DBS 13003—2015 食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定 高效液相色谱法

 1附件 32016-发布 2016-实施DBS13河 北 省 地 方 标 准DBS 13/0032015食品安全地方标准食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定 高效液相色谱法（征求意见稿）河 北 省 卫 生 和 计 划 生 育 委 员 会  发 布DBS 13/00320152前言本标准按照GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写的规则起草。本标准由河北省卫生和计划生育委员会提出并归口。本标准起草单位: 河北出入境检验检疫局检验检疫技术中心。本标准主要起草人：艾连峰、康占省、马育松、李玮、王敬。本标准的附录A为资料性附录。本标准系首次发布。DBS 13/00320153食品安全地方标准食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定 高效液相色谱法1范围本标准规定了食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的高效液相色谱测定方法。本标准适用于食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定。2原理不同的样品基质采用不同方法进行提取，提取液过滤后用高效液相色谱分离测定，色谱峰保留时间定性，外标法定量。3规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用成为本标准的条文。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用于本标准,然而,鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法4试剂和材料除另有规定外，试剂均为分析纯，实验用水符合 GB/T 6682要求。4.1甲醇：色谱纯。4.2磷酸二氢铵(NH 4H2PO4)。4.3亚铁氰化钾K 4Fe(CN)63H2O。4.4乙酸锌Zn(CH 3COO)22H2O。4.5氢氧化钠(NaOH)。DBS 13/003201544.60.25 mol/L 亚铁氰化钾溶液：称取 106 g 亚铁氰化钾 (4.3)加水溶解并定容至 1000 mL。4.71.0 mol/L 乙酸锌溶液：称取 220 g 乙酸锌(4.4)加水溶解并定容至 1000 mL。4.80.1 mol/L 磷酸二氢铵溶液：称取 11.5 g 磷酸二氢铵 (4.2)加水溶解并定容至 1000 mL。4.920 g/L 的氢氧化钠溶液：称取 20 g 氢氧化钠(4.5) 加水溶解并定容至 1000 mL。4.10标准品：苯甲酸钠(CAS#：532-32-1）、山梨酸钾（ CAS#：24634-61-5）、脱氢乙酸钠（CAS# ： 4418-26-2）、糖精钠（CAS#：24634-61-5）和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）（CAS# ：33665-90-6），纯度均大于或等于 98%。4.11标准储备液：分别称取适量标准品(4.10)(精确至 0.1 mg)，糖精钠需 120 烘干 4 小时，冷却至室温时称取。脱氢乙酸钠用 20 g/L 的氢氧化钠溶液（4.9）溶解，其余物质用水溶解，分别配制成含苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）1.0 mg/mL 的标准储备液。0-4 保存，可使用 3 个月。4.12混合标准中间液：分别准确吸取 10 mL 苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的标准储备液（4.11）于 100 mL 容量瓶中，用水稀释配制成 100 g/mL的混合标准中间液。0-4 保存，可使用 1 个月。4.13混合标准工作液：根据实验需要吸取适量的混合标准中间溶液(4.12)，用水分别配置成浓度为 0 g/mL、1 g/mL、5 g/mL、10 g/mL、20 g/mL、50 g/mL 的混合标准工作溶液，现用现配。4.14微孔滤膜：0.45 m，水系。5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：配有紫外检测器或二极管阵列检测器。5.2离心机：转速不低于 3 000 r/min。5.3超声清洗机。5.4涡旋混合器。5.5天平：感量分别为 0.01 g 和 0.1 mg。6分析步骤6.1样品处理   DBS 13/00320155糕点、饼干、肉制品、奶油、蔬菜、果酱、豆干、坚果含蛋白的、调味品、植物蛋白饮料、乳酸饮料、乳及乳制品等含蛋白样品固态或半固态样品称取 2.5 g5 g（精确至 0.01 g） 、液态样品称取 2.5 g10 g（精确至0.01 g） ， （精确至 0.01 g）于 25 mL 容量瓶中，加入 2.0 mL 亚铁氰化钾溶液（4.6） ，摇匀，再加 2.0 mL 乙酸锌溶液（4.7）摇匀，接着加水至约 20 mL，超声提取 20 min，然后用水定容至刻度，混匀，移入离心管中，3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经微孔滤膜（4.14）过滤，滤液待上机分析。