资环-陈小军-总结报告

胆碱酯酶的纯化及生物传感器的研制总结报告陈小军指导教师：徐汉虹教授、博士（华南农业大学资源环境学院，广州， 510642）随着人民生活水平的提高，人们已越来越注重生活的质量。几年前提出的菜蓝子工程是为了解决居民吃菜难的问题，而近年提出的放心菜、无公害蔬菜、绿色食品则是为了保障人们的饮食卫生与安全。这主要源于频频发生的农药中毒伤害、死亡事故，已到了谈农药残留色变的地步，这是因为农药一方面造成中毒者身体伤害，甚至中毒个体死亡；另一方面则通过在人体内的蓄积，造成对下一代的伤害，从而影响人类的种群质量。产生这些问题的主要原因：一是我国农药结构不合理，我国杀虫剂的70%是有机磷和氨基甲酸酯类，而其中70%以上是高毒农药，这使农民在用药时受到极大限制；二是使用者不按规定使用农药，农药管理条例中明确规定“应按照规定的用药量、用药次数、用药方法和安全间隔期施药，防止污染农副产品，剧毒、高毒农药不得用于防治卫生害虫，不得用于蔬菜、瓜果、茶叶和中药材”，而有些农民往往不遵守上述规定而滥用农药；三是没有一整套的严格检测、执罚措施。农药在农产品中的严重超标，一方面危害了我国消费者的身心健康，同时也对我国农产品出口贸易带来巨大损失。自1990年以来，我国对欧洲、日本、美国等国家出口的鸡肉、猪肉、兔肉、鳗鱼、蜂蜜、茶叶和蔬菜等农产品，由于农药残留超标，被拒收、扣留、退货、销毁、索赔和终止合同的现象时有发生，许多传统大宗出口创汇农产品被迫退出了国际市场。国外特别是发达国家利用名目繁多的安全卫生措施限制我国农产品入境，如美国对苹果及其制品农残检测项目达102种，目的是为了保护本国人民的身体健康，同时用技术壁垒（而非关税壁垒）保护本国农产品市场。我国进口农产品主要通过疫情的风险分析进行检疫把关，而农药残留把关由于我国农药残留限量标准少，检测技术落后，远未对进口农产品起到把关作用，导致在对外贸易中处于很不利的地位。有机磷和氨基甲酸酯类农药具有杀虫力强、药效快等特点，它们是我国目前主要应用的农药品种，也是发生农药残留超标和农药中毒事故的主要来源。因此发展快速、可靠、灵敏的农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测方法，无疑是控制着两类农药残留、保证消费者安全的基础，所以，无论是从保证我国人民的农产品食用安全，还是为我国加入WTO后提供农产品检测技术保障、发展外向农业经济方面来看，大力加强我国农产品中有机磷和氨基甲酸酯类农药残留检测技术尤其是快速检测技术的研究已刻不容缓。农药残留检测技术主要有生物检测法、生物化学的酶抑制法、免疫分析法、仪器分析法等方法。蔬菜上农药残留的检测有其特点，即应满足廉价、快速、多残留检测的要求。从技术上来看，唯有生物化学的酶抑制法能同时满足这些要求。目前农药速测技术主要有：1.基于胆碱酯酶的抑制进行检测：因为有机磷和氨基甲酸酯类农药是目前主要应用的农药品种，也是发生农药中毒事故的主要来源，因此农药的多残留检测主要针对这两大类农药，它们的作用靶标都是乙酰胆碱酯酶，而且造成人畜中毒事故也是由于其抑制了人畜体内的乙酰胆碱酯酶，使神经传导过程不能顺利进行的缘故。因此根据这一原理，可以将胆碱酯酶提取出来，在体外进行酶活力抑制试验，从酶活力抑制情况，可以来半定量地指出农药含量范围。利用不同的检测系统，可以开发出多种不同的产品形式：（1）农药残留检测试纸：是将胆碱酯酶和显色介质分别固着于不同的滤纸小片上，检测时先令待测液与酶片作用，通过比较与空白对照的颜色差异来判断农药污染情况。以美国Enzym Tec 公司的农药检测纸片（Pesticide Detector Ticket）为代表，国内也有二三家厂家生产这种纸片。此法应用比较简便，适合广大消费者自查使用，但据报道其假阳性率比较高。（2）目视或仪器比色的检测试剂盒：主要通过Ellman反应进行，比较酶活力的抑制率来判断残留农药的大致含量。主要有台湾农试所提取自敏感家蝇头的胆碱酯酶成套试剂。它以对主要农药检出限低（灵敏度高），性能价格比好的优势在国内有较大的影响力。