《豆芽中4-氯苯氧乙酸钠的测定 高效液相色谱法》 编制说明

吉林省食品安全地方标准豆芽中 4-氯苯氧乙酸钠的测定 高效液相色谱法编制说明(送审稿)吉林农业大学2013 年 3 月 25 日DBS036ICS：标准分类号：备案号：2目  录一、 研究背景、制定标准的必要性和意义 31、研究背景32、制定标准的必要性和意义3二、 工作简况   51、前期工作52、实验室间验证工作6三、 研究路线、与现有标准的关系 6四、 主要试验的研究论证报告和技术性能分析 61、试剂和材料  62、样品的前处理   73、仪器分析条件 74、液相色谱法线性范围 105、方法检出限 116、方法的回收率 117、方法的精密度 12五、方法验证     131、验证方法  132、验证结论   163、实际样品测定 16六、征求意见情况及重大意见分歧处理结果 17七、实施标准的建议   173一、 研究背景、制定标准的必要性和意义1、研究背景豆芽是我们日常生活中的最佳食品之一，豆 芽 又 名 巧 芽 、 豆 芽 菜 、 银 芽 、 大 豆 芽 。 豆 芽 是 各种 谷 类 、 豆 类 、 树 类 的 种 子 培 育 出 可 以 食 用 的 “芽 菜 ”， 也 称 “活 体 蔬 菜 ”。 是我们日常生活中不可缺少的蔬菜制品之一。豆芽被当今世界称之为“天然和健康”食物之一。据报导，豆芽在国外非常流行，欧洲、美洲、亚洲的许多国家和港澳台地区都有豆芽的专门制造厂。人 吃 豆 芽 能 减 少 体 内 乳酸 堆 积 ， 消 除 疲 劳 。 近 年 来 发 现 豆 芽 中 含 有 一 种 干 扰 素 诱 生 剂 ， 能 诱 生 干 扰 素 ， 增 加 体 内 抗 生素 ， 增 加 体 内 抗 病 毒 、 抗 癌 肿 的 能 力 ， 所 以 常吃豆类食物还能起到防治冠心病、高血压、动脉粥样硬化等疾病的作用。因此，豆芽是我们尤其是素食者喜欢的物美价廉食品，更应该注重豆芽食物的生产。4-氯苯氧乙酸钠，别名为 4-对 氯 苯 氧 乙 酸 钠 ，俗称促生灵，蕃茄灵，防落素，是一种人工合成的植物生长调节剂，也称作豆 芽 的 生 长 调 节 剂 ， 广 泛 用 于 培 育 无 根 黄 豆 芽 和 无 根 绿 豆 芽 ， 既 可 提高 豆 芽 产 量 和 质 量 ， 又 可 使 所 生 豆 芽 肥 嫩 、 粗 壮 、 爽 口 ， 但 当 浓 度 高 时 可 使 豆 芽 色 泽 灰 暗 ， 根部 发 红 ， 皮 层 发 泡 ， 应 立 即 降 低 溶 液 的 浓 度 。 尽 管 我国已将其正式作为允许使用的食品添加剂而列入国家标准，早在 1996 年就有规定其使 用 范 围 及 使 用 量 要 按 我 国 食 品 添 加 剂 使 用 卫 生 标 准 （ GB2760 1996） 要 求 ： 用 于 豆 芽 中 的 残 留 量 应 小 于 1.0 mg/kg。 但加工豆芽的企业大都是小作坊、小商贩，而且有些商贩为降低成本，提高利润，在豆芽生产过程中非法并大量加入 4-氯苯氧乙酸钠等促生长剂，使得 4-氯苯氧乙酸钠的加入量得不到控制。少量的 4-氯苯氧乙酸钠不会对人体带来伤害，但经动物毒理试验发现该物质达到一定剂量，可显示一定的毒性作用，可使大鼠致突变，还可表现胚胎致畸，因此人体超量摄入 4-氯苯氧乙酸钠后，将会对人体产生一定的危害，如使儿童发育早熟、女性生理发生改变等；同样也对人体有致癌、致畸的作用；即使有些危害不会在短时间内出现，但是长久沉积必然会给健康带来不利影响。迄止目前为止，国内尚无豆芽的生产标准及相关的行业规范，豆芽的生产仍处于较混乱的状态。2、制定标准的必要性和意义（1）维护消费者切身利益的需要4豆芽是老百姓餐桌上最普通不过的蔬菜。其品种繁多、营养全面、风味独特、清香脆嫩，深受人们喜爱。比起发芽前的豆子，豆芽不仅外观发生了改变，而且营养价值和营养利用率也都大大增加，如黄 豆 中 含 有 的 不 能 被 人 体 吸 收 ， 又 易 引 起 腹 胀 的 棉 子 糖 等 物 质 ， 在 发 芽 过 程 中 急 剧 下 降 乃 至 全部 消 失 ， 这 就 避 免 了 吃 黄 豆 后 腹 胀 现 象 的 发 生 ； 另 外 黄 豆 在 发 芽 过 程 中 ， 由 于 酶 的 作 用 ， 更 多 的钙 、 磷 、 铁 、 锌 等 矿 物 质 元 素 被 释 放 出 来 ， 这 又 增 加 了 矿 物 质 的 利 用 率 ； 绿豆芽中含有丰富的维生素C ，可以治疗坏血病，是很好的养颜圣品，具有清除血管壁中胆固醇和脂肪的堆积、防止心血管病变的作用；绿豆芽中还含有核黄素，对口腔溃疡的人很适合食用。