（发酵工程专业论文）产酱香功能细菌的筛选及其特征风味化合物的研究.pdf

摘要 摘要 酱香型白酒是中国白酒四大基本香型之一。其独特的酿造工艺，导致大曲和酒醅中 形成了特殊的微生物区系。高温大曲中的微生物，对于酱香风味的形成尤为重要。因此， 对高温大曲中微生物的研究，有利于揭示酱香的形成机制。本论文对酱香型高温大曲的 产酱香细菌及其发酵特征进行了研究，主要结果如下： 1 ) 采用高温培养、热处理产芽孢和高盐培养三种方法，从酱香高温大曲中成功筛 选得到三株菌落形态各异的产酱香香气的细菌。产酱香细菌在麸皮固体培养基上固态发 酵1 5 d ，产生微弱的酱香；采用麸皮浸出汁进行液态发酵6 d ，发酵液带有明显的酱香香 气，极大地缩短酱香的形成时间。经过初步研究，以麸皮浸出汁作为培养基，在1 5 0r m i n 5 5 高温条件下，三株菌发酵培养6 d 产生明显的酱香香气。经菌株形态、生理生化特 征与1 6 sr d n a 序列分析，三株菌鉴定为地衣芽孢杆菌( b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s ) ； 2 ) b l j ，b l l 1 ，b l l 2 在麸皮浸出汁中发酵培养6 d 后，对其发酵液进行液液萃取。 在萃取相中闻到酱香香气，采用g c m s 分析其挥发性组分。从发酵液中检测到的乙偶 姻、四甲基吡嗪和呋喃扭尔，是与酱香香气有关的重要化合物。乙偶姻、四甲基吡嗪和 呋喃扭尔是这三株菌的特征风味化合物，b l l 1 是产生酱香香气最为强烈的菌株。在菌 株b l l 1 发酵过程中，乙偶姻的含量逐渐减少，四甲基吡嗪的含量不断增加，呋喃扭尔 的含量逐渐减少。四甲基吡嗪是在发酵后期形成的，由乙偶姻转化生成； 3 ) 5 5 高温环境，是菌株b l l 1 发酵产生酱香香气的重要条件。发酵液中的特征 性化合物四甲基吡嗪的含量，明显高于3 7 、4 5 。发酵4 d ，培养体系中的微生物 已大部分死亡。经过滤除菌后5 5 继续发酵2 d 的发酵产物，比经高温灭菌灭酶后5 5 继续发酵2 d 的发酵产物，形成更强烈的酱香香气。培养体系中存在b l l 1 所代谢的酶， 促进了酱香物质的形成。经过过滤除菌和高温灭菌灭酶后分别5 5 继续发酵2 d 的发酵 液，其中谷氨酸、缬氨酸、亮氨酸的含量，比发酵4 d 的明显降低很多。 关键词：产酱香细菌；乙偶姻：四甲基吡嗪；呋喃扭尔；地衣芽孢杆菌 a b s t r a c t s o ys a u c ea r o m as t y l el i q u o ri so n eo ft h ef o u rb a s i ct y p e si nc h i n a 1 1 1 eu n i q u eb r e w i n g p r o c e s sr e s u l t si nas p e c i a lm i c r o b i a lf l o r ai nd a q ua n df e r m e n t e dg r a i n s m i c r o o r g a n i s m si n l l i 曲t e m p e r a t u r ed a q ua f f e c tt h ef o r m a t i o no fs o ys a u c ef l a v o r s oi ti sh e l p f u lt or e v e a lt h e f o r m a t i o nm e c h a n i s mo f s o ys a u c ef l a v o rt h r o u g ha n a l y s i so fm i c r o o r g a n i s mi nh i g ht e m p e r a - t u r ed a q u i nt h i sp a p e r ，s t r a i n sp r o d u c i n gs o ys a u c ef l a v o rw e r eo b t a i n e df r o mh i g ht e m p e r a - t u r ed a q ua n dc h a r a c t e r i s t i cv o l a t i l ec o m p o u n d so ft h e i rf e r m e n t a t i o nl i q u i dw e r ed e t e c t e d 砀em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 11t h r e es t r a i n so fb a c t e r i aw h i c hc a np r o d u c es o ys a u c ef l a v o rw e r es c r e e n e df r o mh i g h t e m p e r a t u r ed a q u t h e s es t r a i n sp r o d u c e dw e a ks o ys a u c ef l a v o ri nw h e a tb r a nt h r o u g hs