（遗传学专业论文）nfar1稳定il2mrna上游调节机制的研究.pdf

复旦大学博士论文缩略诩表 缩略词表 缩写 全称 n f a r l b l a s t b p k d a c d n a g s t h r p i p t g p a g e p b s p k b a k t a r e m m p 0 r f m d i l 一2 p 1 3 k n u c l e a rf a c t o ra s s i c a t e dw i t hd s r n a b a s i cl o c a la 1i g n m e n ts e a r c ht 0 0 1 b a s ep a i r k i l o d a lt o n ( s ) c0 i i l p l e l d e n t a r yd n a g l u t a t h i o n est r a n s f e r a s e h o r s e r a d is hp e r o xid a s e i s o p r o p y l b d t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e p o l y p r o p y l e n ea c y lg e le l e c t r o p h o r e s i s p h o s p h a t e b u f f e r e ds a lin e p r o t e i nk i n a s eb a u r i c he l e m e n t a r eb i n d i n gp r o t e i n o p e nr e a d i n gf r a m e m o l e c u l a rd y n a m i c s i n t e r l e u k i n2 p h o s p h o i n o s i t i d e3 一k i n a s e 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究1 二作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在沦文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名： 论文使用授权声明 日期： 本入完全了解复旦大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校彳权保留 送交论文的复印件，允诈论文被查阅和借阅；学校可以公印论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文程解辩后遵守此 规定。 作者签名：。导师签名： 一一r 期卜一 复旦大学博士论文摘要 摘要 c d 2 8 所诱导的白细胞介素( i l 一2 ) 的转录后调控被认为是与i l 一2m r n a 3 u t r 区的富集腺嘌呤尿嘧啶保守区域( a u r i c he l e m e n t s ，触也s ) 相关的。与 触汪结合的蛋白( a u - b i i l d 崦p r o t e i n ，a u b p ) 能调节1 1 1 f 矾a 去腺苷酸，改变 m i 斟a 降解的速率，磷酸化a u b p s 可以稳定m i 矾a 。眦1 是一个与i l 2 出n a 6 瓜e 区结合的a u b p ，在过量表达时可以稳定i l 2m r n a 。n f a rl 基因编码区 含有一个保守的a k t 底物序列，其中s 6 4 7 位是u 汀保守的磷酸化位点。在本 文中证实了a k t 与n f a r l 相互作用的，并共定位于细胞核，并用体外实验和 体内实验证明了a k t 确实可以磷酸化n f a r l 的s6 4 7 位。 为了进一步说明灿玎磷酸化眦1 的生理意义，我们检测了外源表达 n f a r l 野生型，失磷酸化突变型n f a r 卜s 6 4 7 a 及模拟s 6 4 7 被磷酸化的假磷酸化 突变型n f a r 卜s 6 4 7 e 对i l 一2m r n a 半衰期的影响。其中野生型可以稳定i l 一2 m r n a ，n f a r 卜s 6 4 7 a 则和空载体c m v m y c 类似，稳定i l 一2m r n a 能力很低；而 转染n f a r l _ s 6 4 7 e 的细胞中i l 一2m r n a 稳定性与野生型近似，略高于野生型。我 们还观察到a k t 和野生型n f a r l 共转的j u r k a t 细胞中i l 一2 m r n a 稳定性要远远高 于a k t 和n f a r l s 6 4 7 a 共转的细胞，也高于单转n f a r l 的细胞；p 1 3 一k 通路的抑 制剂l y 2 9 0 0 4 2 抑制n f a r l 野生型稳定i l 一2m r n a 的功能，n f a r 卜s 6 4 7 a 则对 l y 2 9 0 0 4 2 不敏感。通过上述实验证明了a k t 通过磷酸化n f a r ls 6 4 7 调节i l 一2 m r n a 的稳定性。 