本法检测快速、灵敏、可靠性高，但需要一定的仪器设备，适合菜场、超市、食堂等机构检测其产品安全度。（3）薄层层析法：农药在薄层板上经层析分离后，再用胆碱酯酶抑制法对农药进行定性及半定量检测。本法检测快速、灵敏、可靠性高，但需要一定的操作技术，适合实验室分析使用。（4）是酶电极传感器法：是将胆碱酯酶与一定的传感器耦合在一起，通过检测电流、电位变化来表征样品中农药污染情况。目前国内外均尚处于研发阶段，尚无定型产品。2.免疫分析法。免疫学技术在农药分析中的应用始于1968年，但直至1980年才开始全面应用于农药分析，20世纪80年代中期以来，国外开始出现大量研究报道。20世纪90年代以来，免疫分析在检测粮食、水果、蔬菜、肉、奶、水和土壤中农药的残留分析上得到迅速发展，成为优先研究、开发和应用的一项分析技术。世界粮农组织（FAO）已向多个国家推荐此项技术，美国化学学会将免疫分析技术、色谱分析技术（气相和液相）共同列为农药残留分析的主要技术。随着免疫测定技术研究的深入和发展，可用于免疫分析的农药品种越来越多，至1998年已达60多种，而且检测方法也朝着高灵敏度、低检测限、样品量少、预处理简单、操作简便、成本低廉的方向发展，所用的抗体也将逐渐由多克隆抗体发展为特异性和灵敏度更高的单克隆抗体。免疫学检测技术已经成为食品农药残留和食品安全质量控制的有效快速的检测手段。该技术开发的产品免疫检测试剂盒可广泛应用于现场样品和大量样品的快速检测。目前国外已研制出多种免疫试剂盒用于农药检测，其中许多已商品化。我国在农药残留免疫检测领域的研究起步较晚（20世纪90年代初），到目前为止,仅制备出甲基对硫磷、对氧磷、杀虫脒等几种农药的单克隆抗体。免疫分析法具有结果精确、灵敏度高和特异性强的优点，但该方法特异性太强也正是其缺陷所在，因为每一种农药的抗体只能测定该种农药或结构与其类似的极少数农药，而目前我国农业上应用的农药品种繁多，不同农药需要不同的免疫试剂盒，这样必然造成检测成本过高，因此这种方法不太适合我国国情。本项目根据我国农产品化学农药残留超标严重和我国农业用药杂乱的情况，主要开展了基于酶抑制快速检测农药残毒方法中的关键技术研究，找到了可提取对有机磷和氨基甲酸酯类农药敏感的酶源，建立了农药残留快速检测胆碱酯酶的提取和纯化工艺，提出了胆碱酯酶的行业标准，解决了胆碱酯酶在常温下不稳定的难题，建立了基于所选酶源生产的胆碱酯酶抑制法快速测定有机磷和氨基甲酸酯类农药的方法。现将研究结果报道如下：1.酶源的筛选与纯化1.1酶源的筛选采用活力较高且对常用、毒性高的农药敏感（即检出限低）的胆碱酯酶是胆碱酯酶抑制法检测有机磷和氨基甲酸酯类农药成功的首要条件。众所周知，胆碱酯酶广泛存在于从低等到高等的动物体内，由于进化上的原因，这些胆碱酯酶在结构上存在着一定的差异；正是由于这些差异，使得有机磷和氨基甲酸酯类农药对它们的抑制表现出十分明显的差异。如分别提取自果蝇头、鼠肝、蜜蜂头的酶源，采用薄层层析法对乐果的检出限依次为20 ng、未检出、500 ng；对西维因的检出限依次为5 ng、5 ng、0.1 ng；对马拉硫磷的检出限依次为1 ng、未检出、0.2 ng。鉴于不同来源的酶对不同的农药抑制敏感性存在较大差异这一事实，我们选用毒性高、发生事故最为严重的甲胺磷等几种农药作为指示农药来筛选敏感性的酶源，结果见表1。表1 不同来源的胆碱酯酶主要性能比较材料名称Km, mM抑制中浓度，MAcTCBuTC甲胺磷 对氧磷西维因呋喃丹鸡血清0.3620.1260.20.055010鸭血清0.2840.0920.20.05205猪肝0.3780.1390.40.055010鲨鱼0.3160.0850.10.05105双棘石斑鱼0.2640.0670.050.115鲳鱼0.4060.1150.050.001101鲽鱼0.8760.180.050.005102大比目鱼0.9180.1730.050.0510020鳎0.2560.0210.050.005505鳗鱼0.0780.3560.10.120010鲈鱼0.0870.0310.050.005502HXW0.7150.1040.050.00551从上表可以看出，不同来源的酶的酶学性质是不同的，而且同一酶源对不同的底物也表现出不同的亲和性，普遍是对硫代丁酰胆碱（BuTC）的亲和力高于硫代乙酰胆碱（AcTC），唯有鳗鱼的情况与此相反，这说明鳗鱼酶源是乙酰胆碱酯酶（AChE）为主，而其余的酶源是以丁酰胆碱酯酶（BuChE）为主。