豆芽富含膳食纤维，是便秘患者的健康蔬菜，有预防消化道癌症(食道癌、胃癌、直肠癌)的功效；豆芽的热量很低，而水分和纤维素含量很高，常吃豆芽，可以达到减肥的目的。现在市场上所售的豆芽，没有标准的企业生产，只是小作坊、小商贩个体生产经营，而且有些商贩为获取高额利润，力求最低成本，因此在豆芽生产过程中，超比例加入 4-氯苯氧乙酸钠等生长调节剂，造成 4-氯苯氧乙酸钠的含量得不到控制，远远超出国家规定上限，为维护消费者利益，保障豆芽产品的质量安全，有必要建立快速有效的豆芽中 4-氯苯氧乙酸钠的检测方法。(2) 满足国家食品安全监管的需要食品安全监管部门是国家保障食品安全的执法部门，为进一步提高检测效率，能够及时应对食品安全突发事件，食品安全监管部门需对豆芽进行监督抽检和风险监测，从而维护广大消费者的利益，保护消费者身体健康，为执法机构的监督提供科学理论依据和技术支撑，本标准起草工作组通过搜集国内外相关法律法规以及检测方法，经过实验摸索，完成了标准的制定工作，满足食品监管的需要。(3) 国家标准完善和补充的需要目前，国际标准逐步进行调整和补充完善，在 2007 年版的食品添加剂使用卫生标准规定食品豆芽中最大残留量 0.1 mg/kg，比 GB2760-1990 规定数值缩小 10 倍，可见食品安全的重要性；在 2011年 6 月 20 日食品安全国家标准 食品添加剂使用标准（GB2760-2011）实施前，豆芽中一直允许使5用 4-氯苯氧乙酸钠作为食品加工的促生长剂，而且国家标准、行业标准中没有对豆芽中检测 4-氯苯氧乙酸钠残留量的检测方法，因此针对豆芽含量的标准要求，亟需制定规范的操作简单易行、快速准确、针对性强、检测效果好的适合风险监测、监督抽查等大量样品的检测方法。二、工作简况任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22/036-2012起草单位：吉林农业大学起草人基本情况：姓名 性别 年龄 职称 工作分工李泽鸿 女 47 副教授项目负责人，文本编写、实验方案设计刘继阳 男 27 在读研究生 验证方案设计及验证王桂芹 女 43 教授 定性确认于新海 男 27 在读研究生 试样检测孙  炀 男 37 副教授 验证方案设计及验证刘  莹 女 25 在读研究生 数据统计史  飞 男 28 在读研究生 验证方案设计及验证张文慧 女 36 讲师 资料收集、查新张继元 女 25 在读研究生 数据统计刘树英 女 39 副教授 定性确认汪树理 男 38 实验师 资料收集、查新李昌昊 男 23 本科生 数据统计陈  屏 女 37 讲师 仪器实验条件设计刘洪章 男 53 教授 方案与文本审阅陶英楠 男 29 在读研究生 实验设计1、前期工作6查阅相关最新资料和文献，结合我国国情和国内实验室的特点，研制了一种快速检测方法高效液相色谱法测定豆芽中的4-氯苯氧乙酸钠，建立了一个灵敏度高、选择性好、能为我省大多数的检测机构所使用的方法。同时对确定的检测方法进行检出限、回收率、精密度等试验，确保该方法的切实可行。收集的标准及相关文献如下：1 GB/T 5009.1 食品卫生标准检验方法 理化部分 总则2 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法3 GB 22556-2008 豆芽卫生标准4 HG 2302-1992 食品添加剂 4-氯苯氧乙酸钠  5 高效液相色谱法测定豆芽中4-氯苯氧乙酸钠残留量J.中华预防医学杂志，2002（1）：44-456 DB33/T 625.3-2007 无公害豆芽 第3部分：6-苄基腺嘌呤残留量和4-氯苯氧乙酸钠残留量的测定 2、实验室间验证工作邀请长春市产品质量监督检验院、农业部参茸质检中心、吉林省进出口检验（检疫）局等单位进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、最低检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定豆芽中 4-氯苯氧乙酸钠的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。三、研究路线、制标原则与现有标准的关系本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T  1.1-2009标准化工作导则 第一部分：标准的结构和编写和GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求编写的。