我们进一步检测c d 2 8 刺激信号对n f a r1 磷酸化程度的影响以及n f a r l s 6 4 7 位的磷酸化对c d 2 8 所介导的i l 一2 转录后调控所起的作用。发现c d 2 8 刺激 后，n f a r l 的磷酸化水平明显增加，而且这种增加是伴随着a k t 磷酸化水平增加 的；一旦a k t 被抑制，s 6 4 7 位的磷酸化水平也随之下降。放射免疫方法检测到 n f a r l 野生型和n f a r 卜s 6 4 7 a 对c d 2 8 所诱导的转录后调控有明显的不同。n f a r l 可以稳定i l 一2m r n a 并提高蛋白表达量，突变型则没有这样的作用，这说明n f a r l s 6 4 7 位的磷酸化对c d 2 8 稳定i l 一2m r n a 非常重要。 根据上述的研究结果，我们提出了一条c d 2 8 稳定i l 2m r n a 可能的分子 复旦大学博士论文摘要 通路：c d 2 8 刺激激活舢汀，活化的a k t 进入细胞核内磷酸化眦ls 6 4 7 位， 促使几2m r n a 稳定性增加。 关键词：n f a r1 a k tc d 2 8 转录后调控 i l 21 1 1 【矾a 稳定性 磷酸化 4 复旦火学博士论文摘要 a b s t r a c t t h ei n t e r l e u k i n 一2m r n ai sa1 a b i l et r a n s c r i p tc o n t a i n i n ga u r i c h e l e m e n t s ( a r e ) t h a ti st r a n s i e n t l ys t a b i l i z e db yc d 2 8r e c e p t o rs i g n a l i n g t h ea r e b i n d i n gp r o t e i n s ( a u b p s ) b i n dt om r n a sc o n t a i n i n ga na i 砸i nt h e i r 3 u n t r a n s l a t e dr e g i o na n dp r o m o t eo rr e p r e s st h e i rd e a d e n y l a t i o na n d r a p i dd e g r a d a t i o n i n d e p e n d e n ts i g n a lt r a n s d u c t i o np a t h w a y sh a v eb e e n r e p o r t e dt os t a b i li z ea r e c o n t a i n i n gt r a n s e r i p t sb yap r o c e s st h o u g h tt o i n v 0 1 v ep h o s p h o r y l a t i o no fa r e b i n d i n gp r o t e i n s n f a r li sa na u b pw h i c h b i n d sa n ds t a b i l i z e si l 一2m r n a i n s p e c t i o no ft h ec o d i n gs e q u e n c eo f n f a r 一1r e v e a l e dt h e p r e s e n c e o fo n ea k tc o n s e n s u sp h o s p h o r y l a t i o n s i t e s s e r i n e6 4 7 h e r ew er e p o r tt h a ta k ta s s o c i a t e sw i t hn f a r li nv i v o w i t hc 0 1 0 c a l i z a t i o ni nt h en u c l e u so ft h ec e l l e x p e r i m e n t si nv i t r oa n d i nv i v os h o w sa k tp h o s p h o r y l a t e sn f a r lo ns e r i n e6 4 7 t oe v a l u a t et h e p h y s i 0 1 0 9 y o fa k tp h o s p h o r y l a t i n gn f a r l ，w e o b s e r v e dt h ed i f f e r e n c eo fi l 一2s t a b i l i z a t i o nb e t w e e nn f a r l 。