《乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定》 编制说明

1乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定（征求意见稿）编 制 说 明国家农业深加工产品质量监督检验中心(吉林省产品质量监督检验院)二一二年十二月2目  录一、制定标准的必要性和意义 3二、工作简况 3三、研究路线，与现有标准的关系 4四、主要试验的研究论证报告和技术性能分析 41、标准的名称   42、标准的范围   43、方法原理     44、前处理条件   45、仪器分析条件   46、气相色谱-质谱法线性范围 67、方法检出限   78、方法回收率   79、方法精密度   8五、方法验证   10六、验证结论   11七、实际样品验证   113一、制定标准的必要性和意义环己基氨基磺酸钠俗称甜蜜素，分子式 C6H11NHSO3Na，分子量 201.22 (另有资料称 201.21)，工业上是由氨基磺酸与环己胺及氢氧化钠反应而成，其甜度是蔗糖的 3040 倍；如果与蔗糖和有机酸配合使用，甜度可达 100 倍以上。环己基氨基磺酸钠是一种广泛应用于食品工业的添加剂。但是，现代医学证据表明，长期摄入过量的环己基氨基磺酸钠，可能会对人体的肝脏和神经系统造成危害，特别是对代谢排毒的能力较弱的老人、孕妇、小孩危害更明显。1969 年美国国家科学院研究委员会收到有关甜蜜素：糖精=10:1 混合物可致膀胱癌的动物实验证据，不久后美国食品与药物管理局即发出了全面禁止使用的命令，英、日、加拿大等国随后也禁用。这些禁用令沿用至今，使得环己基氨基磺酸钠的使用安全性问题日益突出。牛乳是老百姓餐桌上常见食品，各类含乳制品更是种类繁多，消费群体几乎囊获了从新生儿到老年人的所有年龄段适宜人群。我国现阶段允许部分含乳制品中使用环己基氨基磺酸钠作为添加剂，但严格规定使用限量；在乳粉及纯液体牛乳中不允许使用环己基氨基磺酸钠。但是，在市场上已经发现不法企业企图通过非法添加了环己基氨基磺酸钠的手段达到改善产品口感的目的，从而提高产品销量（纯液体牛乳产品） ，非法获得利益；某些生产者为降低成本，在含乳饮料中超量使用环己基氨基磺酸钠。以上事实表明，急需加强乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的检测能力。但目前国内尚未建立针对乳制品及含乳饮料中的环己基氨基磺酸钠进行检测的方法。为对乳制品及含乳饮料制品进行严格控制，维护消费者利益，特别是保障婴幼儿健康茁壮成长，也为将可能出现的食品安全问题在尚未产生严重危害前即被发现和处理，为国内食品安全提供技术保障，为有关部门的监督管理提供技术支撑，需建立乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的检测方法。二、工作简况任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22/028-2012起草单位：国家农业深加工产品质量监督检验中心吉林省产品质量监督检验院1、前期工作本标准的起草参考 SN/T 1948-2007、GB/T5009.97-2003 等文献，结合我国国情和国内实验室的特点，确定使用液相色谱-质谱 /质谱仪和气相色谱仪测定乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠含量，建立了一个快速灵敏、选择性好、准确性高、能为我国大多数检测机构所使用的方法，为乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠含量的检测提供了重要的依据，也对其他同类产品中环己基氨基磺酸钠含量的检测提供了参考。同时对确定的检测方法进行检出限、回收率、精密度等试验，据此向吉林省卫生厅标准审定委员会提出地方标准制定的申请。2、实验室间验证工作2012 年 7-12 月，我们邀请吉林省出入境检验检疫局、吉林省疾病控制中心、吉林大学、长春应化所、长春市产品质量监督检验院等单位进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、最低检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法适用于测定乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的含量，具有测定结果准确可靠、操作简单、快速等特点。4三、研究路线，与现有标准的关系本标准编制遵循“先进性、实用性、统一性、规范性”的原则，尽可能与国际通行标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T  1.1-2009标准化工作导则  第1部分：标准的结构和编写规则和GB/T 20001.4-2009标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求编写的。课题组针对现行标准中对样品复杂性考虑的不足，在使用液相色谱-质谱/质谱仪检测时选择“提取 净化 直接进样分析”的技术路线；在使用气相色谱仪检测时选择“提取 净化 衍生进样分析”的技术路线，即丰富了检测手段，又有效利用了设备的优势，形成优势互补，极大提高了试验效率和数据可信性。本标准可作为广大生产企业、质检机构、第三方检验机构及其他相关单位对乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠检测时的参考标准使用。