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肿瘤分子生物学研究进展 关勇军中南大学肿瘤研究所 2006年2月 中国 1990 1992 与美国 1990 1991 恶性肿瘤调整死亡率 1 10万 比较 世界卫生组织 WHO 提出肿瘤防治目标 如能将现有的科学技术手段充分加以应用 则肿瘤的发生将因适当的预防措施而减少1 3 1 3的肿瘤患者将因早诊技术的恰当应用而发现于早期并得以根治 剩余1 3的患者将因适当治疗措施而延长生命并使生活质量得到改善 失控性生长 分化障碍 浸润与转移 肿瘤的基本生物学特征 Hanahan及Weinberg将肿瘤的发生发展归结为五大事件 阻止细胞增殖的信号失控 促进细胞分化的信号失调 细胞获得持续增殖的能力 逃避凋亡机制 具有侵袭能力及诱导血管生成 肿瘤共性问题 Uncontrolledgrowth Proliferation Toomuchbirth Apoptosis Toolessdeath 细胞周期正常运行需要足够的信号以及高度有序 其紊乱将导致细胞增殖 死亡改变 因此肿瘤是细胞周期病 诺贝尔科学奖告诉我们什么 LelandHartwell PaulNurse TimHunt 因发现了一类细胞周期调控基因而获此殊荣 这些基因中有一个被命名为 起始 start 它在细胞周期调控的第一步中起着关键作用 哈特韦尔还引入了 检测点 checkpoint 这一概念 这对理解细胞周期如何运行和运转颇有帮助 运用遗传学和分子生物学方法首次鉴定 克隆出细胞周期的关键调控子之CDK分子 周期素依赖性激酶 他还发现CDK在进化中高度保守 它可使其他蛋白质磷酸化 从而使细胞沿着细胞周期不断地进行分裂 第一个发现了周期素 cyclin 这是一类蛋白质 是CDK的调控分子 亨特在研究中发现 周期素在每次细胞分裂过程中均发生周期性的降解 后来证明这是细胞周期调控的一种普遍性的重要机制 2001年三位获奖者对细胞周期研究的主要贡献 2002年10月7日英国人悉尼 布雷诺尔 美国人罗伯特 霍维茨和英国人约翰 苏尔斯顿 因在器官发育的遗传调控和细胞程序性死亡方面的研究荣获诺贝尔生理与医学奖 细胞周期在细胞增殖 凋亡中的调控作用 使其在维护基因组稳定性中具有重要意义 DNARepair CellCycle Apoptosis中心环节checkpoints 癌变过程中侵袭与转移驱动机制不断加强 原位肿瘤 侵袭性肿瘤 转移瘤 癌变过程中侵袭与转移监控机制不断减弱 肿瘤分子生物学 从分子水平研究肿瘤发生发展规律的学科 分子肿瘤学 肿瘤发病的分子基础肿瘤诊治的分子基础 一 肿瘤发病的分子基础 肿瘤是一类全身性疾病 涉及多种因素 多个阶段 多个基因的病理过程 多因素 化学因素 物理因素 生物因素遗传因素多阶段 激发 促进 进展和转移 多基因 瘤基因 抑瘤基因 损伤修复基因等 一 环境因素与遗传因素 1 理化因素 结合破坏生物大分子 2 生物因素 细菌 如HP 病毒 RNA肿瘤病毒DNA肿瘤病毒 3 遗传因素 遗传缺陷 如胚细胞突变 基因多态性 如SNP 常见的遗传性肿瘤和肿瘤综合症名称基因染色体定位常见肿瘤病理学视网膜细胞瘤Rb13q14肉瘤Wilm瘤WT 111p13胚胎肾细胞瘤乳腺 卵巢综合征BRCA117q12乳腺癌 卵巢癌家族性腺瘤样肠息肉APC5q21结直肠癌遗传性非息肉性结肠癌MLH13p21结直肠癌Li Fraumeni综合征p5317p13肉瘤 乳腺癌 脑瘤Fanconi贫血综合征FAA9q22 3急性单核细胞白血病Bloom综合征BLM15q26 1造血系统肿瘤着色性干皮病XPA GM皮肤癌 二 癌变的二阶段与多阶段学说 Initiation promotionmodel DMBA Vehiclecontrol 6months DMBA Crotonoil 6months 