n f a r l 一s 6 4 7 a a n dn f a r l 一s 6 4 7 e ，w h i c hm o c k e ds 6 4 7i sp h o s p h o r i e d t h ew i l dt y p e s t a b il iz e di l 一2m r n aa sd e s c r i b e db e f o r e w h i1 en f a r l 一s 6 4 7 ai l 一2m r n a d e c a y e dj u s t1i k ec m v m y ce x p r e s s e d w h e nw et r a n s f e c t e dt h en f a r l 一s 6 4 7 e p l a s m i db yt h es a m ep r o c e d u r e ， i l 一2m r n aw a se v e nm o r es t a b l et h a nn f a r l w a st r a n s f e c t e d o t h e r w i s e ， w ef o u n di l 一2m r n at 1 2o fw i 1 dt y p ea n da k t c o t r a n s f e c t e dis1 0 n g e rt h a nn f a r l s 6 4 7 aa n da k tc o t r a n s f e c t e d f u r t h e r m o r e ，n f a r l s t a b i l z i n gi l 一2 羽r n ai ss e n s i t i v et ol y 2 9 0 0 4 2 ， t h e i n h i b i t o ro fp 1 3 一k b u tf o rn f a r 一1 s 6 4 7 a ，l y 2 9 0 0 4 2s e e m st oh a v en oe f f e c t o ni l 一2m r n as t a b i l i z a t i o n f r o mt h e s ed a t a ，w ec o n c l u d e dt h a ta k t p h o s p h o r y l a t e sn f a r lo ns 6 4 7f o ri l 一2m r n as t a b i l i z a t i o n i th a sb e e n w e l lr e p o r t e dt h a t c d 2 8c o s t i m u l a t i o n1 e a d st oa d r a m a t i cu p r e g u l a t i o ni ni l 一2e x p r e s s i o nm e d i a t e db yb o t h e n h a n c e d t r a n s c r i p t i o na n di n d u c t i o no fm r n as t a b i l i z a t i o n w ew e r ec u r i o u st ok n o w 5 复巨大学博上论文摘要 w h e t h e rc d 2 8c o s t i 阳u l a t i o ni sc o n c e r n e dw i t hn f a r lp h o s p h o r y l a t i o nb ya k t a n d t h er 0 1 eo fn f a r ls 6 4 7p h o s p h o r y l a t i o ni nc d 2 8 一i n d u c e dtc e l l a c t i v a t i o n w eo b s e r v e dt r e a t 田e n tw i t ha n t i c d 2 8i n d u c e dd i s t i n c t i n c r e a s ei np h o r s p h o r y l a t i o no fn f a r la ts e r 6 4 7a n da k tp h o s p h o r y l a t i o n w a su p r e g u l a t e dc o i n c i d e n t l y c o i n c u b a t i o na n t i c d 2 8w i t ht h el y 2 9 4 0 0 2 p r e v e n t e dc d 2 8 一m e d i a t e di n c r e a s eo fa k ta c t i v i t ya n dp h o s p h o r y l a t i o no f n f a r l b yr a d i o i m m u n o a s e e y ，w ef o u n dn f a r la n dn f a r l 一s 6 4 7 ah a dd i s t i n c t i n f l u e n c eo np o s t t r a n s c r i p t i o nr e g u l a t i o n w h i l en f a r ls t a b i l i z e d c d 2 8 一m e d i a t e di l 一2m r n aa n dp r o o t e dt