四、主要试验的研究论证报告和技术性能分析1、标准的名称本标准利用液相色谱-质谱 /质谱仪和气相色谱仪解决乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠测定的技术问题，因同时采用两种不同类型检测手段，所以将本标准的名称定为：乳制品及含乳饮料中环己基氨基磺酸钠的测定 。2 标准的范围纯牛乳产品、以牛乳为主要原料的液体乳制品产品及含牛乳的乳饮料产品。3 方法原理3.1 试样经提取、除蛋白、净化后，用液相色谱-质谱/质谱仪检测，外标法定量；3.2 试样经提取、除蛋白、衍生、净化后，用气相色谱仪检测，外标法定量。4 前处理条件牛乳成分复杂，其中的蛋白质、脂肪等大分子成分对环己基氨基磺酸钠的提取和测定会产生不利影响。课题组选择了先沉淀后提取的方法，最大限度的减少杂质对检测结果的干扰，再针对不同检测仪器的需要，分类处理提取液。5 仪器分析条件5.1 色谱的选择甜蜜素分子量较小，易溶于水，极性较强。课题组考虑到液相色谱-质谱/质谱仪的快速性和气相色谱仪的普遍性，确定分别使用两种设备进行方法学的研究。5.2 色谱条件的优化实验过程中通过对色谱条件规定的参数要求进行了多次调整，以使仪器的灵敏度、稳定性和分离效率均处于最佳状态，获得满意的分离效果，达到回收率的要求。经过多次的试验摸索，确定试验参数。5.2.1 色谱柱的选择课题组在进行液相色谱-质谱 /质谱仪的方法研究过程中，分别使用C8、C18 、阴离子交换柱、阳离子交换柱进行分析测定；在进行气相色谱仪的方法研究过程中，选择使用HP-INNOWAX、HP-5及HP-1色谱柱进行分析测定。试验表明，经HP-5(30m0.32mm0.25m) 分离得到的色谱图分离度、响应值均5较理想，能满足检测要求且能有效的与干扰物质进行分离。5.2.2 色谱条件的选择因为实际样品中含有大量干扰物，对检测目标影响较大。在实际摸索并参阅相关文献的基础上，我们对温度程序进行选择比较，在保证分离度、峰形和对仪器的保护等多方面考虑，选择：液相色谱-质谱/质谱条件：色谱柱：强阳离子交换柱（150 mm2.5 m）；流动相：0.2 %甲酸溶液(4.7) +乙腈(4.2)=95+5 ；流速：0.4 mL/min；进样量：2 L；柱温：30 ；离子源（ESI）温度：230 ；离子源（ESI）电子轰击能量：70 eV；多反应监测方式（MRM），监测离子（m/z ）178、80，其中 178为定量离子。气相色谱条件：80恒温至目标物流出。以上条件下得到的质谱峰、色谱峰峰形较好，柱效较高，且与干扰物完全分离。图 1  环己基氨基磺酸钠 标准品液相色谱 -质谱/ 质谱总离子流图- MRM (2.413-2.688 min, 82 scans) (178.0 -> *) 20091021-002.dMass-to-Charge (m/z)80 100120140160180Counts1x1000.250.50.7511.251.51.7522.2580.0178.0图 2  环己基氨基磺酸钠的液相色谱 -质谱/ 质谱图6图 3  环己基氨基磺酸钠的气相色谱图5.2.3 萃取溶剂的选择课题组针对气相色谱法挑选了乙腈、正己烷、乙酸乙酯、甲醇、乙醚等溶剂作萃取效果比对实验。其中甲醇和乙腈与水互溶，萃取效果不佳；乙酸乙酯共萃物多，干扰严重；乙醚挥发性强，提取效率相对较低；正己烷的提取效率较高，提取液对仪器响应值较理想，且与水分层效果较好，后续处理简便。综上，课题组选择乙酸乙酯作为萃取溶剂。在进行液相色谱-质谱/质谱法研究的过程中，由于环己基氨基磺酸钠易溶于水，故不用特意选择萃取溶剂。6 线性范围6.1 液相色谱-质谱/质谱法线性范围0.0150mg/L 甜蜜素系列标准溶液用液相色谱-质谱/质谱仪检测得出的一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线，得到拟合标准曲线。可见在 0.0150mg/L 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可以对其进行稀释。标准曲线及曲线方程见图 4。6.2 气相色谱法线性范围101000mg/L 甜蜜素系列标准溶液用气相色谱仪检测得出的一系列峰面积与浓度的对应点，连点成线，得到拟合标准曲线。可见在 101000mg/L 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可以对其进行稀释。标准曲线及曲线方程见图 5。图 4 环己基氨基磺酸钠在液相色谱-质谱 /质谱上的标准曲线图7y = 0.038x - 0.1156R = 0.99980510152025303540450 200 400 600 800 1000 1200系 列 1线 性 (系 列 1)图 5 环己基氨基磺酸钠在气相色谱上的标准曲线图7 方法检出限根据 GB/T 5009.1-2003，中 A .2 色谱法中的计算方法。检出限=S/bb标准曲线回归方程中的斜率。S仪器噪声的 3 倍。确认液相色谱-质谱/质谱法试样检出限为 0.01mg/kg，气相色谱法试样检出限为 10mg/kg。8 方法的回收率根据GB/T 5009.1-2003，我们选用3个样品，每种样品加入三个水平的环己基氨基磺酸钠标准溶液，按照送审稿的样品处理方法和色谱条件，进行回收率的测定，计算出每个添加水平的回收率。方法回收率结果见表1。