碳酸饮料、果酒、调味品、葡萄酒等不含蛋白样品称取 2.5 g10 g 制备均匀的样品（精确至 0.01 g）于 25 mL 容量瓶中，直接加水至约20 mL，超声 20 min，然后用水定容至刻度，混匀，移入离心管中，3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经微孔滤膜（4.14 ）过滤，滤液待上机分析。果冻、糖果、蜂蜜等样品称取 2.5 g5 g 制备均匀的样品（精确至 0.01 g）于 25 mL 容量瓶中，加水适量，置70 水浴中将样品完全溶解后再超声提取 20 min，放置室温后用水定容至刻度，混匀，移入离心管中，3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经微孔滤膜（4.14）过滤，滤液待上机分析。蜜饯凉果类样品称取 2.5 g5 g 制备均匀的样品（精确至 0.01 g）于 25 mL 容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，放置 8 h 后超声提取 20 min，移入离心管中，3 000 r/min 离心 10 min，取上清液，经微孔滤膜（4.14）过滤，滤液待上机分析。6.2高效液相色谱参考条件a ) 色谱柱： C18 柱，150 mm4.6 mm，5 m，或性能相当的色谱柱；b) 流动相：0.1 mol/L 磷酸二氢铵溶液（A） （4.8）+甲醇（B） ；梯度洗脱，洗脱条件见表 1；c) 流速： 1.0 mL/min；d) 检测波长：230 nm；e) 进样量： 20 L。表 1 梯度洗脱条件时间（min） A（%） B（% ）DBS 13/003201560 95 53 95 513 65 3520 65 3520.1 95 525 95 56.3测定在仪器最佳状态下测定混合标准工作溶液和样液，或参差进样，保证所测样品中待测物的响应值均在线性范围内，如果超出标准曲线范围，应用水对样液进行适当稀释。以待测物的峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准工作曲线。以保留时间定性，外标法定量。7结果计算样品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠(以糖精计)和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的含量按式（1）计算：.(1)10mVCX式中：X 样品中被测物含量，单位： g/kg；C 由标准曲线得出的样液中被测物的浓度，单位：g  /mL；V 样品溶液定容体积，单位： mL；m 样品质量，单位：g。计算结果保留两位有效数字。8精密度在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的 10%。 9定量限当取样量为 2.5 g 时，乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）定量限为 3 mg/kg、苯甲酸和山梨酸定量限为 2 mg/kg、脱氢乙酸和糖精钠(以糖精计)定量限为 4 mg/kg；当取样量为 5.0 g 时，乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）定量限为 1.5 mg/kg、苯甲酸和山梨酸定量限为 1 mg/kg、脱氢乙酸和糖精钠(以糖精计)定量限为 2 mg/kg；当取样量为 10 g 时，乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）定量限为 1 mg/kg、苯甲酸和山梨酸定量限为 0.6 mg/kg、脱氢乙酸和糖精钠(以糖精计)定量限为 1.5 mg/kg。DBS 13/00320157DBS 13/00320158A A附录A（资料性附录）标准色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU01020304012314.319541 安赛蜜；2 糖精；3 苯甲酸；4 山梨酸；5 脱氢乙酸。DBS 13/00320159食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定 高效液相色谱法编制说明一、 任务来源本标准的制定工作是 2015 年由河北省卫生和计划生育委员会组织并批准的。标准名称为食品中苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）的测定 高效液相色谱法 ，计划编号：DBS 13/003-2015，由河北检验检疫局检验检疫技术中心承担了此项制标工作。二、 制标依据本标准按照 GB/T 1.1-2009 标准化工作导则 第 1 部分：标准的结构和编写规则 、GB/T 20001.4-2001标准编写规则 第 4 部分：化学分析方法和 GB/T 27404-2008 实验室质量控制规范 食品理化检测的要求进行编写制订的。三、 标准编制起草过程此项食品安全地方标准是河北检验检疫局检验检疫技术中心根据我国现行标准情况以及现实需求，提出了该标准的立项建议书，经河北省卫生和计划生育委员会食品处组织的两次专家论证后得以立项并签订委托协议，技术中心迅速成立了编制起草组，并开始了DBS 13/003201510研制工作。