h es e c r e t i o no fi l 一2p r o t e i n ，t h e r e w a sn os t a b i1i z a t i o no fi l 一2m r n ao b s e r v e da sn f a r l s 6 4 7 ai sc o n c e r n e d t h i sr e s u l ti 1 1 u m i n a t e sn f a r ls 6 4 7 ap h o s p h o r y l a t i o ni st h ek e yp o i n ti n n f a r ls t a b i l i z i n gi l 一2m r n ab yc d 2 8c o s t i m u l a t i o n ，w h i c hi sc o n s i s t e n t w it ht h ed a t aa b o v e k e y w o r d s ：n f a r l ，舢订，c d 2 8 ，p o s t 缸i a n s c 啷t i o nr e g u l 撕0 n ， i l 一2 瑾l r n as t a b i li z a t i o n ，p h o s p h o r y l a t i o n 6 复旦人学博士论文前言 1 厶l 日l j舌 白细胞介素2 ( i l 2 ) 是t 细胞免疫应答过程中重要的细胞因子，在转录和 转录后水平受到精确调节。t 细胞被激活后，i l 2 作为自分泌和旁分泌因子参与 克隆性的t 细胞扩增，影响免疫应答的级联扩增并调节t 细胞程序性调亡【1 4 】。 如果i l 2 不能正常分泌会丧失t 细胞免疫应答功能并引发自身免疫 5 ，6 】。正是 因为在t 细胞和免疫系统其他细胞中有如此重要的作用，几2n 1 i 斟a 和蛋白表 达取决于转录和l i l 】 斟a 降解之间动态平衡调节。在静态t 细胞中，m 2 和其他 许多细胞因子在转录后会被快速降解，这依赖于3 u t r 存在的若干个富集腺嘌 呤尿嘧啶保守区域( a u r i c he l e m e n t s ，触也s ) ；t 细胞一旦被免疫激活会产生比 静止状态上百倍的i l 2 ，这一方面是由于转录激活，另一方面是几2 m r n a 稳 定性增加 7 】。这种调节模式使得应答感染的细胞因子m r n a 在短时间内大量增 加，感染平息后舢辽所介导的酬刚a 降解又能快速将多余m r n a 清除。 a i 也广泛存在于一些瞬时表达的基因如早期应答基因、前癌基因和一些生 长调节基因 8 1 1 ，灿也作为3 u t r 的保守序列主要功能是介导它所在的转录子 快速降解。c f o s ，c n l y c ，c j u i l ，g m c s f ，i l 3 ，和n 师一仅这些调节基因中都存在 6 衄快速降解删刚a 1 1 1 4 】。a r e 功能依赖于结合在越冱上的转激活蛋白 ( a u - b i n d i n gp r o t e i i l ，a u b p ) ，一些a u b p 是促进删 矾a 降解，另一些则是稳 定训 a 8 ，1 5 ，1 6 。例如t r i s t e 仃a p r o l i n ( t t p ) 是内毒素诱导的蛋白，结合于t n f a n 瓜n a 的伽垣促进t n f am r n a 降解【1 7 t t p 还结合于其他细胞因子l i l 】刚a ， 促使他们去腺嘌呤，使n l 】 矾a 降解 1 8 】。另一个a u b p ，b r f l 在体外促进 i l 3 l t l 】 a 降解，a k t 通过磷酸化b r f ls 9 2 减弱它降解m r n a 能力，稳定了 i l 3 m r n a 1 9 】。这些促进m r n a 降解的a u b p 聚集3 外切核酸酶复合体 ( e x s o m e ) 促进1 1 1 f 矾a 降解，而稳定1 1 1 矾a 的a u b p ，例如h u r 就没有这样 的功能。h u r 分布于包括t 淋巴细胞在内的多个细胞株，能稳定i l 3 和c f o s 的m r n a 。 c d 2 8 属于免疫球蛋白超家族，是t 细胞活化和发育中重要的分子【2 0 ，2 1 。 在缺失c d 2 8 的条件下，t 细胞对免疫刺激无应答，并且只有在c d 2 8 共刺激下 才能避免无应答情况的出现 2 2 ，2 3 】。c d 2 8 共刺激会诱导i l 2 大量产生，这是通 过增加转录和稳定r 1 1 i m a 实现的 2 4 ，2 5 】。另外c d 2 8 诱导抗调亡蛋白b c l x l 在 7 复旦大学博士论文刖舌 t 细胞存活中发挥重要作用 2 6 。虽然c d 2 8 的重要功能众所周知，它的下游信 号通路却不是很清楚。在转录方面，p 1 3 k 通路的川盯是t 淋巴细胞中被c d 2 8 激活的丝氨酸酪氨酸激酶，a k t 过量表达可以取代c d 2 8 和其他共刺激信号上 调i l 2 转录 2 7 ，2 8 】。有人提出过c d 2 8 稳定i l 2m r n a 是通过肿 o 6 。