0tumours Multipletumours Modeloriginallysetupdosingmouseskin DMBA Crotonoil 6months 0tumours 结肠癌多阶段 COX 2EGFR TGF b APC K RAS PRL3 Normalepithelium Tubularadenoma Villousadenoma Adenocarcinoma Metastasis P53TGFb RII 18qLOH SMAD2 SMAD4 DCC MicrosatelliteInstability MLH1 MSH2 PMS2 PMS1 Multi StepCarcinogenesisofColonCancer rasMetC erbB2 rasp53HLA erbB2Mdm2EGFRATMMetAKT2 p16p53APCNm23RB Overexpression Mutation Amplification Deletion 肿瘤相关基因变异与肠型胃癌发生 发展不同阶段的关系 Multiplegeneticalterationsinvolvedinhumangastriccarcinogenesis ras met ras p53 p53 erbB2 akt2 met EGFR APC nm23 p16 mdm2 OverexpressionDownregulation Pointmutation Amplification Deletion Accumulationofmultiplegenechangesinhumangastriccarcinogenesis initiation promotion progression erbB2 Rb Heterogenicity Susceptibility 020406080100 Age yrs 三 癌基因与抑癌基因 1 癌基因 oncogene 存在于病毒或细胞基因组中的一类在一定条件下能使正常细胞发生恶性转化的核苷酸序列 概念 病毒癌基因 RNA病毒癌基因DNA病毒癌基因 细胞癌基因 原癌基因 生命必需基因 活化的癌基因 活化机制突变 H ras code12GT点突变 膀胱癌 重排 Ab1易位 t 9 22 q34 q11 费城染色体 CML 扩增 双拷贝超拷贝 表达倍增 活化 乳腺癌 均染区 HSR 双微体 DMS 低甲基化 CpG中的C发生5 甲基化修饰表达 分类及功能 2 抑癌基因 tumorsuppressorgene 抑癌基因失活机制点突变50 以上肿瘤存在p53基因点突变 纯合性丢失和杂合性丢失 LOH 与癌基因产物结合HPVE6 E7蛋白分别与p53和Rb结合 使之失活高甲基化p16基因启动子区域高甲基化 等位基因丢失 四 肿瘤易感基因 susceptibilitygene 通过遗传获得的在细胞癌变中起关键作用 对环境因素敏感高 有利于癌变克隆选择和生长能导致遗传性肿瘤和肿瘤综合征的突变基因符合二次打击学说的抑癌基因均为肿瘤遗传易感基因 zygote somaticline C germline A B SecondHit Somatic FirstHit Inherited CellsWithMalignantPotential Knudson s的二次打击学说 TwoHitHypothesis 肿瘤易感基因 五 DNA修复基因 DNArepairgene 编码DNA修复酶或相关蛋白质的基因称DNA修复基因 符合二次打击学说的DNA修复基因亦称遗传易感基因 肿瘤易感基因 六 单核苷酸多态性 singlenucleotidepolymorphism SNP 与遗传易感性 基因组内某一特定核苷酸位置上存在的突变 插入 缺失每一基因上存在多态性的人群频率大约在1 即在整个基因组中大约每1 000 10 000个碱基中存在一个 人类长期进化过程中环境选择的结果 