编制起草组在查阅国内外相关文献以及标准方法后，在前处理过程以及高效液相色谱条件上进行了细致优化，在方法线性、回收率、精密度等方面进行了验证，基本确定了检测方法，形成了标准的草案稿。在此基础上，编制起草组在 2016 年 1 月 19 日组织了专家论证会，邀请了河北省疾病预防控制中心、河北医科大学、河北省卫生和计划生育委员会综合监督执法局、河北三元食品有限公司的专家对该标准的草案稿进行了审评。按照专家的意见和建议，起草组对标准方法进行了的修改，参照 GB 2760 对这 5 个分析对象的要求选取了 15 种代表性基质样品（基本覆盖了 GB 2760 中涉及的食品）进行了室内的方法验证。在室内验证结束后，编制起草组选择了河北省食品检验研究院、河北省疾病预防控制中心和石家庄市疾病预防控制中心三家实验室进行了室间验证。室内和室间验证结果表明方法的精密度、回收率良好，符合相关规定。在形成了送审稿后，编制起草组在 2016 年 4 月 1 日又组织了专家论证会，邀请了检验一线的专家对送审稿的内容进行了逐条审阅。专家在标准内容的表述、文本格式、技术内容阐述等多方面提出了修改意见和建议，起草组在与专家充分研讨后，对标准的文本及编制说明进行了修改完善，最终形成了标准送审稿。主要起草人：艾连峰、康占省、马育松、李玮、王敬四、 编制背景防腐剂是指为防止食品腐败，变质，延长食品保存期，抑制食品中微生物繁殖的物质。根据 GB 2760 食品添加剂使用标准，DBS 13/003201511我国规定使用的防腐剂有苯甲酸及其盐、山梨酸及其盐、对羟基苯甲酸酯类、丙酸及其盐、脱氢醋酸等。其防腐作用机理主要有使微生物蛋白质凝固和变性，干扰其生长和繁殖。人工合成甜味剂按照结构的不同可以分为磺胺类（糖精钠，安赛蜜），二肤类，蔗糖衍生物三类。人工合成的甜味剂在人体内不进行代谢吸收，不提供热量或因为其用量极低，而热量供应少，且甜度是蔗糖的几十倍至几千倍，又被称为非营养型甜味剂或高倍(高甜度) 甜味剂。防腐剂和甜味剂是食品添加剂中最重要的项目，与其他添加剂相比具有使用量大、使用面广且部分项目具有卫生学意义的特点，因此是食品产品卫生标准中重要的指标。国内外对此均制定了大量的标准，是国际贸易和国内标准中考察的重要项目。我国食品添加剂检测标准（见参考文献）多是单个项次或单类项目测定，再加上食品本身成分复杂，添加剂用量少，不易检测等原因，使食品添加剂检测方法的研究存在一定的难度，也对相关部门的监督管理工作造成了障碍。现有检测依据主要为液相色谱法和气相色谱法，但现实中调味品、饮料、乳制品等食品中食品添加剂的使用常常是多项目的同时添加，完成全部检测工作往往需要动用不同的仪器设备及前处理试剂, 即使同一种仪器法，所用仪器条件也各不相同，检测过程较为繁琐，效率低下，检测成本高，有机废液排放多。因此不断更新优化检测方法和手段，研究高通量多项次的同时测定方法一直是进行食品添加剂安全监管的重要手段。本标准按照 GB 2760 食品安全国家标准 食品添加剂使用标准DBS 13/003201512中山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、糖精钠及安赛蜜的限量要求及添加范围（见表 1），参考了现行的相关标准方法和文献，建立了高效液相色谱法同时分离测定食品中 5 种常用防腐剂和甜味剂的检测方法，通过优化样品前处理条件和仪器条件，使得该研究建立的标准方法具有简单、快速、准确、适用范围宽、检测项目多，实用性强等特点，从而弥补了现有国家标准覆盖基质面窄、不能一次分析多种目标物、前处理方法多样、繁琐，检测成本高，结果的准确性有待提升的缺陷。表 1 GB 2760 中山梨酸、苯甲酸、脱氢乙酸、糖精钠及安赛蜜的限量要求及添加范围最大使用量 g/kg食品分类号 食品名称安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸01.02.02 风味发酵乳 0.35 01.06 干酪和再制干酪及其类似 品 1.0 01.07以乳为主要配料的即食风味食品或其预制产品(不包括冰淇淋和风味发酵乳)0.3 02.01.01.02 氢化植物油 1.0 02.02.01.01 黄油和浓缩黄油 0.302.02.01.02人造黄油（人造奶油）及其类似制品（如黄油和人造黄油混合品） 1.0 03.0 冷冻饮品（食用冰除外） 0.3 0.15 03.03 风味冰、冰棍类 0.3 0.15 1.0 0.5 04.01.01.02 经表面处理的鲜水果 0.5 04.01.02.02 水果干类（仅限芒果干、 无花果干） 5.0 04.01.02.04 水果罐头 0.3 04.01.02.05 果酱 0.3 0.2 1.0 1.0 04.01.02.08 蜜饯凉果 1.0 0.5 0.5 04.01.02.08.01 蜜饯类 0.3 1.0 0.5 0.5 04.01.02.08.02 凉果类 5.0 0.5 0.5 DBS 13/003201513食品分类号 食品名称 最大使用量 g/kg安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸04.01.02.08.04 话化类 5.0 0.5 0.5 04.01.02.08.05 果糕类 5.0 0.5 0.5 04.02.01.02 经表面处理的新鲜蔬菜 0.5 04.02.02.03 腌渍的蔬菜 0.3 0.15 1.0 1.0 1.004.03.02 加工食用菌和藻类 0.3 0.5 04.03.02.03 腌渍的食用菌和藻类 0.3 0.5 