已经知道丁酰胆碱酯酶（BuChE）在动物体内起着清道夫的作用，保护在神经冲动传导中起着重要作用的乙酰胆碱酯酶（AcTC）免受外源物质的干扰，可以推测对包括农药在内的外源物质丁酰胆碱酯酶（BuChE）比乙酰胆碱酯酶（AChE）更为敏感。甲胺磷、对氧磷、西维因、呋喃丹对鳗鱼来源的酶源的抑制中浓度均明显高于其它来源的酶源，这一初步结果是与上述理论分析相一致的。筛选出的酶源HXW对甲胺磷、对氧磷、西维因、呋喃丹的抑制均比较灵敏，再综合原料的易得性、经济指标等各种因素，可以说我们获得的HXW这一酶源是相当好的。2.酶的纯化确定了酶的来源后，为了使酶的活力达到检测的要求，必须对粗酶进行除杂纯化；但应注意到酶的纯化必然伴随着酶活力的损失和成本的激增，因此在实际应用中酶的纯度也不是越高越好，只要能满足使用即可。在设计酶的纯化方案时要权衡两方面的因素，只要将酶部分纯化至酶活力达到要求，且残余不纯物对酶的应用没有不利影响，则就可将此半纯化的酶制剂制成试剂盒应用。下面的纯化指导思想即按此进行。2.1 胆碱酯酶活力的测定胆碱酯酶活力的测定采用经典的Ellman法，其原理为在胆碱酯酶（AChE）作用下，碘化硫代乙酰胆碱（BTCI）被水解成硫代胆碱和乙酸，硫代胆碱与二硫双对硝基苯甲酸（DTNB）反应生成黄色产物，该产物在412nm 处有最大吸收峰，因此可在此波长下测定本反应前后的吸光值之差（A）来表征酶活力的大小，A值越大，表示酶活力越大。反应原理图如下：所需试液配制如下：A：0.1 mo/L pH8.0磷酸缓冲液：分别配制0.1 mo/L的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠溶液，在pH计监控下以适当比例混合，使pH为8.0。B：胆碱酯酶酶液配制：取80mg胆碱酯酶粉溶于8mL上述 pH 8.0磷酸缓冲液，现配现用。C：碘化硫代丁酰胆碱（BTCI）溶液：取100mgBTCI溶于10 mL上述 pH8.0磷酸缓冲液，4保存。D：二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB）溶液：取60mg DTNB溶于10 mL上述pH8.0磷酸缓冲液，4保存。操作步骤如下：取3.0 mL 0.1 mol/L pH8.0磷酸缓冲液于试管中，加入50 L二硫代双对硝基苯甲酸（DTNB）溶液、50L酶液，置于37水浴中保温15 min后，一支试管加入50 L 0.1mol/L pH8.0磷酸缓冲液，在412 nm下作为标准管调零；另一支试管加入50 L碘化硫代丁酰胆碱（BTCI）溶液，混匀后立即倒入玻璃比色皿中比色，记录3 min前后的吸光值A，求出前后A值的差A，按酶活力公式计算酶活力。每一酶液至少重复测定3次，取平均值进行计算。酶活力单位数计算公式A1为：(A.1)式中：A412-反应前后A412吸光度的差值；V-反应体系总体积，为3.1510-3L；e- 黄色产物摩尔吸光系数，为1.36104L(molcm)-1；d-比色皿光程,单位为厘米（cm）；T-反应时间, 为3min.106-摩尔转化为微摩尔的转化系数为简便起见，以下实验酶活力直接以A表示。2.2 胆碱酯酶的纯化路线冷冻离心提取试剂提取高速组织匀浆原材料初级纯化、亲和层析冷冻干燥收集活性峰并透析除盐检测毒死蜱残留酶电极制备酶电极稳定性酶电极固定化 图1胆碱酯酶的纯化路线2.3 胆碱酯酶的纯化2.3.1原材料除杂：获得原材料后应尽量除去脂肪、结缔组织等不含酶的部分；如材料较多，一次处理不完时，应置于-18冰箱冷冻保存待用。