o l i d f e r m e n t a t i o nf o r15 d ；t h e yp r o d u c e dv e r ys t r o n gs o ys a u c ef l a v o ri nw h e a t e x t r a c tm e d i u mb y s u b m e r g e df e r m e n t a t i o nf o r6 d t h ec u l t u r ec o n d i t i o n so ft h r e es t r a i n si ns u b m e r g e df e r m e n t a t i o nw e r eo p t i m i z e dp r i m a r i l y a f t e rt h r e es t r a i n sw e r ei n o c u l a t e di nw h e a t e x t r a c tm e d i u m a n dc u l t u r e da t5 5 f o r6dw i t ha na g i t a t i o ns p e e do f15 0r m i n ，l i q u i df e r m e n t a t i o nb r o t h p r o d u c e dv e r ys t r o n gs a u c ef l a v o r t h r o u g ha n a l y s i so fm o r p h o l o g y ，p h y s i o l o g i c a la n d b i o c h e m i c a lc h a r a c t e r i s t i c sa n d16 sr d n as e q u e n c i n g ，t h r e es t r a i n sw e r ei d e n t i f i e da s b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i s 2 ) a f t e rb l j ，b l l1 ，b l l 2w e r ec u l t u r e di nw h e a t e x t r a c tm e d i u mf o r6d 。t h eb r o t h w a sp r e p a r e db yl i q u i d - l i q u i de x t r a c t i o n 1 1 1 ee x t r a c t i o np h a s eo ft h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t ， w h i c hs m e l l e ds a u c ea r o m 钆w a su s e dt oa n a l y z ei t sv o l a t i l ec o m p o n e n t sb yg c m s a c e t o i n t e t r a m e t h y l p y r a z i n ea n df u r a n e o lw h i c hw e r et h r e ei m p o r t a n tc o m p o u n d si ns o ys a u c ea r o m a l i q u o r w e r ed e t e c t e df r o mt h ef e r m e n t a t i o nb r o t h 1 1 1 ec u l t u r e db r o t hw i t hi n o c u l a t i o no f b l j ，b l l1 ，b l - l 2w a sc o m p a r e d 、析t l lt h ec u l t u r e db r o t hw i t h o u ti n o c u l a t i o nb ys e n s o r y e v a l u a t i o n b l l1w a st h es t r a i nt h a tp r o d u c e dt h es t r o n g e s ts o ys a u c ea r o m a w es p e c u l a t e d t h a ta c e t o i n ，t e t r a m e t h y l p y r a z i n ea n df u r a n e o lw e r et h ec h a r a c t e r i s t i cc o m p o u n d so ft h es t r a i n d u r i n gt h eb l l 1f e r m e n t a t i o np e r i o d t h ec o n c e n t r a t i o no fa c e t o i na n df u r a n e o ld e c r e a s e d a n dt h a to ft e t r a m e t h y l p y r a z i n ei n c