《水产品中炔诺酮类药物的快速测定 酶联免疫法》 编制说明

吉林省食品安全地方标准水产品中炔诺酮的快速测定 酶联免疫法编制说明(送审稿)长春市水产品质量安全检测中心2013 年 1 月 10 日DBS22ICS：标准分类号：备案号：2目  录一、 研究背景 3二、 任务来源   3三、 制定标准的必要性和意义 3四、 标准化过程 4五、 制标原则 5六、 标准主要条款的说明 51、标准的名称   52、标准的范围   53、方法原理     54、前处理条件   55、仪器分析条件   56、酶联免疫线性范围 .67、方法检出限      .78、方法回收率及精密度  .7七、方法验证     9八、验证结论     11九、实施标准的建议 12十、参考文献   123一、研究背景炔诺酮是是广泛应用的甾类同化激素，被用于促进水产动物的生长及繁殖。但由于炔诺酮存在明显的致癌性，欧美等国已经相继禁止或者严禁使用，我国农业部第 235 号文件中规定，动物源食品中炔诺酮不得检出。目前水产品中炔诺酮的检测主要依靠高效液相-质谱串联的方法，主要为出口食品提供检验检疫，而此方法所需设备昂贵，动辄几百万，一般的检测机构尤其是基层检测很难承受，而且分析样本前处理复杂耗时，使其推广受到了限制，在流通领域无法使用。本标准制定的目的就是建立一套经济，快速，准确的适合吉林省实际的检测炔诺酮的方法，用于样品的筛选及初步定量，这对于保障人民的生活健康，保证食品安全卫生具有重要意义。二、任务来源任务来源：吉林省卫生厅任务编号：DBS22-041-2012归口单位：吉林省卫生厅起草单位：长春市水产品质量安全检测中心三、制定标准的必要性和意义1、维护人民群众的切身利益水产品道鲜美，肉质细嫩，水分较多，脂肪较少，是营养价值较高又易于消化的食物，是人们喜爱的营养食品，自古以来人类就把水产品作为最理想的食品。它具有含蛋白质高，脂肪、胆固醇低，有多种维生素，易于人体消化吸收，促进新陈代谢的特点，这是其他肉类所无法比拟的，水产品是最适宜人类健康的蛋白质资源，世界上许多国家都把利用海洋水面作为解决人类食用蛋白质的重要来源。据科学预算，人们膳食中摄入的动物蛋白质有一半左右来自水产品。近年来，在渔业生产及养殖业快速发展的同时，渔业生产环境遭受污染以及养殖、加工、流通各环节滥用或不规范使用药物和添加剂的事件时有发生，尤其是在养殖过程中，在饲料方面，炔诺酮有广泛的应用，目前水产品中的药物残留问题已经成为制约水产养殖业发展的一个大的瓶颈，同时对于消4费者的自身安全也造成了极大的心理阴影。目前水产品的质量安全堪忧。我国农业部第 235 号文件明确规定，水产品中炔诺酮为不得检出。2、为食品安全监管及工商管理部门执法提供依据本标准起草小组通过查阅国内外相关法律、法规，结合吉林省的实际情况，制定出适合吉林省内水产品检测的标准，可以为食品安全突发事件提供技术支持，同时也可以为执法部门提供执法依据和保障，切实保证消费者的合法权益，让群众免受食品安全风险的侵害，真正为老百姓提供安全保障。3、完善国家标准的需要炔诺酮的测定已经有高效液相色谱-质谱串联法的标准但是该检测方法由于所需仪器比较昂贵，且检测过程繁琐耗时，严重导致了目前在吉林省内对炔诺酮的检测力度不够。本标准制定的目的就是建立一套经济，快速，准确的检测水产品中炔诺酮的方法，用于水产样品的筛选及测定。四、标准化过程1、前期工作查阅相关最新资料和文献，结合吉林省的实际和国内实验室的特点，研制了一种新的检测方法酶联免疫法测定水产品中的炔诺酮，建立了一个快速，简单，费用低廉，能为我省大多数的检测机构所使用的方法。同时对确定的检测方法进行检出限、回收率、精密度等试验，确保该方法的切实可行。2、实验室间验证工作邀请吉林省出入境检验检疫局检验检疫中心、吉林省渔业生态环境监测及水产品监督检测中心、农业部渔业环境及水产品质量监督检验测试中心（哈尔滨）等单位进行了实验室间的验证工作。通过统计分析各个实验室的检测数据，验证了方法的准确度和精密度、最低检出限等。参加验证的实验室一致认为：该方法灵敏度高、检测结果重复性好，在检出限、回收率、精密度等方面满足药残检测的要求，适用于水产品中炔诺酮残留量的测定。