0.304.04.01.03 豆干再制品 1.0 04.04.01.05新型豆制品（大豆蛋白及其膨化食品、大豆素肉等） 1.0 1.0 04.04.01.06 熟制豆类 1.0 04.04.02 发酵豆制品 0.304.05.02.01 熟制坚果与籽类 3.0 04.05.02.01.01 带壳熟制坚果与籽类 3.0 1.2 04.05.02.01.02 脱壳熟制坚果与籽类 3.0 1.0 05.02 糖果 2.0 05.02.01 胶基糖果 4.0 1.5 1.5 05.02.02 除胶基糖果以外的其他糖 果 2.0 0.8 1.0 06.04.02.01 杂粮罐头 0.3 06.04.02.02 其他杂粮制品（仅限杂粮 灌肠制品） 0.3 1.5 06.05.02 淀粉制品 1.006.07 方便米面制品（仅限米面 灌肠制品） 1.5 06.09 谷类和淀粉类甜品（仅限 谷类甜品罐头） 0.3 07.0 烘烤食品 0.3 07.01 面包 0.3 1.0 0.507.02 糕点 0.3 1.0 0.507.04 烘烤食品馅料及表面用挂 浆 0.3 1.0 0.508.02 预制肉制品 0.508.03 熟肉制品 0.075 0.508.03.05 肉灌肠类 1.5 0.509.03 预制水产品（半成品） 0.075 09.03.04 风干、烘干、压干等水产 品 1.0 DBS 13/003201514食品分类号 食品名称 最大使用量 g/kg安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸09.04 熟制水产品（可直接食用） 1.0 09.06 其他水产品及其制品 1.0 10.03 蛋制品（改变其物理性状） 1.5 11.04 餐桌甜味料 0.04g/份 11.05 调味糖浆 1.0 1.0 12.0 调味品 0.5 12.03 醋 0.5 1.0 1.0 12.04 酱油 1.0 1.0 1.0 12.05 酱及酱制品 0.5 1.0 0.5 12.10 复合调味料 0.15 0.6 1.0 0.512.10.02 半固体复合调味料 0.15 1.0 1.0 0.512.10.03 液体复合调味料（不包括 12.03,12.04） 0.15 1.0 1.0 0.514.0 饮料类（包装饮用水除外） 0.3 0.5 14.02.01 果蔬汁（浆） 0.3 0.5 0.314.02.02 浓缩果蔬汁（浆）（仅限 食品工业用） 0.3 2.0 2.0 14.02.03 果蔬汁（浆）饮料 0.3 1.0 0.5 14.03 蛋白饮料 0.3 1.0 0.5 14.03.01.03 乳酸菌饮料 0.3 1.0 14.04 碳酸饮料 0.3 0.2 0.5 14.05 茶、咖啡、植物（类）饮 料 0.3 1.0 0.5 14.07 特殊用途饮料 0.3 0.2 0.5 14.08 风味饮料 0.3 1.0 0.5 15.02 配制酒 0.15 0.4 0.4 15.03.01 葡萄酒 0.2 15.03.03 果酒 0.8 0.6 16.01 果冻 0.3 0.5 16.03 胶原蛋白肠衣 0.5 注：GB 2760-2014 中糖精钠以糖精计，表格中 “”代表不允许添加。五、 主要实验技术论证实现山梨酸、苯甲酸、糖精钠、安赛蜜及脱氢乙酸 5 种防腐剂DBS 13/003201515和甜味剂同时测定的关键在于建立能够保证回收率的前处理条件以及能保证完全分离分析的色谱条件。我们重点在这两个方面进行了实验探索。（一）前处理条件的选择参考文献及现有标准，含有蛋白质或脂肪的样品如糕点、饼干、肉制品、植物蛋白饮料、乳及乳制品、奶油等样品，需要沉淀蛋白或脂肪，进行简单的净化。本标准采用加入亚铁氰化钾和乙酸锌溶液作为蛋白沉淀剂，对上述样品基质均能达到净化作用，提取液离心后均澄清，沉淀蛋白效果显著，且不影响方法的提取效率。果冻、糖果等样品，直接加水超声难以溶解，影响提取效率，实验采用 70水浴将样品完全溶解后再超声提取。汽水、可乐等饮料中所含的二氧化碳，可能会造成进样量不准，压力波动，气泡峰等问题，最终影响定量。因此在进样前应先将其除掉。GB/T 124562008食品中总酸的测定 中实验采用将试样加热煮沸搅拌除去二氧化碳，此操作繁琐、耗时。实验对比了超声脱气法，考察了超声时间(5 min ，10 min， 20 min)对脱气效果的影响，最终选定超声 20 min，气泡完全消失。对于蜜饯类样品，现有标准均没有提出明确的提取方法，若采用现有标准方法（GB）用水超声提取或用 60-70 水加热提取 30 min，均不能将分析物提取完全，再次提取仍能够检出一定量的目标物。这可能是此类样品的制样环节较难，用常规的粉碎机不能将其粉碎，只能采用剪刀尽可能剪碎的方式制样，所以在提取时需要改进方法。针对这一现状，我们实验了用水浸泡提取，浸泡时间对提取影响较大，考察结果见表 2。由结果可知样品在浸泡 8 小时后，分析物的值不再升高，说明已提取完全。所以本标准对蜜饯凉果类DBS 13/003201516样品采用水浸泡 8 小时以上的方式提取。表 2 浸泡不同时间测得值（g/kg ）浸泡时间样品 分析物0 h 4 h 8 h 24 h糖精钠 2.4 3.4 3.5 3.5杨梅苯甲酸 0.22 0.24 0.27 0.27旺梅 糖精钠 0.40 0.42 0.49 0.50话梅 糖精钠 1.9 2.8 3.0 3.0山楂 苯甲酸 0.069 0.074 0.087 0.088甘草杏 山梨酸 0.08 0.11 0.14 0.14对于酱油、醋、饮料、果酒、葡萄酒等液体样品，基质简单，其主要成分为水，加水稀释上机即可获得满意的效果，平均回收率可达到 90%以上。