r e a s e d t e t r a m e t h y l p y r a z i n ew h i c hw a sf o r m e di nt h el a t e r f e r m e n t a t i o nt i m e ，w a sg e n e r a t e db yc o n v e r s i o no fa c e t o i n 3 1t h eh i g h t e m p e r a t u r ee n v i r o n m e n to f5 5 w a sa ni m p o r t a n tc o n d i t i o nf o rb l l 1t o p r o d u c es o ys a u c ea r o m a t e t r a m e t h y l p y r a z i n ew h i c hw a st h ec h a r a c t e r i s t i cc o m p o u n do f f e r m e n t a t i o nb r o t h w a ss i g n i f i c a n t l yh i g h e ra t55 t h a na t37 o r4 5 a tt h ef e r m e n t a t i o nt i m eo f4 d ，q u a n t i t i e so fm i c r o o r g a n i s m sh a dd e c r e a s e d s i g n i f i c a n t l y t h e nt h eb r o t hw a sd e a l tw i t hs t e r i l i z a t i o nb ym e m b r a n ef i l t r a t i o na n di n a c t i v a t i o no fe n z y m e b yh i g ht e m p e r a t u r es e p a r a t e l y t h et r e a t e df e r m e n t a t i o nb r o t hc o n t i n u e dt ob ec u l t u r e df o r a n o t h e r2 d c o m p a r e dw i t ht h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t sa t5 5 f o r2 da f t e rs t e r i l i z a t i o na n d i n a c t i v a t i o no fe n z y m eb yh i g ht e m p e r a t u r ea t4 d t h ef e r m e n t a t i o np r o d u c t sa t5 5 f o r2 d a f t e rs t e r i l i z a t i o nb ym e m b r a n ef i l t r a t i o na t4 ds m e l l e ds t r o n g e rs a u c ea r o m a t h eb i o e n z y m e s e c r e t e db yt h es t r a i nb l l 1i nt h ec u l t u r em e d i u mw a sc e r t i f i e dt op r o m o t et h ef o r m a t i o no f s a u c ea r o m a t h ef r e ea m i n oa c i d so ff e r m e n t a t i o nb r o t ha t5 5 f o r2 da f t e rs t e r i l i z a t i o nb y a b s t r a c t m e m b r a n ef i l t r a t i o na n ds t e r i l i z a t i o na n di n a c t i v a t i o no fe n z y m eb yh i g ht e m p e r a t u r ea t4 d ， i n c l u d i n gg l u t a m i ca c i d ，v a l i n ea n dl e u c i n e ，w e r es i g n i f i c a n t l yl o w e rt h a nt h a to f f e r m e n t a t i o n b r o t ha tt h ef e r m e n t a t i o no f4 d k e y w o r d s ：s a u c ef l a v o rp r o d u c i n gs t r a i n s ；a c e t o i n ；t e t r a m e t h y l p y r a z i n e ；f u r a n e o l ； b a c i l l u sl i c h e n i f o