课题组经过大量查阅资料，制定本标准可作为广大生产企业、质检机构、第三方检验机构及其他相关单位对豆芽及其制品中4- 氯苯氧乙酸钠的检测提供快速可靠的方法。四、主要实验的研究论证报告和技术特性71、试剂和材料除特殊说明外，本标准所用试剂均为分析纯，水为三级水，色谱用水为一级水，符合GB/T 6682中用水规定。甲醇为色谱纯，4-氯苯氧乙酸纯度达99%以上。2、样品的前处理由于 4-氯苯氧乙酸钠易溶于水，且 在 碱 性 条 件 下 能 稳 定 存 在 。 因 此 为 选 择 合 适 的 提 取 液 ， 比较 了 氢 氧 化 钠 、 碳 酸 钠 、 碳 酸 氢 钠 的 水 溶 液 等 试 剂 对 4-氯苯氧乙酸钠的提取效率，结 果 得 出 以 氢氧 化 钠 提 取 效 率 最 高 。 4-氯苯氧乙酸钠再经酸 化 后 生 成 对 4-氯 苯 氧 乙 酸 ， 其 易 溶 于 乙 醚 、 乙 醇 等有 机 溶 剂 中 ， 可 以 利 用 有 机 溶 剂 进 行 萃 取 ， 比 较 了 乙 醚 、 乙 醇 、 丙 酮 、 乙 酸 乙 酯 对 4-氯苯氧乙酸的萃取率，结果表明用乙醚萃取效果最佳。3、仪器分析条件3.1 色谱的选择4-氯苯氧乙酸在 甲 醇 和 乙 醚 等 有 机 试 剂 中 有 较 好 的 溶 解 度 ， 用 这 些 试 剂 提 取 再 配 合 液 相 色 谱仪 ， 可 大 大 简 化 前 处 理 过 程 ， 缩 短 前 处 理 时 间 ， 且 高 效 液 相 色 谱 仪 应用较为普遍，其易于推广应用，实用性强。3.2 色谱的优化实验过程中通过对色谱柱及仪器条件规定的参数要求进行了多次调整，以使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态，获得满意的分离效果，达到回收率的要求。经过多次的试验摸索，确定实验参数。3.2.1 色谱柱的选择借鉴文献我们选用ZORBAX SB C18色谱柱，该色谱柱可在偏酸性pH 范围(pH 18) 内提供良好的峰形，实验证明该色谱柱适合分离豆芽中的4-氯苯氧乙酸， 峰形完全能满足检测要求且与干扰物质进行有效分离。3.2.2 色谱条件的选择8通过对 0.5 mg/L 的 4-氯苯氧乙酸的甲醇溶液并以甲醇为参比进行 200400 nm 范围的紫外扫描，结果发现 4-氯苯氧乙酸在 228 nm 处有最大吸收，因此紫外吸收波长确定为 228 nm。流动相的选择随色谱柱和分离对象的不同而不同，由于高线度、低酸性的硅胶对酸性，碱性及中性化合物具有优异的峰形，保证了在酸性流动相条件下的稳定性、长寿命及重现性，从而使得 SB 柱成为在低 pH 开发方法的首选色谱柱。 ZORBAX SB C18 柱与所有常用的流动相兼容，包括水含量很高的流动相。通常选用不同比例的甲醇-水（盐溶液）或乙腈 -水（盐溶液）作等度或梯度洗脱，盐溶液可以改变流动相的异性。因甲醇与盐溶液的配比不同，直接影响到 4-氯苯氧乙酸的保留时间，100 %甲醇为流动相时，4-氯苯氧乙酸的保留时间太短， 4-氯苯氧乙酸与样品中的组分无法完全分离，但甲醇浓度太低（<40  %）时，保留时间又太长，从而延长了分析时间。通过调整甲醇和磷酸盐缓冲液的配比，最终确定甲醇：磷酸盐缓冲液=40：60 为流动相时，即保证了样品与目标物的完全分离，且峰形良好，又保证了有效的分析时间（4-氯苯氧乙酸的保留时间为 12.963min 左右）。因此最终确定仪器的工作条件为：a）色谱柱：ZORBAX SB C 18柱（  4.6mm250mm 5m）或等效柱 。b）检测波长：228nm。c) 流动相：甲醇+0.01mol/L 磷酸盐缓冲液=40+60，经 0.45 m 微孔滤膜过滤。d）流速：1.0mL/min。e）柱温：30。f）进样量：10 L。9图 1  4-氯苯氧乙酸标准品色谱图图 2 不含 4-氯苯氧乙酸钠的豆芽色谱图图 3  含有 4 氯苯氧乙酸钠的豆芽色谱图10图 4 加标绿豆芽中 4-氯苯氧乙酸的色谱图图 5 加标黄豆芽中 4-氯苯氧乙酸的色谱图图 6 加标黑豆芽中 4-氯苯氧乙酸的色谱图4、液相色谱法线性范围4-氯苯氧乙酸标准系列工作液浓度分别为 0.20 mg/L、0.50 mg/L 、1.00 mg/L、2.00 mg/L、 4.00mg/L，将各浓度按照建立的方法依次进样后，检测得出一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线得到直线方程为 Y=83.564X + 5.6598，相关系数 r = 0.9994。