2.3.2提取溶液的配制：分别取A、B试剂适量加入蒸馏水中，制成含两种试剂均为1的溶液，用pH计将其pH值调为7.5，现用现配。2.3.3材料的匀浆与提取：将处理好的材料加入适量的提取溶液在高速组织捣碎机中匀浆，然后加入四倍量的提取溶液提取10 h以上，其间给予间隙搅拌。2.3.4提取体系的离心：在4条件下5000 rpm 冷冻离心20 min，弃残渣，取上清液待用。取部分上清液进行冷冻干燥。2.3.5硫酸铵盐析：在上清液中加入边搅拌边加入固体硫酸铵至40%饱和度，然后置于4冰箱中盐析5 h以上。2.3.6离心与透析：将上述盐析体系在4条件下5000 rpm 冷冻离心20 min，弃上清液，收集沉淀物并用适量蒸馏水溶解，然后装入透析袋中对蒸馏水进行透析，期间勤换水，直至用Ba(OH)2检查无硫酸铵为止。取部分透析液进行冷冻干燥。2.3.7DEAE-Sepharose离子交换层析：将上述透析液用0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡过夜，DEAE-Sepharose离子交换柱也用0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液平衡，用平衡好的样品上样，用1-2倍的平衡缓冲液冲洗柱子，然后用（0.01 mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液）+（0.4mol/L NaCl+0.01mol/L pH7.5磷酸盐缓冲液）进行梯度洗脱并分部收集。并同时检测蛋白含量和胆碱酯酶活力，收集活性峰并对蒸馏水透析除盐，最后将其冷冻干燥。2.3.8普鲁卡因胺亲和层析纯化 普鲁卡因胺亲和胶的的制备方法如下：将5gECH sepharoseTM 4B在0.5M NaCl溶液中充分溶胀，然后用蒸馏水洗脱去除盐分；同时将0.124g EEDQ溶于10mL无水乙醇中及1.36g普鲁卡因胺溶于l 0mL蒸馏水中，混合以上3种溶液并过夜，装柱后分别用3-4个柱体积的50%乙醇、蒸馏水、1 M NaCl充分洗脱，最后用洗脱液A平衡，此方法配制可获得20mL左右普鲁卡因胺亲和胶。亲和层析柱长15 cm，直径l.lcm， 4保存备用。 将从Sephadex G-200层析柱中部分纯化的丁酰胆碱酯酶上样于亲和层析柱中，先用缓冲液A在流速为24 mL/h，下进行杂蛋白洗脱，直至在洗脱液中无法检测到蛋白的存在。然后利用0.02M磷酸缓冲液（pH7.0，含1mM EDTA和100mM普鲁卡因胺，缓冲液B）选择性地从亲和层析柱中洗脱丁酰胆碱酯酶，流速控制为24mL/h，收集含有丁酰胆碱酯酶高活力的几管(通常为1-2管)，混合在一起。去除普鲁卡因胺和蛋白浓缩将上述获得的纯化丁酰胆碱酯酶溶液加入NaCl直至最后浓度达1M，然后在0.02M磷酸缓冲液中透析2-3次，将纯化并去盐的乙酰胆碱酯酶溶液真空冷冻干燥进行蛋白浓缩。2.4 胆碱酯酶纯化结果表2不同纯化步骤所得胆碱酯酶性能纯化步骤活力回收（%）活力(A)提纯倍数甲胺磷敏感性粗酶粉1000.0861合格硫酸铵盐析800.1541.8合格离子交换层析380.92410.7合格亲和层析191.456268.2合格从表2可以看出，经两步纯化后，酶的活力较粗酶有10.7倍的提高，完全达到了农业部行业标准NY/T 448-2001的要求；对甲胺磷敏感性试验表明，酶的纯度对甲胺磷的敏感性没有明显影响，这说明酶的农药的敏感性主要取决于酶的来源，这与前述的理论分析是一致的。3.酶的稳定性研究 由于酶是具有生物活性的物质，其在放置或使用过程中活力会损失，一般的酶制品在常温下放置2-3 d天活性就将损失大半，这对其应用是一个很大的限制。为了在使用或运输过程中保证酶的活性损失在不影响其应用的范围以内，对酶的稳定性进行研究。3.1放置温度和稳定剂对酶稳定性的影响把经纯化干燥的酶粉溶入含有稳定剂的溶液，然后再冷冻干燥制得含稳定剂的酶粉。把不含稳定剂和加有稳定剂的干燥酶粉用密封塑料瓶包装，分别在冰箱内4、-18和控温箱33下保存，测定酶活力A随保存时间的变化情况。