r m & i i 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含本人为获得江南 大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规定： 江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库 进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文， 并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：锄货导师签名： 日 期： ；7 o7 第一章引言 第一章引言 1 1 立题背景和意义 1 1 1 酱香型白酒的概括 由于白酒酿造所使用的原料、辅料、生产工艺和糖化发酵剂等不同，其产品风格和 香型各异，品种繁多。白酒香型亦称类型，即白酒风味的典型性。在1 9 7 9 年第三届全 国评酒会上确定，将白酒划分为酱香、清香、浓香、米香和其它香型，称为5 种风格。 酱香型白酒是我国独特的酒种，也是世界上珍奇的蒸馏酒。它以贵州茅台酒为典型 代表，历史悠久，工艺精湛，产品独具风格，名扬五洲，誉满全球，深受广大消费者喜 爱，得到国际市场上的好评，体现出我国制曲酿酒的卓越技术和高超水平。 随着我国人民生活水平的提高，茅台等酱香型白酒，越来越多地被用来招待客人或 外宾。7 0 年代开始，为了满足社会上不同层次消费者的需要，全国各地扩大生产规模， 掀起了“学茅台、创名牌 的热潮。除了在市场上有一定声誉的茅台酒外，大曲生产酱 香型白酒有四川郎酒、湖南武陵酒、黑龙江龙滨酒、广西梅鹿液、广东凤城液，麸曲生 产酱香型白酒有河北迎春酒、吉林凌川白酒、北京燕岭春酒等。这些酒多数是仿照茅台 酒的生产工艺，悟得其中奥妙，突出了酱香风格，深得当地消费者的喜爱。 1 1 2 酱香型白酒的生产现状 在中国的白酒消费市场上，浓香型白酒的销售量占7 0 ，清香型占1 5 ，米香型占 7 ，而酱香型仅占5 。但酱香型酒的销售收入占行业销售收入的1 0 ，利税占行业3 5 ， 增长空间巨大，1 0 至2 0 年间销量将增长3 0 倍左右。 著有“国酒”之称的茅台，一直是我国酱香型白酒中最为知名的品牌，但其年生产 量也仅有一万吨。为了满足日益增长的市场需求量，经扩大生产重新组建后，茅台集团 在国内首创年代梯级式的产品开发模式。4 3 0 、3 8 0 、3 3 0 茅台酒拓展了茅台酒家族低度酒 的发展空间；茅台王子酒、茅台迎宾酒满足了中低档消费者的需求；1 5 年、3 0 年、5 0 年、8 0 年陈年茅台酒填补了我国极品酒、年份酒、陈年老窖的空白。至此，形成了低度、 高中低档、极品三大系列7 0 多个规格品种，全方位跻身市场，从而占据了白酒市场制 高点，称雄于中国极品酒市场。 四川郎酒集团有限责任公司，是另一家以生产销售酱香型白酒为主要产品的知名企 业，厂区所在地处四川古蔺县二郎镇。近年来，经过产品结构的优化调整后，推出精品 郎酒、1 0 年陈红花郎酒、1 5 年陈红花郎酒、1 2 年陈青花郎酒、2 0 年陈青花郎酒、3 0 年红运郎酒、5 0 年青云郎酒等知名品牌。 虽然酱香型白酒在不断地扩大其生产规模，但其生产总量远远落后于浓香型、清香 型的产量。酱香型白酒的生产工艺，向来是口传心授的经验技术，没有得到系统科学的 理论知识去指导。另外，其生产周期长、工艺复杂，严重地限制了市场的供应量。 江南大学硕十学位论文 1 2 国内研究动态 1 2 1 白酒功能微生物及其特征风味化合物的研究现状 酱香型白酒的研究工作已经近五十年，但关于其特征风味物质，到目前为止在学术 界仍是众说纷纭。相比之下，同为五大香型白酒中的浓香和清香，其生产工艺较为简单， 其特征性风味和重要微生物的研究，已有一定的理论基础。 浓香型白酒是以四川的五粮液和泸州特曲酒为代表，其主要香味成分为己酸乙酯和 适量的丁酸乙酯。其中，己酸乙酯为浓香型大曲酒的主体香成分【l 】。其含量一般在2 9 t , 以上拉j ，是决定浓香型酒酒质的重要因素。 浓香型酒的主体香己酸乙酯，是由窖泥中己酸菌所产的己酸和酒醅中酵母所产的乙 醇，通过酯化反应所生成的。己酸菌是一种梭状芽孢杆菌【3 j ，来源于浓香型白酒生产中 的窖泥。其数量的多少和功能的强弱，直接影响着浓香型大曲酒的质量。己酸乙酯的酯 化菌多为霉菌、曲霉、毛霉、根霉，高产菌株一般是红曲霉和根霉【4 】。 清香型白酒是以山西杏花村的汾酒为代表，其主要香味成分为乙酸乙酯和乳酸乙酯 【2 】。清香型白酒中的主体香成分是乙酸乙酯【5 1 ，在清香型酒中含量最高，约占总酯的5 3 。 汾酒酒醅中的酵母是以酵母菌属为主，汉逊酵母、假丝酵母、拟内孢霉和极少量的 毕氏酵母和产膜酵母【6 】，具有一定的产香和产酒精能力。其中，汉逊酵母在汾酒风味的 形成中起着重要作用。清香型酒中的乙酸乙酯，正是这些生香酵母及产酯霉菌等微生物 的代谢物1 7 j 。 以茅台为典型代表的酱香型酒，研究发现酒中的含酸量高，而且含有较多的高沸点 酸类；总酯含量虽不及浓香型白酒，但种类也较多；含氮化合物和糠醛的含量，均居各 种香型白酒之首。