表1 样品回收率编号 样品名称 拟采用方法 添加量（mg/kg） 平均实测值 （mg/kg） 平均回收率 %0.01 0.0102 10225 25.23 100.92HPLC-MS/MS50 49.87 99.7410 9.25 92.5500 499.88 99.981 纯液体乳GC1000 1013.77 101.380.01 0.00980 982 含乳饮料 HPLC-MS/MS25 25.22 100.88850 51.51 103.0210 9.51 95.1500 523.74 104.75GC1000 985.62 98.560.01 0.0097 9725 24.84 99.36HPLC-MS/MS50 45.61 91.2210 9.10 91.0500 477.26 95.453 发酵乳GC1000 976.73 97.679 方法的精密度表 2 国家农业深加工产品质量监督检验中心实验室内精密度拟采用方法 液相色谱- 质谱/质谱法 气相色谱法重复次数 环己基氨基磺酸钠添加水平 mg/kg1 0.0101 25.28 49.87 9.22 499.88 1015.272 0.0103 25.30 50.22 9.33 501.69 1005.493 0.0099 25.20 51.51 9.59 523.74 985.824 0.0101 25.16 50.99 9.44 520.82 983.155 0.0098 24.21 45.61 9.10 477.26 980.736 0.0097 24.92 47.28 9.22 480.44 978.88平均值 0.00998 25.01 49.247 9.31 500.64 991.56标准偏差 0.000223 0.416 2.306 0.011 19.48 15.09相对标准偏差% 2.23 1.66 4.68 0.12 3.89 1.52五 方法验证由我中心统一制备样品，同时发送到 5 个参加方法验证的实验室进行验证，每个实验室取 6 次测定结果，详见表 3-7。表3 机构1对环己基氨基磺酸钠检测的精密度(mg/kg)拟采用方法 液相色谱-质谱/质谱法 气相色谱法重复次数 环己基氨基磺酸钠添加水平 mg/kg1 0.0099 24.82 52.27 9.55 482.28 1013.672 0.0098 25.03 51.01 9.69 491.31 1025.243 0.0099 23.48 49.22 9.14 493.24 1000.624 0.0102 25.91 50.49 9.58 490.99 990.195 0.0100 24.21 48.11 10.20 495.16 1003.4196 0.0097 25.92 49.48 10.42 500.25 995.23平均值 0.00992 24.90 50.10 9.7633 492.21 1004.73标准偏差 0.00017 0.9567 1.4702 0.4680 5.9213 12.81相对标准偏差% 1.71 3.84 2.93 4.79 1.20 1.24表4 机构2对环己基氨基磺酸钠检测的精密度(mg/kg)拟采用方法 液相色谱 -质谱/ 质谱法 气相色谱法重复次数 环己基氨基磺酸钠添加水平 mg/kg1 0.0091 24.18 51.27 9.72 497.26 1083.772 0.0094 23.80 50.98 9.93 504.49 1065.213 0.0109 24.75 51.11 9.69 514.64 970.624 0.0103 23.99 48.32 9.51 508.22 981.155 0.0104 24.52 48.61 9.83 511.23 986.736 0.0100 25.68 48.28 9.38 512.31 988.88平均值 0.01001 24.4867 49.76 9.67 508.03 1012.73标准偏差% 0.000668 0.6792 1.495 0.203 6.337 48.61相对标准偏差% 6.67 2.77 3.00 2.10 1.25 4.80表5 机构3对环己基氨基磺酸钠检测的精密度(mg/kg)拟采用方法 液相色谱- 质谱/质谱法 气相色谱法重复次数 环己基氨基磺酸钠添加水平 mg/kg1 0.0094 26.18 53.22 10.15 505.38 991.192 0.0096 25.47 51.72 9.99 500.19 985.433 0.0110 25.56 52.46 9.47 493.72 966.524 0.0094 23.85 50.21 9.53 488.28 975.355 0.0095 24.72 49.87 9.30 517.11 1006.536 0.0096 25.22 52.11 9.43 508.42 1028.18平均值 0.00975 25.17 51.598 9.645 502.18 992.2标准偏差 0.000619 0.801 1.309 0.342 10.40 22.317相对标准偏差% 6.35 3.18 2.54 3.55 2.07 2.25表6 机构4对环己基氨基磺酸钠检测的精密度(mg/kg)拟采用方法 液相色谱- 质谱/质谱法 气相色谱法重复次数 环己基氨基磺酸钠添加水平 mg/kg1 0.0105 25.63 52.27 9.72 498.85 983.872 0.0103 25.25 51.92 9.63 503.33 965.503 0.0110 23.88 53.44 9.89 491.14 943.324 0.0107 23.46 52.29 9.84 482.46 951.855 0.0094 24.51 49.96 9.70 499.52 966.136 0.0094 24.02 51.00 9.72 487.76 998.08平均值 0.0102 24.458 51.81 9.75 4