酶活力测定方法按产品标准上的方法进行。为了找到理想的稳定剂，分别试验了抗氧化剂、络合剂、脱水剂、抗光解剂等近二十种试剂对酶稳定性的影响，表3列出了不加稳剂和分别加稳定剂A和B的实验结果。 表3温度和稳定剂对酶稳定性影响结果表时间不加稳定剂加5%稳定剂A加5%稳定剂B-18433-18433-184330d0.8080.8080.8080.8010.8010.8010.8050.8050.8053d0.8010.7210.4800.7930.7190.7150.8050.8050.7916 d0.7950.6630.2380.8010.6740.5830.8000.8020.750-9 d0.7820.6280.1050.7890.6320.3900.7980.7990.73212 d0.7910.5450.0860.7920.5920.1230.7990.800.73515 d0.7800.5210.0210.7830.5620.0800.7920.7980.68918 d0.7810.49800.7780.5440.0200.7950.7940.67322 d0.7780.42100.7800.47000.7880.7900.65025 d0.7650.40800.7750.45800.7820.7780.65230 d0.7680.35100.7720.42200.7790.7610.62160 d0.7320.28700.7550.30100.7570.7480.58690 d0.7150.11200.7300.21000.7410.7290.512120 d0.7200.0300.7310.10100.7200.7100.50150 d0.698000.7230.05000.7010.6870.478180 d0.683000.7050.03000.6890.6520.423210 d0.636000.6820.02000.6850.6230.410240 d0.615000.6330.01000.6680.5920.382270 d0.582000.6150.00800.6580.5780.356300 d0.557000.584000.6450.5630.320330d0.521000.553000.6320.5510.301360 d0.493000.520000.6010.5300.283与初始对比活力保持(%)6164.974.765.835.2图2 在-18下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图3 在4下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图图4 在33下加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化图从以上表和图可以看出，在-18下保存，加稳定剂和不加稳定剂酶活性随保存时间的变化趋势没有明显差异。放置360 d后，其酶活力损失分别为39和25。而在4和33下放置酶活性损失差异明显。在4下，不加稳定剂时，放置约25 d其活力损失一半，放置3个月后基本无活力，而加入稳定剂B在4下放置12个月后，酶活力还有原来的70。在33时，稳定剂的作用更明显，不加稳定剂，酶在33下放置约15 d活力基本消失，而加入稳定剂B后其活力仍有原来的86，一个月后其活力仍有原来的73%。可见加入稳定剂B后对酶的活性起了很好的保护作用。由于稳定剂的加入使酶在常温条件下也能保持很好的稳定，这就消除了用户在购买此酶时担心在运输和使用放置过程中酶活性损失而失效的担忧，为该酶的推广应用提供了一个很好的保证。由于酶法测农药残毒时均需用冲稀释以后才使用，那酶在冲液中的稳定性自然也就成了使用者关心的问题。为回答此问题，我们按活力测定方法用缓冲液稀释酶粉，分别置于4和33下保存，测定了酶活力在一个星期内的变化情况，其结果如表4和图5-6所示。