目前，国内关于酱香型酒主体香成分的说法，主要有4 种： ( 1 ) 4 一乙基愈创木酚说：在1 9 8 4 年的茅台酒试点中，在茅台酒中分析出4 乙基愈创木 酚。首次提出了茅台酒的主体香是4 乙基愈创木酚峭j 。 ( 2 ) 加热香气说：曹述舜提出加热香气中的吡嗪类化合物可能与形成酱香有关【9 】， 并在茅台酒中检出四甲基吡嗪，同时指出了它是在制曲过程和堆积过程中的高温条件下 形成的。 ( 3 ) 吡喃类和吡喃类衍生物说：周良彦提出酱香型酒的主体香成份可能是吡喃类、 吡喃类及其衍生物【1 0 】。另外，糠醛在酱香型酒中含量偏高，可能与酱香有着某种关系。 ( 4 ) 高沸点酸和低沸点酯类的复合香说：酱香型酒的香气可分为前香和后香两部分 【8 j ，闻香上有较大的差别。前香中芳香组分的沸点较低，挥发性较大；后香因其沸点较 高、挥发较慢，因而香气持久。 由于酱香型酒的特征性风味化合物迟迟得不到诠释，无法进一步去了解这些微量成 分是如何产生的。这样一来，严重影响了酱香型白酒的科学理论发展，同时也限制其生 产规模的进一步扩大。 酱香型白酒所具有的独特风味，与其复杂的生产工艺是密切相关的。因此，应该从 2 第一苹引言 酱香型白酒独特的生产工艺中寻找其风味特征，从而解决这一瓶颈问题。 1 2 2 酱香型白酒的生产工艺 酱香型白酒的生产工艺比较复杂，综合概括其生产工艺特点为“四高两长，一大一 多 【l ，即采用高温制曲、高温堆积、高温发酵、高温馏酒、生产周期长、贮存时间长、 大用曲量和多轮次发酵。这样的工艺，使其产品具有酱香突出，优雅细腻，酒体醇厚， 香味谐调，回味悠长，空杯留香持久等特点。从这些生产工艺特点，可以看出酱香型酒 的香型和风格，与我国其它名酒迥然不同，是我国白酒中一个独特的品种。 其中，尤以高温制曲、多轮次发酵和贮存时间长，是酱香香气形成的关键因素。 高温大曲是产酱香微生物的重要来源，更是酱香香气的关键来源。高温大曲是以麦 粉为原料，除空气、工具、场地、曲室、稻草带来的微生物之外，原料自身就含有大量 的酶及蛋白质。由于微生物所产生酶系的作用，淀粉分解成糖，蛋白质分解成氨基酸。 在高温条件下，氨基酸和糖作用生成挥发性化合物。在水分合适的高温条件下，曲块变 为褐色，具有浓郁的复合型酱香。大曲不仅是酿造中的糖化发酵剂，更是酱香物质的前 驱者。曲中微生物的大量进入，也给香气的形成创造有利条件。 多轮次发酵，更是酱香型大曲酒工艺的独特之处。经过八个轮次的循环，酒醅中的 复合型酱香显得更加浓郁。酱香型白酒生产中注重回酒发酵，特别是在第一、二轮，此 后回酒量逐渐减少；回酒发酵可以以酒养糟，促进酒体呈香，增加高沸点的芳香成分。 贮存期长是所有名优酒之特点，而酱香型白酒贮存时间更长。酱香型大曲酒的贮存 需要三年以上，酱香型麸曲酒的贮存需要一年半以上。酱香型酒采取分轮次、分类型贮 存，即按轮次酒，按酱香、醇香、窖香三种原型酒分别贮存。酱香型白酒中高沸点的酸 类物质比较多、不易挥发，低沸点的酯类物质比较少、易挥发。延长贮存时间能将能挥 发的物质尽量挥发，将易挥发的高沸点酸类物质保留下来。所得到的白酒更加酱香突出， 纯正优雅，空杯留香持久。这就决定了酱香型白酒的贮存期长。 1 2 3 酱香型高温大曲的生产工艺 现已认为高温大曲中的香气，是酱香的主要来源之一。酱香型白酒的生产，是采用 具有独特工艺的高温大曲为糖化发酵剂。酱香型白酒的用曲量大，与酿酒原料高粱之比 为l ：1 。所以高温大曲质量的好坏，与酿酒风味优劣有着密切的关系。 在制曲过程中，根据曲坯最高温度的不同，大曲可分为高温大曲( 6 0 c t l 2 】以上) 、中 温大曲( 5 0 - - - , 6 0 ) 、低温大曲( 5 0 以下) 。从曲块的外观来看，高温大曲又可分为白 色、黑色和黄褐色三种。白色曲通常为曲堆上层的曲块，由于水分的散发较快，曲皮较 干，表面菌丝较少，但曲的内部仍和其它曲块一样；黑色曲为高温大水分曲，是在高温 潮温的环境中生成的；高温优质大曲为黄褐色，香气冲鼻，曲块干，表皮薄，曲质疏松， 经折断闻有酱曲香味，无霉臭气味和其它异味。 制作高温大曲的原料是小麦，经粉碎后加水和曲母踩成曲坯。在制作曲坯时，加水 量为原料的4 0 。在曲房中培养，让自然界中的微生物生长繁殖，以产生酿酒中所需要 的糖化酶和酒化酶。曲坯入室的第三天，曲温达到5 8 ，在接下来的5 4 0d 培曲过程 江南大学硕+ 学位论文 中，曲温都在5 5 - - 6 0 之间。出房后，再经风干、存储，即成大曲。制曲的温度较高， 最高品温可达6 2 以上；制曲的时间一般较长，曲房培养时间最短为4 0d ，储曲期在 3 个月以上。传统高温大曲的制作流程如图1 1 。 麦曲 上 挑选 i 粉碎 上 曲母 小麦 l 筛选 i 粉碎 i 粗麦粉 i 熹口 上 上 曲坯 上 上 入房堆积 0 翻曲 上 上 水稻草 图1 1 传统高温大曲的制作流程图 f i g 1 1f l o ws h e e tf o rt h et r a d i t o np r o d u c t i o no fd a q u 酱香高温大曲制作的重要特征是水分大和温度高。在大曲的制作前期，水分较多的 情况下，曲块的升温较快，曲块内部氧气浓度较低，不适于霉菌的生长；而这种条件比 较适宜于细菌的生长。