可见在 0.204.00 mg/L 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可对其进行稀释。图 7 为标准曲线图。11y = 83.564x + 5.6598R2 = 0.99940501001502002503003504000 1 2 3 4 5浓 度 (mg/L)峰面积(mAV.s)图 7  4-氯苯氧乙酸标准曲线图5、方法检出限根据 GB/T 5009.1-2003，中 A .2 色谱法中的计算方法。检出限=S/bb标准曲线回归方程中的斜率。S 仪器噪声的 3 倍。确认试样检出限为 0.01 mg/kg。  6、方法的回收率根据GB/T 5009.1-2003，分别以黄豆芽和绿豆芽为加标对象，分别加入0.20 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg三个低、中、高水平的4- 氯苯氧乙酸标准溶液，按照送审稿的样品处理方法及相同的色谱条件，进行回收率的测定，每个样品重复6次，计算出每个添加水平的回收率，方法回收率结果见表1。 表1 样品含量测定及回收率数据样品编号 本底值(mg/kg) 加入量(mg/kg) 实测值(mg/kg) 回收率 (%) 平均回收率 (%)0.203 101.500.200 100.000.198 99.000.191 95.500.198 99.000.200.197 98.5098.92黄豆芽 -1.00 1.05 105.00 100.83121.08 108.001.00 100.000.98 98.000.91 91.001.03 103.003.98 99.504.02 100.503.94 98.504.05 101.254.07 101.754.004.05 101.25100.380.197 98.500.192 96.000.196 98.000.207 103.500.204 102.000.200.199 99.5099.581.05 105.001.03 103.001.05 105.000.96 96.001.02 102.001.000.98 98.00101.504.10 102.504.06 101.504.03 100.753.95 98.753.99 99.75绿豆芽 -4.004.01 100.25100.587、方法的精密度吉林农业大学生命科学学院实验室内精密度分别见表 2、3、4。从实验结果可以看到相对标准偏差值均小于 4.0%，标准偏差均小于 0.05。表 2 实验室内黄豆芽精密度   (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.203 1.00 4.012 0.205 1.04 3.993 0.211 0.99 4.014 0.198 0.96 3.985 0.199 1.02 3.91136 0.195 0.93 4.07平均值 0.202 0.99 3.005标准偏差(S) 0.005 0.037 0.048相对标准偏差(%) 2.5 3.7 1.6表 3 实验室内绿豆芽精密度   (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.200 1.02 4.042 0.201 1.03 4.003 0.195 1.07 4.014 0.199 1.04 3.965 0.203 1.00 3.986 0.192 0.97 4.03平均值 0.198 1.022 4.003标准偏差(S) 0.004 0.031 0.027相对标准偏差(%) 2.0 3.0 0.7表4  实验室内黑豆芽精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.189 1.02 4.032 0.201 1.00 4.003 0.203 1.04 4.014 0.198 1.03 4.025 0.194 1.07 3.976 0.199 1.07 3.99平均值 0.197 1.038  4.003标准偏差(S) 0.005 0.025 0.020相对标准偏差(%) 2.5 2.4 0.5五、方法验证  1、验证方法由课题组统一制备样品，分别以黄豆芽、绿豆芽和黑豆芽为加标对象，分别加入低中高（0.20 mg/kg、1.0 mg/kg、4.0 mg/kg）三个水平的 4-氯苯氧乙酸标准溶液，同时发送到 3 个参加方法验证的实验室进行验证，每个实验室均对每个样品测定 6 次，结果见表 513。