表4酶稀释液保存测试结果时间不加稳定剂加5%稳定剂A加5%稳定剂B4334334330h0.8080.8080.8010.8010.8050.8056 h0.7780.7670.7750.770.7850.78112 h0.7340.7020.7630.730.7820.77624 h0.7050.6420.7250.6890.7730.76848 h0.6560.5210.6430.6520.7610.71272 h0.6120.3210.6240.6180.7540.68396 h0.5250.1230.5650.5120.7260.648168 h0.3410.080.3560.1230.4010.264 图5 4下加稳定剂和不加稳定剂酶溶液活性随保存时间的变化图6 在33下加稳定剂和不加稳定剂酶溶液活性随保存时间的变化从表和图可以看出，在4时，不论是否加有稳定剂，酶溶液在24 h内活性损失不大于15。96 h以内，其活力仍符合使用要求，加5%稳定剂B的酶稀释液在4保存1个星期仍有效。综合以上结果，可以看出温度对活性的影响非常大，酶保存温度愈底，其有效保存时间也就越长，因此我们应尽可能在底温下保存酶。另外，稳定剂对酶有明显的稳定作用，因此应加入稳定剂延长酶的保存时间和使用寿命。另外，同样条件下保存酶溶液比干酶粉更易失活，稳定剂对溶液中的酶没有明显的稳定作用。4.快速检测体系的探讨与建立4.1磷酸缓冲液 pH 值与乙酰胆碱酯酶活力关系在干净试管中分别加入不同 pH 值的 3.00 mL 磷酸盐缓冲液， 50L DTNB ， 50 L胆碱酯酶，混匀后在 37 下保温 30 min后，加入 50 L BTCI ，立即在 412 nm 测定，记录 3 min前后 A值。第一支试管不加入BTCI，作为空白调零。每个处理重复三次。表5磷酸缓冲液的pH值与胆碱酯酶活力关系实验操作重复三次管号0123456789磷酸缓冲液（3mL）pH值8.05.05.56.06.57.07.58.08.59.0DTNB（L）50505050505050505050酶液(L)50505050505050505050BTCI(L)：底物/505050505050505050实验结果见图7。从图中可以看出以pH值为7.5-8.5时所得到的A值最大，即在磷酸缓冲液pH值为7.5-8.5时，酶的活力处于最佳状态，以下实验均以pH 8.0的磷酸缓冲液为反应体系。图7 磷酸缓冲液pH值对胆碱酯酶活力的影响4.2测定时间与乙酰胆碱酯酶活力关系在干净试管中分别加入3.0 mL pH 8.0的磷酸缓冲液、50 L DTNB、50 L胆碱酯酶。在37下保温30 min后，加入50 L BTCI，立即在分光光度计上进行测定，记录0、30、60、90、120、150、180、210、240、270、300、330、360 s时的读数。第一支试管不加入BTCI，作为空白调零。每个处理重复三次。实验结果见图8。在前180 s反应速度基本呈线形关系，此后反应速度逐渐减慢，渐趋饱和。在反应前180 s结果具有可比性，而且反应时间也短，适合快速检测样品的要求，因此选择180 s作为观测终点。图8 测定时间与胆碱酯酶反应速度的关系4.3保温温度与乙酰胆碱酯酶活力关系在干净试管中分别加入pH为8.0的磷酸缓冲液3.0mL、50LDTNB、50L胆碱酯酶，将反应体系分别在20、25、30、35、40、45、50下保温30 min后，加入50 L BTCI，立即在412 nm测定，记录 3 min前后 A 值。第一支试管不加入BTCI，作为空白调零。每个处理重复三次。表6保温温度与乙酰胆碱酯酶活力关系实验操作管号重复三次01234567磷酸缓冲液（mL）3.03.03.03.03.03.03.03.0保温温度（）2020253035404550显色剂DTNB（L）5050505050505050酶液(L)5050505050505050底物BTCI(L)：/50505050505050实验结果见图9。