曲坯入室第三天曲温达到5 8 ，在随后的制作过程中，曲温一 直保持在5 5 - - - 6 5 之间。在这种高温多水的条件下，芽孢杆菌得到旺盛的生长，最终 形成这种特殊的细菌酒曲。 酱香型酒的独特酿造工艺，导致大曲和酒醅中形成了复杂的微生物区系。这些微生 物的代谢活动与发酵过程中物理化学反应的相互重迭作用，最终形成了酱香型白酒中一 系列特殊的风味物质。其中，尤以高温大曲中的微生物，对于酱香风味的形成颇为重要。 因此，对高温大曲中微生物的研究，有利于揭示酱香的形成机制。 1 2 4 酱香高温大曲中微生物区系的研究 酱香型白酒所使用的高温大曲是完全采用开放式的生产，其微生物来源广、种类多、 4 第一苹引言 数量大。高温大曲是一个相对稳定的微生物群落载体，其中的每一种微生物都在参与生 长、繁殖、代谢。这些微生物及其代谢产物，对酱香高温大曲及酱香型酒中的风味起到 重要作用。 贵州轻工所食品发酵研究室曾对茅台酒制曲过程中复杂的菌群进行分离鉴定：分离 获得的4 7 株细菌中，多数属于芽孢杆菌属，其中有能在5 0 - 5 5 下生长的嗜热芽孢杆 菌，它们大多属于孢囊不膨大，菌体直径小于0 9g m 的枯草芽孢杆菌，少数孢囊膨大成 球状；1 9 株酵母菌分别属于拟内孢霉属、地霉属、汉逊酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母 属、酵母属、红酵母属；2 9 株霉菌分别属于曲霉属、毛霉属、犁头霉属、红曲霉属、青 霉属、拟青霉属等【l 引。 杨代永等通过对高温大曲微生物区系进行深入的研究，结果发现在成品曲中细菌的 数量占绝对优势。随着发酵过程的进行，微生物呈现出不同的消长规律，前期以细菌为 主，中后期霉菌大幅度增多，在前期和后期酵母偶有发现【1 4 1 。 由于酱香型高温大曲中的微生物得到越来越多的重视，许多的新技术应用到高温大 曲中微生物的分离鉴定，越来越多的未知微生物得以揭示。 1 2 5 酱香高温大曲中功能微生物的研究 尽管通过气相色谱分离等手段可检测高温大曲中的香气成分，但就这些香味成分的 形成机制，是由哪些微生物参与，哪一种微生物在起着主导作用，相应的代谢产物在发 酵过程中的具体作用如何? 这些都还是未解之谜。 曹述舜提出，芽孢杆菌可能是酱香大曲中有益于酱香风味产生的功能微生物。他从 茅台酒高温大曲分离筛选得到的细菌中，选择有代表性的7 株芽孢杆菌逐株制成三角瓶 纯种曲。纯种成品曲与生产用曲粉的香气比较接近，具有较强的酱香香气。 马荣山等对麸曲酱香型酒醅进行分离纯化得到7 株酵母菌，并选择几株具有代表性 的菌株作为酱香型酒曲的发酵菌种。由此工艺酿造出来的酱香型酒，清亮透明，酱香突 出，绵甜醇厚，具有明显的酱香风格。据此提出，酱香风格的形成与发酵过程中各种酵 母菌的生命活动息息相关【1 5 】。 对酱香型郎酒的生产用曲的研究中，云敏等发现红曲霉的生长及其生香规律，与酱 香高温大曲的制作过程有着很大程度上的一致性【1 6 1 。其中，尤以分离得到的烟色类红曲 霉，在培养过程中，先呈现出浓郁的香甜味，中期产生杂味，水分挥发干燥后，呈现出 浓郁的酱味、曲香味、焦香味。通过对培养过程中感官特征变化的评价分析，推测高温 大曲中的红曲霉，可能为酱香型酒主体香味来源的主要微生物种类。 1 2 6 酱香高温大曲中高温细菌的研究 由于制曲的特殊工艺，高温大曲内的微生物区系受到了重要影响，才形成比较特殊 的微生物区系。已故著名微生物学家方心芳先生提出，茅台酒曲是一种细菌曲。 已有大量针对高温大曲中细菌的研究，尤其以芽孢杆菌的研究最多，下面对其国内 的研究状况进行概述。 ( 1 ) 贵州省轻工业科学研究所 5 江南大学硕士学位论文 曹述舜、王民俊最早提到酱香大曲中的有益微生物的分离筛选【l 引。为了解各种微生 物在大曲中的作用及其代谢产物对酒风味的影响，对茅台酒制曲过程中的样品进行了多 次微生物分离，得到细菌4 7 株，霉菌2 9 株，酵母1 9 菌株，共9 5 株。在制曲过程中细 菌占有绝对优势，在高温阶段分离到的细菌，多数属于芽孢杆菌属。 在1 9 8 8 年的“全国酒曲微生物和酿造微生物学术讨论会 的大会上，王民俊提出 这些芽孢杆菌具有一定的水解淀粉和分解蛋白质的能力，能利用葡萄糖发酵产酸或氧化 产酸。选用芽孢杆菌制成的三角瓶纯种曲，经液液萃取后，其香气之间与生产益粉比较 接近。对其碱性组分进行薄层分析，检测到香草醛、阿魏酸、丁香酸。 ( 2 ) 中国科学院成都生物研究所，以庄名扬为中心的研究小组 庄名扬从习酒的高温大曲中，分离到两株芽孢杆斟1 7 j ，经形态特征、培养特征观察 及生理生化反应鉴定，它们分别归属于环状芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌，均具有较强的蛋 白水解酶、淀粉酶活力。将其进行固态或液态培养发酵，经有机溶剂萃取浓缩，采用 g c m s d s 分析测定，其特征组分为2 ，3 二氢3 ，5 二羟6 甲基4 h 吡喃4 酮。 表1 1 为各相关课题组对酱香高温大曲中高温细菌的研究情况。 表1 1 各课题组关于产酱香细菌的研究 t a b l e1 1r e s e a r c h e so ns c r e e n i n go fb a c t e r i ap r o d u c i n gs o ys a u c ef l a v o r 早在上世纪八十年代，已经有报道从酱香型高温大曲中筛选得到产酱香的微生物。 