5五、制标原则   本标准编制遵循“简单、快速、低廉、实用”的原则，尽可能与国家标准接轨，注重标准的可操作性，严格按照GB/T 1.1-2000标准化工作导则  第1部分：标准的结构和编写规则和GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求编写的。六、标准主要条款的说明1. 标准的名称本标准适用于水产品中炔诺酮的测定，故标准命名为水产品中炔诺酮的快速测定 酶联免疫法 。2. 标准的范围目前水产品主要包括淡水及海水类产品，本标准适用于市场上常见的鲜活鱼类、虾蟹类、贝类及软体类水产品中炔诺酮的测定。3. 方法原理采用竞争酶联免疫法，在酶标板条上预先包被偶联抗原，样品中的炔诺酮与偶联抗原竞争抗体，用TMB底物显色，再用酶标仪测吸光值，从而得出数据。4. 前处理条件称取2.00.05  g均质物至50  mL聚苯乙烯离心管中，加入7  mL乙腈-0.1  M氢氧化钠溶液（组织样本专用）（见配液4.9），分别加入0.36 M二水合硝基铁氰化钠溶液（见配液4.6），1M七水合硫酸锌溶液（见配液4.7）各500  L，用振荡器振荡10  min，3000  r/min以上，室温（20-25 ）离心10 min;取1  mL上清液至10 mL干净玻璃试管中，于50-60 水浴氮气流下吹干；取1  mL复溶工作液（见配液4.10）复溶干燥的残留物；把提取得到的样本液与复溶工作液按照14体积比进行稀释（取100  L样本液+400  L复溶工作液），涡动混匀；取50  L用于分析。65. 仪器分析条件5.1 所用主要仪器酶标仪或酶联免疫分光光度计5.2 波长选择根据试剂盒的条件及实际测试确定采用450nm 段波长最为合适。5.3 仪器工作温度经过不同温度间的对比，确定仪器、酶标板及样品在20-25条件下，吸光度值达到最好。5.4 其他需要小型仪器旋转蒸发仪/氮气吹干装置、均质器、振荡器、涡旋仪、离心机、天平：感量、刻度移液管、洗耳球、玻璃试管、聚苯乙烯离心管、微量移液器。6.  酶联免疫法线性范围炔诺酮标准系列工作液浓度分别为 0 ng/mL、0.1 ng/mL、0.3 ng/mL、0.9 ng/mL 、2.7 ng/mL、8.1 ng/mL，将各浓度依次进样后，以浓度的对数为横坐标，以百分吸光度率为纵坐标，建立标准曲线，直线方程为 Y=-15.551X+38.499，相关系数 r=0.9991。曲线在 0.18.1 ng/mL 浓度范围内线性很好。如果实测样品的含量超过此范围，可对其进行稀释。表 1 为标准品吸光度值，图 1 为标准曲线图。表 1：标准品百分吸光度值浓度 (ng/mL) 0 0.1 0.3 0.9 2.7 8.12.173 1.563 1.257 0.885 0.471 0.150 吸光度值 2.183 1.665 1.251 0.887 0.475 0.138 平均值 2.178 1.614 1.254 0.886 0.473 0.144 百分吸光度率(%) 74.10 57.58 40.68 21.72 6.61 标准曲线 Y=-15.551x+38.499 R2 0.99917图 1：呋喃唑酮标准曲线炔 诺 酮 标 准 曲 线0.0010.0020.0030.0040.0050.0060.0070.0080.00-3 -2.5 -2 -1.5 -1 -0.5 0 0.5 1 1.5 2 2.5浓 度 对 数百分吸光度率 系 列 1线 性  (系 列 1)7. 方法检出限根据试剂盒的灵敏度，采用试剂盒灵敏度10倍的浓度，并通过实际的试验验证，确定该方法检出限（定量限）为2 g/Kg。8. 方法的回收率及精密度分别以阴性鲤鱼、对虾、鳕鱼样品为加标对象，分别加入四个水平的炔诺酮标准溶液，按照送审稿的样品处理方法及相同的条件，进行回收率及精密度的测定，每个样品重复6次，计算出每个添加水平的回收率范围和相应的相对标准偏差（RSD）值。方法回收率结果见表2,3.4。 