对比现有国标方法：GB/T 23377-2009食品中脱氢乙酸的测定样品需要调 pH 值，固相萃取柱净化。GB/T 5009.140-2003饮料中乙酰磺胺酸钾的测定样品需过中性氧化铝柱。而 GB/T 23495-2009食品中苯甲酸、山梨酸和糖精钠的测定 高效液相色谱法中无蜜饯类样品的提取方法，所以本方法的适用性更宽、前处理方法更为便捷。（二）流动相条件的优化防腐剂和甜味剂的检测多使用乙酸铵溶液-甲醇作为流动相。实验对比了乙酸铵溶液的浓度、pH 值、甲醇的比例、等度洗脱、梯度洗脱以及在不同色谱柱上对目标物保留效果的影响。结果发现 pH的微小变化（5.13，5.85， 6.35，6.52，6.71 ，8.00）对出峰顺序、响应值、分析时间及分离度均有很大影响。当 pH 为 6.52 时，峰型及分离度最佳。采用等度洗脱条件时，乙酸铵溶液与甲醇的比例对出峰时间、响应值、总出峰时间及分离度也有很大影响。梯度洗脱DBS 13/003201517也不能有效改善分离情况。其最佳分离条件为 95%的乙酸铵溶液（20 mmol/L，pH6.52）加 5%甲醇等度洗脱，选用 150 mm4.6 mm，5.0 m 色谱柱时，苯甲酸、安赛蜜、山梨酸出峰时间太快，不利于目标物与杂质的分离（见图 1） 。而选用 250 mm4.6 mm，5.0 m 色谱柱时，苯甲酸、安赛蜜、山梨酸保留时间和分离度均有所改善，但脱氢乙酸的峰型变差，有拖尾现象（见图 2） 。min2 4 6 8 10 12 14 16 18mAU0100200300400500600苯甲酸安赛蜜山梨酸糖精钠脱氢乙酸图 1 乙酸铵溶液 (pH6.52)-甲醇为流动相条件下的色谱图(150 mm4.6 mm，5.0 m)DBS 13/003201518min2 4 6 8 10 12 14 16 18mAU050100150200250300350安赛蜜苯甲酸山梨酸糖精钠脱氢乙酸图 2 乙酸铵溶液 (pH6.52)-甲醇为流动相条件下的色谱图(250 mm4.6 mm，5.0 m)为改善脱氢乙酸的峰型以及分析物的分离，方法考察甲醇-水流动相体系，无论如何调整流动相比例，脱氢乙酸的峰型均未改善。然后，调节流动相的酸度，加入不同含量乙酸（0.2%，0.1% ，0.01%）来改善分离条件，仍无法改善峰型，且分离度变差：糖精钠和脱氢乙酸的色谱峰部分重叠，无法完全分离（见图 3） 。DBS 13/003201519图 3 甲醇-0.01%乙酸（10+90）为流动相的色谱图(150 mm4.6 mm，5.0 m)考察以磷酸铵缓冲溶液作为流动相时的色谱行为。结果发现磷酸氢二铵（pH=7.90）的流动相较难洗脱分析物，即使调整梯度条件可以将 5 种目标物完全洗脱，也无法使苯甲酸山梨酸完全分离，其最佳分离效果如图 4。而磷酸二氢铵（pH=4.50）作为流动相可以获得更佳的分离效果。然后，我们对其浓度进行了考察，结果发现 0.1 mol/L 磷酸二氢铵溶液在梯度洗脱条件下得到了较好的分离、峰型及响应值，如图 5 所示。min5 10 15 20 25mAU-200204060803.0775.17310.18010.37411.134图 4 磷酸氢二铵 -甲醇为流动相梯度洗脱条件下的色谱图DBS 13/003201520min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5mAU0100200300400500600700 安赛蜜糖精钠苯甲酸山梨酸脱氢乙酸图 5 磷酸二氢铵-甲醇为流动相梯度洗脱条件下的色谱图（初始比例 85%，甲醇最高比例为 40%）在梯度洗脱条件的选择上，甲醇初始比例分别为40%、 30%、25%、20% 、15%和 5%时， 均能将 5 种目标物完全分离。但在分析实际样品时发现，当甲醇比例增高时，基线漂移会增大，且容易与基质干扰峰重叠，所以，根据实际样品的验证，我们确定了表 3 的梯度洗脱条件，在此条件下的色谱图见图 6。表 3 梯度洗脱程序 时间（min） 流速（mL/min） 0.1 mol/L 磷酸二氢铵（%） 甲醇（%）0 1.0 95 53 1.0 95 513 1.0 65 3520 1.0 65 3520.1 1.0 95 525 1.0 95 5DBS 13/003201521min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU010203040安赛蜜糖精钠苯甲酸山梨酸脱氢乙酸图 6 确立的流动相梯度洗脱条件下的色谱图 （三） 色谱柱的选择色谱柱的类型对 5 种分析物也有一定的影响。以国标中的乙酸铵溶液为流动相，实验对比了不同填料类型(ZORBAX SB-Aq，C 18，GOLD Aq，ODS-3， Supersil C18)、厂商(Agilent, FHIFEIDO，Thermo，  Intersil， GOOD BROTHER)、长短(150 mm， 250 mm)色谱柱的分离效果（具体规格见表 4） 。结果发现，脱氢乙酸均有一定程度的拖尾；而在磷酸二氢铵-甲醇为流动相梯度洗脱条件下，Agilent 的 ZORBAX SB-Aq 和 C18分离效果、色谱峰形等色谱行为最佳，其他色谱柱也分离开 5 种化合物，但脱氢乙酸仍会有拖尾现象，但优于乙酸铵的流动相体系。