加入1 mi p t g 至终浓度 0 5 l m ，再2 8 。c 培养6 小时。离心收菌。 2 ) 裂解： 用移液管将细胞沉淀完全重悬于预冷的裂解缓冲液中，按照每1 0 0m 1 培养 基加入5 m 1 裂解缓冲液的比例。将重悬的细胞于冰上进行超声破碎。4 。c ，1 2 0 0 0 g ，离心3 0 分钟，将上清转移入新的离心管中。 3 ) 纯化： 准备5 0 s 1 u r r y 的g l u t a t h i o n es e p h a r o s e4 b ：轻摇装有7 5 s l u r r y 使之悬浮 后移入新的离心管中，离心1 0 0 0 r p m ，5 m i n ，去上清，再加入预冷的4 。c 的l p b s ( 1 0 m 11 p b s 1 3 3m 17 5 s 1 u r r y ) ，颠倒混匀，再次离心1 0 0 0 r p m ，5 m i n ，去 上清，加入1 m 11 p b s 1 3 3m 17 5 s 1 u r r y ，充分混合，此即5 0 s 1 u r r y 。取 上述的裂解上清液，每l m l 上清液加入2 0 u l 经1 p b s 平衡过的5 0 s 1 u r r y ， 室温轻摇1 2 0m i n 。离心1 0 0 0 r p m ，5 m i n ，去上清。用1 0 倍柱床体积的1 p b s 流 洗，离心1 0 0 0 r p m ，5 m i n ，去上清。再重复清洗2 次。 4 ) 洗脱： 按每m 1 柱床体积加1m 1g l u t a t h i o n ee 1 u t i o nb u f f e r ( 5 0 i i l mt r i s c 1 p h8 o ， 2 0 i m 谷胱苷肽) ，轻轻混合使悬浮，室温孵育1 0 分钟。离心1 0 0 0 r p m ，5 m i n ， 移上清至新的离心管中。洗脱和收集步骤再重复两次，收集三次的洗脱液。 5 ) 检测： 用s d s p a g e 电泳检测所纯化的融合蛋白。 6 2g s t 融合蛋白的大量诱导表达，亲和纯化和柱上切割 1 ) 诱导表达如小量表达。 2 ) g s t 亲和层析柱的制备，上样以及清洗 2 l 复旦大学博士论文材料和方法 吸取g 1 u t a t h i o n es e p h a r o s e4 bb e a d 加入层析柱中，在4 。c 用1 0 倍体积的 柱缓冲液平衡；裂解上清以o 5 m 1 m i n 上柱，用大于1 0 倍柱体积的柱缓冲液洗 涤g s t 亲和层析柱。加入切割缓冲液( t h r o m b i n ) 于4 。c 切割1 6 4 0 小时。 3 ) 用柱缓冲液洗脱收集l c 3 b b 和l c 3 b b k 1 2 1 a 蛋白： 4 ) 用s d s p a g e 电泳检测所纯化的蛋白 6 3 超滤：用m i l l i p o r e 公司的1 0 k d 超滤管进行透析和浓缩 6 4h p l c 纯化： 将超滤后的样品进一步用反向h p l c 纯化，并用s d s p a g e 电泳检测所纯化的蛋白 6 5 质谱分析：职l c 纯化后的样品进行质谱分析，测量其分子量。 7 体外磷酸化分析 激酶反应：沉淀加2 0 u 11 激酶缓冲液( 1 0 m m a t p1 l md t t ) 。取 l o u l w e s t e r n 检测结合蛋白；另1 0 u l 加入反应体系中，加入1 激 酶缓冲液2 u l ， y p 3 2 a t p ( 1 0 m c i m 1 ) 1 u 1 ，a t p ( 1 0 l i l m ) l u l ，底 物蛋白( 1 u g u 1 ) 1 u l ，补水2 0 u 1 。反应条件：3 0 反应3 0 分钟。 加入2 s d s 上样缓冲液终止反应，1 0 0 煮沸5 分钟。s d s p a g e 并 放射自显影检测同位素信号。 8 w e s t e r n 印迹 1 ) 按分子克隆实验操作指南方法，将蛋白从聚丙烯酰胺凝胶转至硝酸纤维 素薄膜，转移时，电压为1 0 0 v ，冰上1 个小时；置于丽春红染色液中5 1 0 分钟， 置于水中洗去染料，显出蛋白标准分子量条带，并用铅笔进行标记蛋白分子量 m a r k e r ： 2 ) 封闭： 将膜放置于2 0m 1 封闭缓冲液中，室温下置于摇床震荡结合1 小时； 3 ) 一抗反应： 加入相应的要检测的蛋白的特异性抗体，将膜放入室温下置于摇床震荡结合2 小时；用洗涤缓冲液洗膜两次，每次1 0 分钟； 4 ) 二抗反应： 复旦大学博士论文材料和方法 按1 ：1 ，0 0 0 0 将羊抗鼠( 兔) 耦联h r p 的抗体稀释于封闭缓冲液，将膜放入室温 下置于摇床震荡反应l 小时；用洗涤缓冲液洗膜四次，每次1 0 分钟。 5 ) 发光反应： 把膜用t b s 浸泡数秒，e c l 发光试剂显影曝光。 6 ) 需用其他一抗杂交时，可选用以下步骤： w a s hb u f f e r 洗膜5 m i nx4 ：，s t r i p p i n gb u f f e r5 0 。