450P/N值10.9744.171.2365.220.8973.781.2485.231.0214.391.0704.541.0374.3100.9814.151.2145.1111.1524.861.2215.1121.2805.5阴性血清0.2394 讨论与结论4.1 口蹄疫免疫活性串联片段FB与T4噬菌体SOC基因的融合表达目前已经证实，VP1携带引发宿主细胞对FMDV的免疫反应的关键性抗原表位，其中VP1的第140160和200213氨基酸残基是两个主要的B细胞表位，能诱导抗FMDV的中和抗体。在增强140160序列肽的应答方面，200213位序列有潜在的重要性。含有两种序列的肽与抗完整病毒的中和单克隆抗体比两者中任何一种单一的序列有更强的应答反应。另外，小分子抗原肽与大分子载体构成的融合蛋白能有效地诱发机体免疫应答。Dimarch用合成的O1K口蹄疫病毒VP1基因141158和200213段氨基酸组成的40个氨基酸肽，在其中间加上两个脯氨酸和一个丝氨酸使多肽拆成立体构型，大大提高了单肽段在豚鼠的应答水平，并提出了VP1羧基端氨基酸（半胱氨酸-半胱氨酸）在提高保护应答中的重要性。国内杨志军等将VP1的主要抗原表位基因串联后与半乳糖苷酶基因相连构成重组质粒在大肠杆菌中表达，用表达的融合蛋白制成疫苗免疫动物后能抵抗病毒的攻击。徐泉兴等将口蹄疫病毒VP1140-160、200-213、140-160三个基因片段用串联的方法连接到大肠杆菌质粒载体上，在大肠杆菌中表达，表达产物免疫豚鼠、兔子和猪后，均能获得保护性抗体的良好应答 6-7。小分子抗原肽与大分子载体结合，一方面是避免小分子抗原肽被降解，增加稳定性，另一方面是增加分子量，更有效地诱发机体产生免疫应答。在本研究室以前的研究中，将140160和200213氨基酸残基串联后，在各肽段之间加上脯氨酸和丝氨酸，将合成的该串联片段FA与硫氧还蛋白融合表达后，加上弗氏佐剂制成油乳剂疫苗免疫豚鼠后，可以诱导豚鼠产生高水平的中和抗体，提供对强毒攻击的保护8。大肠杆菌操作容易，遗传背景清楚，表达外源基因的周期较短，因而利用大肠杆菌表达外源基因是基因工程中常用的方法。作为T4噬菌体表达系统的一部分，大肠杆菌表达外源基因的目的，主要在于对融合基因表达产物的免疫原性等生物学特性进行研究。本研究中，将合成的该串联片段FB与T4噬菌体SOC基因重组为融合基因，置于T7启动子控制之下，经IPTG诱导，表达融合蛋白SOC-FB。Western blot试验结果表明，融合蛋白SOC-FB具有良好的免疫原性。4.2口蹄疫抗体检测方法的研究及应用在口蹄疫防制工作中，诊断是至关重要的一个环节。随着生物技术的迅速发展和仪器设备的不断更新换代，口蹄疫的检测技术也得到了空前的发展。目前已经建立了许多检测方法，包括血清学诊断技术、生物学试验和分子生物学诊断技术。血清学诊断技术中得到普遍承认、采用并且广泛应用的有：补体结合实验、间接血凝试验、琼脂扩散和中和实验。其中中和实验是OIE推荐的检测FMDV抗体的标准方法。但是该方法必须使用活病毒，普通实验室无法操作。而琼脂扩散由于灵敏度低正逐渐被淘汰。目前我国主要用兰州兽医所研制的间接血凝试剂盒进行FMDV抗体的检测。鉴于传统方法存在的问题，国外已广泛使用ELISA来取而代之，使得对FMDV抗体的检测更方便、快