表 4 不同类型的色谱柱的信息序号 名称 规格1 Agilent ZORBAX SB-Aq 150 mm4.6 mm，5.0 m2 Agilent  C18 150 mm4.6 mm，5.0 m3 FHIFEIDO 资生堂 C18 150 mm4.6 mm，5.0 m4 CAPCELL  PAK C18 150 mm4.6 mm，5.0 mDBS 13/003201522序号 名称 规格5 CAPCELL  PAK C18 250 mm4.6 mm，5.0 m6 Thermo GOLD Aq 250 mm4.6 mm，5.0 m7 Intersil ODS-3 250  mm4.6 mm，5.0 m六、 方法的验证（一）方法的线性范围和相关系数根据分析物的灵敏度，分别配制含苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸、糖精钠和乙酰磺胺酸钾（安赛蜜）质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 g/mL 的混合标准溶液，在选定的色谱条件下进行测定，进样量为 20 L，用峰面积对混合标准溶液中各组分的浓度做图，其线性方程、线性相关系数及线性图如表 5 和图 7 所示，分析物在浓度范围为 0.250.0 g/mL 内，线性关系良好。表 5 方法线性回归方程及相关系数分析物 线性回归方程 r安赛蜜 Y=60.31420X-0.209984 1.00000糖精钠 Y= 43.85585X+ 0.554222 1.00000苯甲酸 Y= 80.07134X-1.04858 1.00000山梨酸 Y=83.31271X+1.16555 1.00000脱氢乙酸 Y=64.27667X-6.28711 0.99998DBS 13/003201523安赛蜜                          糖精钠 苯甲酸                          山梨酸 脱氢乙酸图 7 方法的线性回归曲线图DBS 13/003201524（二）方法的检出限、回收率和精密度本标准方法涉及的 5 种食品添加剂在不同食品中最大添加量相差较大，样品基质类别较多，性质迥异，同时分析对象的仪器灵敏度也不相同，综合考虑，根据最终样液所代表的试样量、定容体积、进样量和进行测定时所受的干扰情况，以 10 倍信噪比确定了方法在不同取样量时的定量限（见正文 9 定量限） ，低于 GB 2760 对这 5 种食品添加剂的最低使用量，满足国内外标准的限量要求。本标准方法的室内回收率和精密度实验，以不含目标物的奶油、饮料（含糖精钠，扣本底） 、蜂蜜、酸奶、梨、芒果酱、豆腐泡、杏仁、糖果、饼干、香肠、鱼干、醋、蜜饯、酒为空白样品基质，在三个添加水平上进行了添加回收率实验，每个水平重复做 6 次，回收率范围为 80.0%120.0%, 相对偏差在 0.29%9.83 % 之间，详细结果见表 6，其样品空白及添加色谱图见图 8-1 到图 8-30。表 6 不同基质的添加回收数据（n=6）安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸基质 加标水平 mg/kg 回收率%RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD5 97.7 0.84 103.0 1.62 100.7 1.62 90.0 1.99 85.3 4.3610 93.0 1.18 97.7 0.84 95.3 1.43 86.7 1.40 82.3 2.51奶油50 90.8 0.63 94.4 0.86 90.8 0.92 85.7 1.53 85.7 3.985 98.3 4.15 90.0 7.03 105.0 5.22 106.7 3.83 102.5 5.1210 102.5 8.73 95.4 4.51 104.6 1.80 92.1 3.17 118.8 2.21饮料50 105.8 1.33 102.5 0.93 105.6 0.82 96.3 1.53 117.6 1.555 100.0 9.49 115.0 6.15 97.5 8.43 101.7 8.03 102.5 7.4010 114.2 4.08 115.8 2.23 107.9 6.46 114.2 7.02 110.8 3.08蜂蜜50 102.9 3.27 103.2 2.56 104.6 2.86 104.8 3.34 115.1 3.43酸奶 5 104.7 2.31 102.7 7.15 114.7 1.80 87.7 3.03 101.0 6.83DBS 13/003201525基质 加标水平 mg/kg安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD10 105.7 5.41 110.2 4.46 106.0 5.30 101.0 5.64 96.3 5.1650 115.0 1.38 120.0 0.70 105.3 1.33 112.9 1.62 103.9 2.225 97.2 2.10 107.7 2.01 107.2 1.61 103.3 3.28 84.7 2.3210 99.1 3.25 98.9 5.45 104.8 3.09 106.2 4.43 89.6 2.98梨50 99.8 0.66 100.3 0.67 101.4 0.83 103.3 0.56 103.4 0.925 115.7 8.91 110.7 3.90 115.0 3.61 109.3 3.78 104.0 5.4410 111.7 