表5  实验室1 # 内黄豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.203 1.02 4.032 0.200 1.00 4.003 0.215 1.05 4.00144 0.200 1.00 3.975 0.211 0.99 3.996 0.207 1.07 3.95平均值 0.206 1.022 3.99标准偏差(S) 0.006 0.029  0.025相对标准偏差(%) 2.9 2.8 0.6表6  实验室1 # 内绿豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.201 1.02 4.042 0.205 1.00 4.003 0.200 1.05 4.034 0.208 1.00 3.995 0.204 0.98 3.986 0.199 1.02 4.02平均值 0.203  1.012 4.01标准偏差(S) 0.003  0.022  0.022相对标准偏差(%) 1.5 2.2 0.5表7  实验室1 # 内黑豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.197 1.02 4.002 0.193 1.00 4.043 0.197 0.97 3.984 0.203 0.99 3.975 0.207 1.02 3.996 0.195 1.06 3.99平均值 0.199 1.01 3.995标准偏差(S) 0.005 0.028 0.022相对标准偏差(%) 2.5 2.8 0.55表8  实验室2 # 内黄豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.201 1.02 4.022 0.208 1.07 4.003 0.204 1.00 4.044 0.211 1.06 4.055 0.204 0.97 3.946 0.207 0.99 3.98平均值 0.206 1.018 4.005标准偏差(S) 0.003 0.036 0.037相对标准偏差(%) 1.5 3.5 0.9表9  实验室2 # 内绿豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)15重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.203 1.04 4.012 0.198 1.00 4.033 0.195 1.05 4.004 0.201 1.02 3.995 0.204 0.99 3.976 0.196 0.94 4.02平均值 0.200 1.007 4.003标准偏差(S) 0.003 0.036 0.020相对标准偏差(%) 1.5 3.6 0.5表10  实验室2 # 内黑豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.197 1.04 4.012 0.192 1.00 4.003 0.199 1.00 4.024 0.204 0.97 3.975 0.211 0.99 3.986 0.203 0.90 3.99平均值 0.201 0.983 3.995标准偏差(S) 0.006 0.043 0.017相对标准偏差(%) 3.0 4.4 0.3表11  实验室3 # 内黄豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.200 1.04 4.012 0.198 1.00 4.003 0.196 0.97 4.034 0.201 0.99 3.985 0.204 1.05 3.976 0.199 1.00 3.99平均值 0.200 1.008  3.997标准偏差(S) 0.003 0.028 0.020相对标准偏差(%) 1.5 2.8 0.5表12  实验室3 # 内绿豆芽中4- 氯苯氧乙酸钠的精密度 (mg/kg)重复次数 水平 1 水平 2 水平 31 0.198 1.04 4.012 0.189 1.00 4.033 0.194 0.98 4.054 0.201 0.99 3.985 0.207 0.97 3.966 0.199 1.00 3.99平均值 0.198 0.997 &