但由于酱香特征风味物质还不甚清楚，加上风味检测手段的落后，始终无法解释这些微 生物产生的特征代谢化合物及其形成机制。 6 第一章引言 1 2 7 酱香高温大曲中重要酶系的研究 高温大曲具有很强的蛋白质分解力，酱香型酒曲中的酸性蛋白酶高于浓香型近1 倍， 高于清香型近3 倍【1 8 】。曾有不少报道认为低温( 3 0 - 3 5 ) 制曲有利于酸性蛋白酶的生成。 对高温大曲的研究，发现高温大曲的酸性蛋白酶含量远远高于中温曲和低温曲。产生这 种差异的原因在于，菌种不同以及生料发酵或者熟料发酵。曲霉不论培养在生料或熟料 上，酸性蛋白酶的生成量都随温度的升高而逐渐下降；根霉培养在熟料上，伴随制曲品 温的升高，酸性蛋白酶活性下降，但培养在生料上，则完全相反。芽孢杆菌不论在生料 或熟料上，其酸性蛋白酶都随品温的上升而增长。 曹述舜等报道，选择6 株产酱香的芽孢杆菌，混合接种制帘子麸曲，最高品温控制 在5 5 ，经过3 6 h 的培养，细菌麸曲具有浓郁的酱味。通过测定，发现其蛋白酶活为1 3 3 , - 15 0 ( 生成u g 酪氨酸i n i n ) 0 1 3 j 。 芽孢杆菌具有较强的酸性蛋白酶活性【1 9 1 。不论在生料或熟料上培养，其酸性蛋白酶 都随着品温上升而增长。它是酱香型高温大曲生成酸性蛋白酶的主力军。贵州省轻工科 研所，从茅台高温大曲中分离出的嗜热芽孢杆菌，有助于提高酱香型酒曲中的酸性蛋白 酶，其生产出来的酱香型白酒质量较高。 从茅台酒曲中分离得到2 株枯草芽孢杆菌，其发酵液中的粗酶液，能使大豆等发酵 产生浓郁的酱香香气。研究表明，这2 株枯草芽孢杆菌生成的蛋白酶 2 0 l ，对酱香的形成 具有重要的贡献作用。 1 2 8 酱香高温大曲中美拉德反应的研究 美拉德反应是氨基化合物和还原糖化合物之间发生的反应，其与酱香型酒的风格质 量有着密切的关系【2 1 1 。它有可能是酱香物质产生的重要反应，因为酱香型酒的主体香来 源于高温大曲。酱香高温大曲的颜色变化、香气变化，可能是高温条件下美拉德反应造 成的。 1 2 8 1 高温大曲中的游离氨基酸 以茅台和郎酒为酱香型白酒生产用的高温大曲，其游离氨基酸含量最高【2 2 】，其种类 也最多。茅台高温大曲游离氨基酸为1 0 0 4 5 9m g k g ，含有1 5 种氨基酸。五粮液、泸州、 全兴大曲酒等浓香型白酒生产用的大曲为中温曲，游离氨基酸含量偏低，汾酒生产用的 大曲，游离氨基酸含量最低。凌川白酒生产用的高温大曲，游离氨基酸含量较低，含有 1 3 种氨基酸。其它香型的董酒是采用大曲和小曲生产的，其小曲中游离氨基酸含量也较 低，含有1 1 种氨基酸。 酱香型高温大曲中的游离氨基酸较高，为其酱香风味的形成提供了可能。 1 2 8 2 酱香高温大曲中功能微生物的作用 庄名扬报道，在含水量为4 0 的麸皮培养基中，接入b 3 1 菌株，在4 5 培养3 d 。 以不接种b 3 1 为对照，接种培养的麸曲发生了极为明显的褐变，且具有浓郁的酱香。将 麸曲以热水浸提，定容过滤，进行氨基酸分析。研究结果表明，曲中的游离氨基酸的种 类和数量发生明显的变化，接种的比不接种的明显高出几倍甚至十几倍。其中，尤其以 7 垩堕奎兰堡主兰篁丝茎 带有苯环的芳香族氨基酸的变化最为显著，产生大量的谷氨酸、苯丙氨酸和酪氨酣2 3 j 。 以甘氨酸、葡萄糖、氯化钠为培养基，灭菌后接入b 3 1 菌株，在4 5 培养3d ，以 不接种为对照。结果发现：氨基酸与还原糖在4 5 、p h 6 - - 7 、7 2 h 内并未发生美拉德 反应，而接入地衣芽孢杆菌后，氨基酸与还原糖发生明显的化学反应【2 3 】。研究提出地衣 芽孢杆菌一方面代谢产生蛋白水解酶，另一方面可能产生了某种酶催化着美拉德反应的 发生。 1 2 8 3 酱香高温大曲中美拉德反应的作用 由于功能微生物所代谢产生蛋白酶和糖化酶，大曲中的原料得到较好的利用，生成 大量的游离氨基酸和还原性糖。在制曲过程中，高温条件有利于美拉德反应，而且曲中 大量的游离氨基酸和糖也可能为美拉德反应提供了足够的前体。 虽然高温大曲的制作过程中，有可能存在着美拉德反应。但由于酱香物质及其形成 机制还不清楚，美拉德反应是不是酱香物质的重要产生途径，还值得进一步商榷。 1 2 9 功能微生物在白酒生产中的应用 采用功能微生物制作的麸曲，进行多次产酒试验。结果显示，添加纯种制曲生产的 麸曲酒，比大曲酒酱香更明显，更具有酱香型白酒的特征。另外，产酱香细菌属于芽孢 杆菌，具有一定的液化力、糖化力及蛋白质水解力，有利于原料中淀粉的糖化和蛋白质 的分解，有助于出酒率的提高。实践证明，芽孢杆菌是生产酱香型白酒的有益菌株，细 菌纯种制曲的使用，对酱香型麸曲酒的生产具有重要的意义。 在生产中发现，如果制曲品温低于5 0 ，曲中的酱香味淡薄，且易污染杂菌；如 果制曲品温高于6 0 ，曲中易形成氨味。由此可见，功能微生物的最适培养温度是5 5 - c t 2 4 】左右。功能微生物具有较好的水解蛋白质能力，其部分代谢产物构成酒中的香气成 分，另一部分以香气前体物质的形式存在于曲中。