在不同温度下胆碱酯酶的活力表现出明显不同。在35左右表现出最高活力，在低温段，温度对酶活力的影响比较温和；而在高温段，温度对酶活力的影响比较明显，在40以上酶活力损失较严重，这与胆碱酯酶对热不稳定的性质是一致的；反应体系选择保温温度37是比较合理的。图9 保温温度对胆碱酯酶活力的影响4.4底物浓度与反应速度的关系在干净试管中分别加入pH8.0的磷酸缓冲液适量、50 L DTNB、50L胆碱酯酶，混匀后在37下保温30min，然后加入5 L、10 L、20 L、40 L、50 L、100 L、200 L的BTCI后使试管内反应体系总量都为3.15 mL。立即在412 nm测定。表7底物浓度与反应速度的关系实验操作管号重复三次01234567磷酸缓冲液（mL）3.053.0453.043.033.013.002.952.85显色剂DTNB（L）5050505050505050酶液(L)5050505050505050底物BTCI(L)：/510204050100200实验结果见图10。底物在低浓度时，反应速度随底物浓度的增大而增大，而超过一定限度时，底物反而对酶活力表现出一定的抑制作用。从实验结果来看，50 L的底物已能满足实验要求，故选择该量作为底物添加量。图10 底物浓度对胆碱酯酶活力测定的影响4.5胆碱酯酶酶量与反应速度的关系在干净试管中加入pH8.0的磷酸缓冲液、50 L DTNB，然后加入5 L、10 L、20 L、40 L、50 L、100 L、200 L的胆碱酯酶，调整磷酸缓冲液的量使反应积为3.15mL，在37保温30 min后，加入50 L BTCI，立即在412 nm测定。表8 胆碱酯酶酶量与反应速度的关系实验操作管号重复三次01234567磷酸缓冲液（mL）3.053.0453.043.033.013.002.952.85显色剂DTNB（L）5050505050505050酶液(L)50510204050100200底物BTCI(L)： /50505050505050实验结果见图11。随着酶量的增加反应速度相应增加，但当酶量达到100L时，出现拐点现象，反应速度增加变慢，可能因底物浓度过高反而表现出底物抑制现象。50L酶量的反应速度已能完全满足农药残留检测的需要，故以50L酶作为试验添加量。图11 酶量对胆碱酯酶活力的影响（有图标曲线为原始数据，无图标曲线为趋势线）根据以上结果分析，在加入显色剂（DTNB）50L的情况下，应用本胆碱酯酶快速检测农药残度的最佳条件是：pH 8.0的磷酸盐缓冲液；反应温度37；50 L的底物（BTCI）；50L酶溶液；反应时间180 s 。5.酶对农药的灵敏性试验5.1酶活性与抑制率的关系根据中华人民共和国农业行业标准NY/T448-2001蔬菜是有机磷和氨基甲酸酯类农药残留快速检测方法方法的要求，对胆碱酯酶的活力A值要控制在0.4-0.8之间，那么不同批次的酶，或酶在保存，运输过程中A值的下降对检测结果的判定有无影响，我们选择A值在0.3-0.9的酶5支，分别测试甲胺磷和呋喃丹不同浓度对酶的抑制率。表9 使用不同活性酶对测试抑制率的影响结果酶A值甲胺磷浓度(mg/L)呋喃丹(mg/L)0.1250.250.50.150.30.7A=0.30258.272.683.362.873.385.5A=0.49658.372.383.263.974.184.6A=0.53357.773.283.765.274.086.7A=0.67559.373.684.462.173.688.2A=0.81759.273.484.863.772.986.8由表9可以看出，同一浓度的甲胺磷或呋喃丹标准液对不同A值的酶样抑制率是非常接近的，从统计学分析，抑制率之间无显著差异，而随着农药浓度的升高，对酶的抑制率也增大。这个结果说明，在运输或保存过程中酶的活力发生变化，但只要A值仍在0.4-0.8之间，则检测时对样品农药残留的判断并不会产生偏差。