表2 阴性鲤鱼数据加标浓度(g/kg) 吸光度值 浓度(g/kg) 平均值(g/kg) RSD(%) 回收率范围1.648 1.831.668 1.731.671 1.7121.664 1.751.76 2.53 85%-91%81.662 1.761.654 1.801.354 4.361.366 4.211.354 4.371.361 4.281.341 4.5451.330 4.684.41 3.94 84%-93%1.122 8.671.127 8.541.123 8.641.107 9.061.104 9.12101.144 8.128.69 4.22 81%-91%0.877 17.860.883 17.52 0.880 17.67 0.862 18.67 0.894 16.98 200.887 17.34 17.67 3.24 84%-93%表3 阴性对虾数据加标浓度(g/kg) 吸光度值 浓度(g/kg) 平均值(g/kg) RSD(%) 回收率范围1.675 1.691.662 1.761.666 1.741.639 1.881.671 1.7121.666 1.741.75 3.81 84%-94%1.358 4.311.354 4.371.360 4.291.359 4.301.340 4.5551.334 4.634.41 3.30 85%-92%1.125 8.591.123 8.641.132 8.41101.089 9.568.78 4.96 84%-95%91.109 8.991.130 8.460.875 17.950.881 17.620.889 17.240.858 18.860.874 18.02200.879 17.7317.90 3.04 86%-94%表4 阴性鳕鱼数据加标浓度(g/kg) 吸光度值 浓度(g/kg) 平均值(g/kg) RSD(%) 回收率范围1.656 1.791.643 1.861.652 1.811.671 1.711.668 1.7321.684 1.651.76 4.00 82%-93%1.361 4.281.330 4.681.354 4.371.362 4.261.358 4.3151.347 4.464.39 3.60 85%-93%1.156 7.831.138 8.261.128 8.511.093 9.431.140 8.21101.138 8.268.42 6.45 82%-94%0.881 17.650.873 18.050.881 17.640.875 17.980.897 16.84200.850 19.3117.91 4.51 88%-96%七、 方法验证  10由我中心提供方法及试剂盒，分别发送到 3 个参加方法验证的实验室进行验证，验证单位提供水产样品，每个浓度均对每个样品测定 6 次，结果见下表 6，7，8。表 6：验证机构 1 检测结果样品 添加浓度(g/kg) 回收率范围(%) RSD(%)2.0 85%-96% 4.285.0 87%-92% 2.1710.0 82%-94% 5.28鲤鱼20.0 86%-92% 2.362.0 82%-93% 4.325.0 86%-93% 2.7310.0 83%-95% 4.82对虾20.0 85%-92% 2.482.0 86%-93% 2.765.0 87%-93% 2.3110.0 81%-93% 4.89鳕鱼20.0 86%-91% 1.84表7：验证机构2检测结果样品 添加浓度(g/kg) 回收率范围(%) RSD(%)鲤鱼 2.0 84%-91% 2.87115.0 85%-92% 2.6810.0 81%-91% 4.1520.0 87%-91% 1.442.0 85%-93% 3.775.0 85%-88% 1.1910.0 84%-92% 3.03对虾20.0 86%-92% 2.092.0 84%-93% 3.395.0 85%-89% 1.4710.0 84%-91% 2.94鳕鱼20.0 86%-91% 1.92表8 验证机构3检测结果样品 添加浓度 回收率范围 RSD(%)2.0 84%-91% 2.915.0 85%-92% 3.2610.0 78%-91% 5.11鲤鱼20.0 84%-90% 2.22.0 84%-91% 2.785.0 85%-92% 3.3410.0 83%-90% 3.46对虾20.0 86%-93% 2.612.0 84%-92% 45.0 85%-89% 1.7410.0 81%-94% 6.64鳕鱼20.0 84%-96% 4.5112八.、验证结论经实验验证：本方法在精密度、重现性、再现性、检出限等方面完全达到了水产品中炔诺酮快速测定的要求，其方法经济、