c1 0 m i n ，翻转，继续 3 0 m i n ：w a s hb u f f e r5 m i nx6 次；封闭2 小时，一抗2 小时或4 。c 过夜。 9 哺乳动物细胞中的免疫共沉淀实验 9 1 细胞裂解 3 5 姗d i s h 转染细胞，用胰酶消化后，室温离心1 0 0 0r p m1 0 分钟回收细 胞。用1 m ll p b s 清洗细胞两次，弃去上清，沉淀中加入lm l 裂解缓 冲液a ，于4 置于摇床，颠倒混匀裂解3 0 分钟；将细胞裂解液于4 1 2 0 0 0r p m 离心3 0 分钟，收集上清； 9 2 免疫共沉淀 1 ) 去除非特异抗体蛋白： 取上步裂解液置于1 5 m 1 离心管中，加入2 0p 1 蛋白l a a g a g a r o s e 珠； 置于4 缓慢颠倒混匀1 个小时，稍加离心4 0 0 0 r p mx2 m i n ，收集上清于 另一离心管中以去除非特异性杂蛋白，降低背景； 2 ) 免疫沉淀： 向上清中加入3 h a 或f l a g 抗体、4 0 “l 蛋白l a a g a g a r o s e 珠，置 于4 颠倒混合4 个小时；离心后弃上清：沉淀用1 m 1 裂解缓冲液洗5 次， 4 0 0 0 r p m ，离心2 分钟，弃去上清； 3 ) 免疫检测： 重悬沉淀于2 5 l2 s d s 上样缓冲液中，煮沸5 分钟；按分子克隆实验 指南进行1 2 的聚丙烯酰胺凝胶蛋白质电泳、w e s t e r nb l o t 检测 复旦人学博士论文材料和方法 1 0 放射免疫法测定白细胞介素一2 1 0 1 药盒组成及配制( 常温运输，4 度保存) ， 1 、 i l 一2 标准品5 瓶：用前加p b so 6 m l 溶解，浓度为l 、3 、9 、2 7 、 8 l n g m 1 。( 如不填写，加p b so 5 m l 溶解) 2 、i l 一2 抗血清l 瓶：用前加p b s5 m 1 溶解。 3 、1 2 5 i i l 一21 瓶：用p b s 溶解。 4 、 缓冲液( p b s ) l 瓶：直接使用。 5 、 分离剂( p r ) 1 瓶：4 度保存，用前充分摇匀。 1 0 2 样品收集 取静脉血2 m 1 ，注入试管中待凝固后，分离血清，一2 0 度保存2 个月。测 定前置室温或冷水中复融混匀，4 度3 0 0 0 r p m 离心5 m i n ，取上清测定。 1 0 3 测定方法 本实验采用平衡法，取试管编号 操作程序表( 单位：u 1 ) 试剂n s b 管s 0 s 1 s 5 管待测样品管 缓冲液 2 0 01 0 0 标准品1 0 0 待测样品 1 0 0 1 2 5 i i l 一21 0 01 0 01 0 01 0 0 抗血清 1 0 0 1 0 01 0 0 摇匀，4 度放置2 4 h ( 过夜) p r 试剂 5 0 05 0 05 0 05 0 0 充分摇匀，室温放置2 0 分钟，4 度3 5 0 0 转分钟离心2 5 分钟，吸弃 上清，测各沉淀管的放射性计数( c p m ) 注：i l 一2 不能测定兔血清 1 0 4 计算结果 以b t 计算n s b 、s 0 结合百分率，以b b 0 计算标准及待测样品结合百分 率，在半对数坐标纸上绘制标准曲线，并查出样品值。或由自动y 计数器 预先编制程序，直接给出有关参数，标准曲线及样品浓度。 2 4 复旦人学博士论文结果 结果 一n f a r l 和a k t 互相作用并共定位于细胞核 分析n f a r l 的编码区基因序列，发现位于r g gb o x 的s 6 4 7 符合a k t 家族底物 磷酸化位点的特异保守序列r x r x r x x s ，这个保守性的位点广泛存在于a k t 的底物， 如g s k 3b 和b r f l 中( 如图1 a ，b ) ，提示n f a r l 很可能是a k t 激酶的底物。 为了证实n f a r l 和a k t 之间可能的关系，我们在哺乳动物细胞内检测二者的相 互作用。我们分别构建了h a a k t 和m y c n f a r l 载体，分别将两种质粒转入2 9 3 t 细 胞，瞬时表达4 8 小时后，细胞裂解液分别与含有m y c 或者h a 单抗的琼脂糖珠孵 育，免疫共沉淀后用h a 单抗或者m y c 单抗进行w e s t e r nb 1 0 t i n g 检测。结果如 图1 c 所示，在m y c 多肽标签拉下的n f a r l 免疫沉淀物中，仅m y c n f a r l 和h a a k t 共转的实验组中检测到，而任何单转m y c n f a r l 和h a 空载体或h a a k t 和m y c 空 载体的对照组中检测不到a k t 。同样的，用h a 多肽标签来沉淀a k t 复合物，结果显 示在h a a k t 的免疫沉淀复合物可以检测到m y c n f a r l ，说明在细胞内，外源表达 的m y c n f a r l 与h a a k t 是相互作用的。 为了进一步证实n f a r l 与a k t 在细胞生理状态下是否相互作用，我们做了内源 免疫共沉淀。