1.46 109.7 1.60 111.5 1.94 105.8 2.27 107.0 4.05芒果酱50 112.1 0.79 114.3 0.74 108.1 1.12 108.9 0.38 103.6 5.055 113.5 2.21 116.3 1.93 116.7 2.08 103.2 3.32 108.2 9.8310 102.6 2.03 115.0 1.92 117.3 1.68 112.3 3.62 104.5 8.13豆腐泡50 110.0 5.99 107.6 6.32 113.4 4.70 107.2 3.44 111.9 4.495 85.3 9.31 86.3 4.79 118.0 6.13 82.0 4.29 85.7 4.4110 83.8 6.57 85.4 5.00 95.7 6.25 81.7 3.37 84.5 4.99杏仁50 85.5 6.87 86.7 6.07 83.6 4.75 84.0 7.31 83.7 3.265 105.0 1.48 105.5 1.77 106.8 1.50 99.7 2.43 100.3 4.5310 102.4 2.65 102.3 1.95 102.9 1.93 95.8 2.42 98.7 2.50糖果50 98.0 4.22 98.3 4.18 97.9 4.15 98.8 4.20 100.7 3.215 94.7 2.56 91.0 5.34 103.0 1.62 86.0 5.50 92.0 9.4310 89.8 2.94 112.5 3.84 104.5 5.20 82.7 1.65 94.2 8.21饼干50 93.8 5.44 100.4 4.28 99.3 7.23 89.7 5.29 86.7 5.625 80.0 2.50 98.8 7.72 82.0 3.86 85.0 6.18 90.0 8.7810 95.3 5.62 91.1 1.41 89.3 1.57 81.7 0.74 91.2 1.65香肠50 82.7 1.77 83.2 1.53 82.2 2.41 81.2 1.72 80.8 1.485 102.3 7.95 108.7 2.51 108.3 0.75 92.0 6.87 84.3 7.1010 95.5 8.02 106.7 8.08 106.0 5.30 92.2 5.55 86.8 6.07鱼干50 104.1 4.81 101.1 1.33 98.0 1.07 89.4 1.42 90.2 6.195 119.7 0.43 111.8 3.73 111.2 2.51 105.3 0.78 102.3 1.7110 115.1 1.89 104.4 1.53 103.4 2.94 104.4 3.43 96.8 2.30醋50 103.2 0.29 100.8 0.61 101.2 0.43 101.7 1.22 101.5 1.255 100.0 3.16 91.0 5.60 92.7 2.33 84.3 3.57 93.7 7.0110 104.6 1.43 104.9 5.13 98.8 2.02 95.3 3.18 98.7 5.65蜜饯50 106.6 1.28 101.8 1.15 99.8 0.59 99.7 0.65 98.3 2.07酒 5 111.2 0.88 102.5 0.82 104.0 2.51 93.3 1.11 96.3 4.19DBS 13/003201526基质 加标水平 mg/kg安赛蜜 糖精钠 苯甲酸 山梨酸 脱氢乙酸回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD 回收率% RSD10 105.2 0.78 101.3 0.52 102.3 0.59 96.5 3.23 101.2 5.3450 100.7 0.94 99.9 0.99 100.3 1.02 100.8 0.97 97.6 0.94min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU020406080100120图 8-1 奶油样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU0204060801001201401  2  3 4  5DBS 13/003201527图 8-2 奶油样品添加（称样量 2.5g，添加水平 5 mg/kg）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5-20246810122图 8-3 饮料样品空白（称样量 5.0g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.50510152023451  4图 8-4 饮料样品添加（称样量 5.0g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201528min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU02468101  3图 8-5 蜂蜜样品空白（称样量 5.0g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5-100102030123451图 8-6 蜂蜜样品添加（称样量 