成为第三代分子遗传标记 具有标记密度高 稳定 易于分型检测的优势 为人种之间 个体之间差异的遗传基础之一 已确定为多种遗传性相关疾病的易感物质基础 成为患病危险程度评价 建立有效的预警系统的新的方法 单核苷酸多态性 SNP 特点 DNA修复基因SNP与肿瘤易感 致癌物代谢酶基因SNP与肿瘤易感 二 肿瘤诊治的分子基础 传统诊断以细胞形态学为基础 细胞 组织病理学以生物化学为基础 生化检测分子诊断应用细胞及分子生物学的理论和技术方法 对人类肿瘤发生 发展各个阶段的形态学变化 从传统的病理学概念深入到分子或基因水平加以认识 包括肿瘤易感基因的检测 肿瘤分类 早期诊断 预后判断 个体治疗方案的制定等 基因肿瘤类型扩增率c ErbB2乳腺癌16 33胃 食管癌5 13卵巢癌20 33胆囊癌45 58肝癌25 45c Myc乳腺癌25 30结 直肠癌3 6胆囊癌40 60肺鳞癌15 25肝癌25 42N Myc肺腺癌2 11 基因肿瘤类型扩增率K Ras乳腺癌3 10胰腺癌45卵巢癌4 8胆囊癌30 61Int2乳腺癌4 23N Ras肝癌24Mdm2肝癌15 26c Fos肝癌39K Sam胃癌21Met胃癌19 几种常见肿瘤癌基因的扩增率 人类肿瘤中Ras癌基因点突变频率Ras基因类型肿瘤类型突变频率 Ras基因类型肿瘤类型突变频 K Ras肺腺癌30H Ras甲状腺癌60K Ras结肠癌50N Ras黑色素瘤20K Ras胰腺癌90N Ras精原细胞瘤40K Ras胆管腺癌90N Ras急性髓白血病30H Ras宫颈癌25 人类肿瘤p53基因突变热点和频率肿瘤类型突变频率突变热点 编码子 肿瘤类型突变频率突变热点 编码子 肺癌56157 248 273前列腺癌30不确定结肠癌50175 245 248 273肝细胞癌45249食管癌45不确定胶质瘤25175 248卵巢癌44273乳腺癌22175 248 273胰腺癌44273子宫内膜癌22248皮肤癌44248 278甲状腺癌13248 273胃癌41不确定白血病12175 248头颈部鳞癌37248宫颈癌7273膀胱癌34280软组织肉瘤31不确定 一 肿瘤分子诊断的发展方向 1 筛选和确定敏感性高 特异性强肿瘤分子标志物 尤其要重视癌前和早期癌变的分子标志物 2 寻找无创或微创方法进行肿瘤早期诊断和风险人群筛查 3 联合多种肿瘤分子标志物 结合传统 细胞病理学 生化酶学 诊断 动态变量分析进行诊断 4 结合一般分子生物学方法和高通量分析 基因芯片 组织微阵列 蛋白质组学 技术确定新的分子标记 开展分子诊断 RethinkingBREASTCANCERNewdetectiontechniquesandtreatmentsareExciting andconfusing Aguidetosavinglives RethinkingBREASTCANCERNewdetectiontechniquesandtreatmentsareExciting andconfusing Aguidetosavinglives 肿瘤基因组学及癌症基因组解剖计划 CGAP 的进展为确定肿瘤标志物 肿瘤的分子分型 分子分期 分子诊断和分子预后提供了重要的实验依据 高通量技术的发展为推进肿瘤基因组学及CGAP的进展提供了强有力的根据 CANCERRESEARCH62 1184 1190 February15 2002MolecularClassificationofHeadandNckSquamousCellCarcinomaUsingcDNAMicroarraysUsingofcDNAmicroarrayscontaining9216clonestomeasureglobalpatternsofgeneexpression identified375genes