2 9 3 t 细胞裂解液与a k t 单抗孵育，如图l d 所示，在a k t 单抗所沉淀的 内源性免疫沉淀物中检测到n f a r l 蛋白，而作为对照的m o u s ei g g 的免疫沉淀物中 则没有n f a r l 蛋白，这证实了a k t 和n f a r l 在体内是相互作用的。 a k t 在静态下是分布在细胞质中，当a k t 被磷酸化后转移到细胞核中，磷酸化 激活若干转录因子。n f a r l 的序列中有一段保守性的n l s ，因此我们尝试a k t 是否 能够和n f a r l 共定位。共转染p e g f p n f a r l 和p d s r e d a k t 质粒入h e l a 细胞，2 4 小时后血清饥饿细胞过夜，1 0 血清刺激4 5 分钟后，经过固定处理后，激光共聚 焦显微镜下观察，发现约4 0 的a k t 分布于核，并且与n f a r l 共定位。 通过以上的一系列实验，我们可以得出n f a r l 和a k t 在体内是相互作用的， 并且可以共定位于核。 结果 as 6 4 7 b n l s 【l _ _ i c n f a r 1 7 0 2 a a ii i d s r n a r g gb o x b i n d j n gm o t i f l ) s f i ：人n t i m y cl ) 7 s i p ：a n t i h a h a a k t一一+ m y c - n f a r +一+ +一+ +一+ 9 7 k d 一一i 一篇 6 6 k i ) _ w b ：a n t i - m y c w b ：a n t i h a d - p 概二 - 一6 6 k 【) ， w b ：n f a r1 a n t i b o d y w b ：a k ta n t i b o d y n f a r l b r f l g s k 3 b r g i 之g i 之g gi r g r f i 之dr s fe g g s g r p l 之t t1 7 a e a k tc o n s e n s u s r x i x x p h o s p h o r y l a t i o ns i t e s e 9 7 k d i p ：a n t j m v c 一 十+ 上 9 7 k d 6 6 k d 。二一一一一6 6 k 。 - - ， w b ：a n t i h a w b ：a n t i - m y c a k l 二d s r e d n f a r1 g f pm e r 址e 图1n f a r l 和a k t 互相作用并共定位于细胞核a ) n f a r l 结构模式吲b ) n f a r l 中保守 i ，门八k t 底物序列与a k t 其他底物( b r f l ，g s k ：3f j ) 相比对c ) 在2 9 3 1 1 细胞。f j 外源性免疫共沉 淀ir j ：i m m l 】n o p r e c jr 】m i t i o n ，用卡【j 应的抗体j ! ) c 淀：w b ：w e s t e r nb l ( ) ”i n g ，用相应f 内抗体 伶测：l y s ：细胞裂解 i 清。d ) 内源免疫l 衫( 淀e ) a k t 和n 卜、a r l 存h c l a 细胞中j i 定位 复旦大学博上沦文结果 二a k t 磷酸化n f a r l 于s e r 6 4 7 为了进一步证明n f a r l 是a k t 的底物，我们进行了体外激酶实验。在大肠杆 菌中原核表达带有h i s t a gn f a r l 和n f a r 卜s 6 4 7 a 蛋白的c 端( 5 0 0 7 0 2 a a ) ，经 过n i n t ah i sr e s 工n 亲和柱纯化后，用t h r o m b i n 酶切将t r e x ap a n n e r 去除。纯 化后的蛋白与a k t 激酶，y 一起孵育，g s t 和g s k 3b 蛋白作为阴性和阳性对 照。如图2 a ，b 所示，a k t 能够磷酸化n f a r l 5 0 0 一7 0 2 a 。，并且磷酸化程度与a k t 或 n f a r l 蛋白量成剂量反应关系；a k t 不能磷酸化n f a r l s 6 4 7 a 5 0 0 一7 0 2 a a ，即使它的 蛋白量是野牛型的5 倍。 体内磷酸化的证明是在c h 0 细胞中进行的，共同转入组成激活型a k t ( a k t c a ) 或失活多：芩乏型a k t ( a k t k d ) 与m y ct a g 的n f a r l 幂口n f a r l s 6 4 7 a 。 用m y c 抗体沉淀下共转细胞中的n f a r l 蛋白，并用a k t 底物磷酸化抗体检测n f a r l 的s 6 4 7 位磷酸化水平。这个抗体特异性识别a k t 底物保守序列( r x r x x s ) 中丝 氨酸的磷酸化水平。如图2 c 所示，n f a r l s 6 4 7 位的磷酸化可以在共转野生型n f a r l 和a k t c a 细胞的免疫沉淀复合物中检测到，而无论在野生型n f a r l 和a k t k d 共转或n f a r 卜s 6 4 7 a 和a k t c a 共转的细胞免疫沉淀复合物中都没有发现这样的 磷酸化条带。 