5.2酶对有机磷和氨基甲酸酯类农药的灵敏性试验利用生物化学的酶抑制法检测的是有机磷和氨基甲酸酯类农药的多残留总和，对具体的农药种类其敏感性之间存在差异，为了了解不同种农药对酶抑制率的差异，选择了9种有机磷类农药和5种氨基甲酸酯类农药进行了试验。实验方法是先把目标农药用磷酸缓冲液配成一系列浓度，然后各取3 mL于试管中，加入50 L酶和50 L显色剂，分别培养10 min和30 min，取出加入底物50 L，记录抑制率。每一浓度农药平行测定三次，取平均值。实验结果汇总在表10。表10 酶对几种有机磷类农药灵敏度试验结果农药浓度(mg/L)培养时间10 min30 min甲胺磷0.0312512.435.20.0625022.247.60.1250033.158.50.2546.672.20.554.283.81.071.489.12.087.592.64.093.796.9氧化乐果0.17521.6732.970.35041.049.00.70045.762.471.40069.6772.42.00078.1378.13久效磷0.1515.840.90.332.151.50.659.472.71.280.786.72.485.392.1对硫磷0.3548.056.50.753.062.41.071.873.11.579.380.52.888.788.6甲拌磷0.337.660.80.756.375.21.072.082.81.276.285.22.49194.2表11酶对几种氨基甲酸酯类农药灵敏度试验结果农药浓度(mg/L)培养时间10 min30 min抗蚜威0.1254.516.00.2517.431.50.544.951.4179.179.2282.783.5速灭威0.12512.116.20.2531.742.40.563.068.0184.988.3288.692.4仲丁威0.062523.826.90.12526.931.00.2538.445.20.550.958.7168.574.428589.1西维因0.037516.317.50.07521.324.30.1537.743.50.355.461.50.675.476.21.287.289.72.495.596.4呋喃丹0.07540.850.80.1542.963.20.361.773.80.773.684.91.282.892.8从以上表可以看出，虽然农药对酶活性的抑制灵敏度不一样，但趋势是一样的，即农药浓度越高，酶活性被抑制率也就越大。另外，酶抑制率小于70时，各农药对酶活性的抑制随浓度变化较大，而当抑制率大于70时，抑制率随农药浓度的变化趋于平缓。因此，为免假阳性的产生，以70抑制率为检测方法的判断参数是有道理的。从以上图表结果还可看出，不同培养时间农药对酶活性的抑制率虽然不一样，培养时间长，抑制率值大，但它们抑制率的变化趋势是相同的，因此，改变判断参数抑制率的值以缩短检测时间应该是可行的。6.生物传感器的研制以戊二醛为交联剂，制备了一种基于氯化丁酰胆碱酯酶的酶电极型生物传感器，并考察了酶电极的制备条件、稳定性及对传感器工作过程的影响，初步明确了传感器制作中的关键步骤。6.1酶电极的制备（1）分别配制0.1M的NaH2PO4和0.1M的Na2HPO4；缓冲液分别取0.1M NaH2PO4；缓冲液61.0 mL, 0.1M的Na2HPO4；缓冲液39mL。将二者混和均匀，并利用两种缓冲液调节pH值为8.0。（2）称取牛血清白蛋白（BSA）0.175 g，溶于0.825 mL上述pH=8.0的磷酸缓冲液中。（3）用移液器分别取9 L的BuChE溶液置于各支5 mL离心试管中；用移液器分别取15 L的BSA也同样置于各支离心试管中，并用离心机使之混和均匀。（4）配制10%的戊二醛溶液。（5）用移液器移取3 L的10%的戊二醛溶液至每支离心试管中，将其与BuChE与BSA的混和溶液迅速混和均匀，并涂覆与pH电极表面。（6）将制得的酶电极在室温下干燥10 min后，放入甘氨酸溶液中浸泡30 min。（7）将酶电极从甘氨酸溶液中取出，用蒸馏水冲洗，在室温下干燥后放入冰箱中在-4下保存。（8）电极使用前