5.0g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201529min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5050100150200250300图 8-7 酸奶样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2 4 6 8 10 12 14 16 180501001502001  2  3  4  5图 8-8 酸奶样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201530min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5-1001020304050607080图 8-9 梨样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU010203040501  2345图 8-10 梨样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201531min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU01234567图 8-11 芒果酱样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU0510152025303512345图 8-12 芒果酱样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201532min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU020406080100120140160图 8-13 豆腐泡样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU0102030405012345图 8-14 豆腐泡样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201533min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU0204060801001201403图 8-15 杏仁样品空白（称样量 2.5g）色谱图   min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU010203040506070123  45图 8-16 杏仁样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201534min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU-0.500.511.522.533.5图 8-17 糖果样品空白（称样量 2.5g）色谱图  min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU024681012123544图 8-18 糖果样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201535min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU020406080100120图 8-19 饼干样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU0204060801001  2  3454图 8-20 饼干样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201536min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU020406080100120140160图 8-21 香肠样品空白（称样量 2.5g）色谱图   min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU02040608012  3  54图 8-22 香肠样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201537min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU020406080图 8-23 鱼干样品空白（称样量 2.5g）色谱图min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.5mAU010203040506012 345图 8-24 鱼干样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5 mg/kg）色谱图DBS 13/003201538min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 20 22.505101520253035图 8-25 醋样品空白（称样量 2.5g）色谱图   min2.5 5 7.5 10 12.5 15 17.5 2005101520253012345图 8-26 醋样品添加（称样量 2.5g ，添加水平 5