从以上两个实验中我们可以得出a k t 能够在体外和体内磷酸化n f a r l ，n f a i 1 是a k t 的底物。 a akt + n f a r l ( 5 0 0 7 0 2 a a )一一0 2 50 5124 n f a r l s 6 4 7 af 5 0 0 - 7 0 2 a a ) 一 5 一一一一一 g s t2 一一一 一一 g s - ( 3 且一一一一 一一一 ( 0 5 u n i t ) ( ug ) ( ug ) ( ug ) ( ug ) 复旦大学博f j 论文结果 b c a k t n f a r l ( 5 0 0 一7 0 2 a a ) n f a r l s 6 4 7 a ( 5 0 0 - 7 0 2 a a l g s t g s k 3b n f a r l 一 g s k 3e j 22 o 10 2 5o 512 一 一 + 一5 一一一一_ 2 一一_ 一- 一一一- 一 0 1 一 一 1 ( u n i t ) ( 1ug ) ( ug ) ( ug ) ( i 工g ) n f a r l g s t a k l - c a 一 + a k t - k d 专 一 m v c n f a r 1 ：； + m y c - n f a r 一1s 6 4 7 a n f a r i g g 上 l w b ：a n t i m y c l p ：a n t i - m y c n f a r l g g w b + + i p ：a n t i - m y c k t 图2a k t 磷酸化n f a r ls 6 4 7 位于体内体外a ，b ) 不同浓度原核表达的n f a r l ， n f a r l s 6 4 7 a ，g s t ( 阴性对照) 和g s k 3b ( 阳性对照) 分别于不同浓度a k t 激酶，lu 】y 一。p 标已的a t p ( 1 0 m c i m 1 ) ，激酶缓冲液共同孵育3 0 分钟。s d s p a g e 胶分离蛋白并放射自显影。 对应的蛋白量用考马思亮蓝染色c ) m y c n f a r ll ja k t c a 、a k t _ k d ，m y c n f a r l s 6 4 7 a 与 a k t c a ) 转入c 1 1 0 细胞。3 6 小时后，细胞中含m y cl a g 的蛋白被m y c 抗体扫c 淀，左图显示 杉c 淀下的蛋向量，右图是用人k t 底物磷酸化抗体检测n f a r l 在体内磷酸化。 2 8 复旦人学博士论文结果 三n f a r l s 6 4 7 磷酸化调节工l 一2m r n a 稳定性 以前研究结果表明n f a r l 是结合于i l 一2m r n a3 u t ra u 富集区的蛋白，并 且可以延缓i l 一2m r n a 的降解。s 6 4 7 位正是位于与r n a 结合相关的r g gd o m a i n ， 这使我们非常好奇s 6 4 7 磷酸化会不会是n f a r l 稳定i l 一2m r n a 过程中的重要环 节。我们构建失磷酸化突变，将6 4 7 位丝氨酸位突变为丙氨酸( n f a r l s 6 4 7 a ) 。 将m y c n f a r l ，m y c n f a r l 一s 6 4 7 a 或c m v m y c 转入j u r k a tt 细胞，1 8 j 、时后力口 入p m a 和c a 外载体a 2 3 1 8 7 以增加i l 一2 转录，孵育5 小时后加入环孢菌素a ( c s a ) 特异性终i i ：i l 一2 转录，每隔半小时收集r n a 样品，反转录并用r e a 卜t i m ep c r 的方法来定量。结果表明转染c m v m y c 载体的细胞i l 一2m r n a 降解很快，半衰期 人约3 0 分钟左右；转染m y c n f a r l 质粒的细胞中i l 一2 m r n a 的半衰期延长到约 6 0 分钟；而在转染m y c n f a r l s 6 4 7 a 的细胞中没有发现对i l 一2 m r n a 的稳定作用， i l 一2 m r n a 的半衰期和转染c m v m y c 空载体的绌胞类似。为了进一步说明问题， 将n f a r l6 4 7 位丝氨酸突变为谷氨酸( n f a r l s 6 4 7 e ) ，模拟n f a r l s 6 4 7 位被磷酸 化的状态。结果发现转染表达n f a r l s 6 4 7 e 质粒的j u r k a t 细胞中，i l 一2 m r n a 比 转染n f a r l 的细胞还要稳定。通过以卜的结果，我们得出s 6 4 7 位的磷酸化对 n f a r l 稳定i l 一2 m r n a 来说是非常重要的。 1 c z 笔o 8 e q 土0 6 - _ 皇0 4 j j 哼0 2 2 o o0 511 52 焉s 脚a 辎劝螂e c s ai nc u i t u r e 2 9 h o u r s