whichdividepatientswithheadandnecktumorsintotwoclinicallydistinctsubgroup 以基因芯片技术为基础的癌变多阶段基因表达谱的确定 CancerProteomics 生物信息学技术与蛋白质组学技术结合 对癌症相关蛋白质进行筛选和鉴定 并对其功能进行研究 为肿瘤标志物的确定提供了新的方法 Proteomeanalysisofesophagealcancer 以二维电泳技术为基础的肿瘤蛋白表达谱的确定 肿瘤应用肿瘤蛋白质组学确定的新的肿瘤标志物乳腺癌PCNA HSP90 pHSP60 NMP66 Cytokeratin CK 8 15 18等膀胱癌CK18 CK20 PA FABP galectin 7 MRP 8 MRP14 Stratifin Psoriasin等前列腺癌PCNA Calreticulin pHSP60 HSP90 OP18 EF2 SOD IGFBP2 HSP27等卵巢癌PCNA OP18 Calreticulin HSP90 pHSP60 FK506结合蛋白 RhoGDI glyoxalase 等结直肠癌CalgranulinA S100A8 CalgranulinB S100A9 Calgizzarin S100A11 等白血病OP18 P19 nm23 H1 clusterin等胰癌HIP PAP 1肺腺癌TAO1 TAO2 CancerProteomics 二 肿瘤治疗的分子策略 1 针对癌基因的活化抑制信号转导途径 酪氨酸激酶抑制剂 RGI13022 AG957 PD153035等 丝氨酸 苏氨酸激酶抑制剂阻止癌蛋白的成熟 如L744 832 SCH44342 BZA 513阻止基因转录 翻译 反义技术 反义核酸技术 体外合成反义 脱氧 寡核苷酸 12 20bp的AsODN 重组能表达反义RNA质粒或病毒载体 阻断目的基因蛋白表达 亦可针对某些癌基因产物重组单链可变区抗体基因对抗其活性 核酶技术 核酶 一种具有剪切能力的RNA可形成酶 底物复合体 与底物碱基特异性配对可设计能结合某些作用靶点并以其酶活性进行剪切的核酶序列 实现阻断目的基因表达的反义治疗 缺点分子量过大 100个bp左右 不能区别正常和突变的癌基因序列 RNA干扰技术 RNA干扰现象是一种存在于植物和动物体内的基因沉寂现象 RNaseIII 被认为是生物体进化中获得的一种自然保护机制 mRNA水平干扰靶基因表达 优点 效价高 类似酶促方式 非化学计量效应 少量dsRNA能清除大量mRNA 干扰效应具有可遗传扩散性 2 针对抑癌基因的失活和修复机制缺陷用正常基因置换有缺陷的基因 关键在转基因方法和载体选择 野生型抑癌基因 p53 p16 Rb等 或DNA修复基因导入肿瘤细胞 重建失活的抑癌基因功能 恢复正常生长表型 诱导细胞凋亡 恢复细胞的DNA修复功能 3 针对癌细胞的转移抗转移基因的置换 nm23 TIMP等 抗血管生成治疗 抑制内皮细胞的迁移和粘附 基质金属蛋白酶 MMPs 抑制剂 细胞粘附分子抑制剂 重组PEX MMP2 C端片段 基因导入 竞争抑制MMP与整合素av 3结合 抑制血管形成和生长 化学合成抑制剂 Batinastatmarimastat 与MMP底物竞争 期临床 RGD序列小肽 整合素av 3拮抗剂临床I II期 Vitaxin 人源化av 3抗体完成I期临床试验 抑制内皮细胞的活化和增殖 重组TSP 1基因 抑制内皮的活化 Angiostain endostatin基因 抑制内皮增殖 促内皮细胞凋亡 内源性抑制物 TNP 470 烟曲毒素的合成衍生物 抑制内皮增殖 迁移 进入临床 期化学合成物 直接针对肿瘤血管靶分子 人源化VEGF抗体 抑制VEGF与受体结合完成I II期临床试验 SU6668 SUS416 抑制VEGF bFGF和PDGF受体酪氨酸酶活性临床试验 以受体为靶 Asprinin NS 398 抑制COX cy