严格控制其培养温度，这样产生的纯 种曲酱味较好，所生产得到的酒酱香突出、酒体醇厚。 1 3 本研究的主要内容和意义 目前酱香高温大曲中功能微生物的研究主要集中在产酱香的细菌，但其研究还不够 系统科学，存在的关键性问题： 1 、产酱香微生物的特征代谢化合物是什么，其与酱香风味的关系如何； 2 、产酱香微生物在发酵培养过程中如何产生这些酱香物质? 1 3 1 本研究的主要内容 对酱香型酒的研究工作已经近五十年，但至今未能确定其特征香。本课题，从产酱 香细菌的角度来，分析酱香型白酒主要呈香物质及其形成机制。采用高温培养、热处理 产芽孢和高盐培养三种方法，从郎酒高温大曲中筛选产酱香香气的细菌。通过优化液态 培养条件，定性和定量分析发酵液中的特征性产物。 本课题的主要研究内容如下： 第一章引言 对产酱香细 菌进行形态 学观察，生 理生化特性 研究及1 6 s r d n a 序列 分析 研究发酵过程中微生物的 特性及培养环境中重要参 数的变化 图1 2 本研究课题的主要内容 f i g 1 2t h em a i nc o n t e n to f t h er e s e a r c h 1 3 2 本研究的意义 酱香型白酒主体香成分一直是白酒行业的研究热点。到目前为止，关于酱香型白酒 的特征香气成分，在学术界仍未有定论。酱香主体香成分的不确定，这使得研究思路从 源头上被限制了。因此，从产酱香细菌的角度来，分析酱香型白酒的主要呈香物质及其 形成机制，是值得进一步深入研究的。这一研究工作，不仅有利于酱香风味物质的研究， 同时也为纯种制曲生产酱香型白酒提供一定的依据。 本课题来源于“十一五 科技支撑计划：优势传统白酒、黄酒类制造业关键技术研 究与应用( 2 0 0 7 b a k 3 6 8 0 2 ) ；国家自然科学基金：酱香型国酒茅台特征香气成份的鉴定 与确认( 2 0 8 7 2 0 5 0 ) ；中国白酒“1 6 9 计划”。通过分析郎酒大曲中的产酱香细菌的主要呈 香物质及其形成机制，从而改良白酒生产中的功能微生物，提高酱香型白酒的风味，为 进一步发展酱香型白酒打下了技术基础。 9 虽n 儿v 江南大学硕十学位论文 第二章实验材料与方法 2 1 材料 2 1 1 样品采集 从四川郎酒厂制曲车间采集的高温大曲，成品曲具有明显的酱香风味。取样时间是 2 0 0 8 年4 月，样品密封后4 保藏备用。 2 1 2 主要试剂 乙偶姻、四甲基吡嗪、呋喃扭尔均为色谱纯，购自s i g m a 公司，其他试剂均为国产 分析纯或生化试剂。 2 1 3 主s v v , t 器和设备 扫描电镜q u a n t a 一2 0 0 ，美m f e i 公司；a g i l e n tg c6 8 9 0 5 9 7 5m a s s ，美国安捷伦 科技有限公司；a g i l e n tg c6 8 9 0 f i d ，美国安捷伦科技有限公司。 2 1 4 菌种 b a c i l l u sl i c h e n i f o r m i sc i c c1 0 0 3 7 ，b a c i l l u ss u b t i l i sc i c c2 0 1 2 3 ，分别是从中国工业 微生物菌种保藏管理中心购买的标准地衣芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。 2 1 5 培养基 2 1 5 1 平板分离培养基 ( a ) 营养琼脂培养基( l ) ：牛肉膏5 ，蛋白胨1 0 ，n a c l5 ，琼脂2 0 ，p h 7 0 ，l x l 0 5 p a 灭菌2 0m i n 。 ( b ) 高盐培养基( l ) ：牛肉膏5 ，蛋白胨1 0 ，n a c i7 0 ，琼脂2 0 ，p h 7 0 ，l x l 0 5 p a 灭菌2 0m i n 。 2 1 5 2 斜面保藏培养基( g l ) 牛肉膏5 ，蛋白胨1 0 ，n a c l5 ，琼脂2 0 ，p h 7 0 ，1 1 0 5 p a 灭菌2 0m i n 。 2 1 5 3 种子液培养基( g l ) t r y p t o n e1 0 ，y e a s te x t r a c t5 ，n a c i1 0 ，p h 7 0 ，1 x 1 0 5 p a 灭菌2 0m i n 。 2 1 5 4 发酵培养基 ( a ) 麸皮固体培养基：麸皮9 9 9 ，葡萄糖1 9 ，加水7 0 m l ，搅拌均匀后，l x l 0 5 p a 灭 菌3 0m i n 。 ( b ) 小麦固体培养基：干燥小麦麦粒破碎为麦沙、麦粉各半，加等量水，润浸1 8 h 后，蒸熟、冷却、打散，称取适量于三角瓶中，1 1 0 5 p a 灭菌3 0m i n 。 ( c ) 麸皮浸出汁：小麦麸皮2 0 0 9 ，高温淀粉酶2 , 0 0 0i u ，加水8 0 0 m l ，于1 0 0 蒸 煮1 0 m i n 。待冷却后，加入碱性蛋白酶1 0 0 ，0 0 0i u ，于5 5 保持3 0 m i n 。过滤取上清液， p h 6 2 。l x l 0 5 p a 灭菌2 0m i n ，使用前加葡萄糖至终浓度为1 0 9 l 。 1 0 第一二章实验材料与方法 ( d ) 小麦浸出汁：将干燥小麦麦粒粉碎后，麦粉2