（材料科学与工程专业论文）可溶性壳聚糖的制备与性能研究.pdf

摘要 针对肥胖病症的高发因素和高危后果，结合壳聚糖已应用于肥胖及其相关疾病 的治疗现状，为了改善壳聚糖不溶于水，减肥效果不明显，有可能引发便秘等缺点， 本文制备了两种可溶性壳聚糖衍生物：( 2 羟基3 二甲基十八( 六) 烷基铵基) 丙基 壳聚糖( c 1 6 q c ，c 1 8 q c ) 和o 油酸酰化壳聚糖( o c 9 0 a c ) ，并测试了衍生物的结 构、结晶性能、热力学性能及溶解性能，优化了合成方法。在此基础上，研究了c 1 6 q c ， c 1 8 q c 对血脂蛋白和胆酸盐的吸附性能，并测试了o c 9 0 a c 对食用油中游离脂肪 酸、不饱和脂肪酸的吸附性能，以及对高、低密度脂蛋白的吸附能力。 结果表明：衍生化反应分别发生在壳聚糖c 2 位氨基( c 6 q c ，c 1 8 q c ) 和c 6 位 羟基( o c 9 0 a c ) 上，长链分子的引入降低了壳聚糖的结晶和热分解温度；c 1 6 q c ， c 1 8 q c 可很好的溶解于去离子水中，o 。c 9 0 a c 在二甲基亚砜( d m s o ) 中具有很好 的溶解性。c 1 6 q c ，c 。8 q c 对胆酸盐的吸附能力远大于壳聚糖，吸附量随胆酸盐浓度 增加而增大，在p h 值为6 0 时，吸附量达到最大，且吸附速率随温度升高而增快。 与壳聚糖相比，o c 9 0 a c 对于油酸、不饱和脂肪酸均有较高的吸附能力，而对油脂 的吸附能力变化不大；o c 9 0 a c 吸附游离脂肪酸的速度很快，在4 h 后，脂肪酸的 吸附达9 0 以上，在6 8 h 之后达到吸附平衡。c 1 6 q c ，c 1 8 q c 对血脂蛋白l d l 、h d l 均有较高的吸附率，选择性不佳；而o c 9 0 a c 能在显著降低l d l 水平同时对h d l 的影响很小，表现出优良的吸附选择性。 关键词：壳聚糖可溶性吸附能力胆酸盐脂肪酸血脂 a bs t r a c t t a k i n ga i ma tt h eh j 【g hi n c i d e n c ea n dh i i 曲d a n g e ro fa d i p o s i t y ，c h i t o s a nh a sb e e n s t u d i e dt oc u r ea d i p o s i t ya n di t sr e l a t i v ei l l n e s st h e s ey e a r s ，b u tt h ef u r t h e ra p p l i c a t i o nh a s b e e nl i m i t e dal o td u i n gt oc h i t o s a nc a l l ts o l v i n gi n w a t e ra n dt h ee f f e c to f l o s i n gw e i g h t i s n to b v i o u s i nt h i s p a p e r , t w ok i n do f n o v e l c h i t o s a nd e r i - v a t i v e sc i s 一9 一o c t a d e n c e a c e t y l a t e dc h i t o s a n ( o c 9 0 a c ) a n d ( 2 - h y d r o x y l - 3 - d i m e t h y ll o n gc h a i na m m o n i u m ) p r o p y lc h i t o s a n ( c 1 6 q ca n dc l s q c ) w e r ep r e p a r e dt h r o u g h i n t r o d u c i n go l e i ca c i da n d n ，n - d i m e t h y l o c t a d e c y l aq u a t e r n a r ya m m o n i u ms a l tg r o u - po n t ot h ed i s s o c i a t ea m i d oo r h y d r o x y lg r o u po fc h i t o s a nr e s p e c t i v e l y f t i r ，c n m r ，x p sa n dd s cw e r ee m p l o y e d t oc h a r a c t e r i z et h em a t e r i a l s s o l u b i l i t ye x p - e r i m e n ts h o w e dt h a t0 - c 9 0 a cc a ns o l v ei n d m s oa n ds w e l li nd m fa n dd m a c ，w h i l ec 1 6 q ca n dc , s q ch a v ea g o o ds o l u b i l i t yi n d e i o n i z e dw a t e r t h ea d s o r p t i o no fo - c 9 0 a ci nt h ee d i b l eo i la n db l o o df a t w e r et e s t e d m e r e o v e r , t h ea d s o r p t i o nt ob l o o df a t ，l i p i na n db i l ea c i do fc 1 6 q ca n dc , s q cw e r e a l s os t u d i e d r e s u l ts h o w e dt h a to c 9 0 a cc a l ls e l e c t i v e l ya b s o r bu n s a t u r a t e df - a t t y a c i d sa n dl i p i di ne d i b l eo i l t h ea b s o r p t i o nt ol d lo f0 一c 9 0 a ci su pt o6 3 7 c o m p a r i n gt o4 o fc h i t o s a n ，a tt h es a m et i m e ，t h ee f f e c tt oh d li ss m a l l f o r c 1 6 q ca n dc 1 s q c ，h i g h e ra d s o r p t i o nt ob i l ea c i dw e r eo b s e r v e d ，c 1 6 q ca n dc 1 8 一 q ce x h i b i tg o o da d s o r p t i o nt ob o t h l d la n dh d l ，w h i c hs h o w e dt h e yh a v ep o o r s e l e c t i v i t y k e yw o r d s ：c h i t o s a n ；s o l u b i l i t y ；a d s o r p t i o n ；b i l ea c i ds a l t ；p l a s m al i p i d s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的 研究成果，除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表 或撰写过的研究成果，也不包含为获得苤聋苤堂或其他教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中 作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名：识寸亚鲁签字日期：2 ，。7 年f 月岁伊日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解墨壅盘堂有关保留、使用学位论文的规定。 特授权苤壅盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检 索，并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名： 两干亚 签字日期：年月 罩 日 导师签名：乌、瓶即 ll 签字日期：夕司年，月如 日 第一章绪论 1 1 壳聚糖及其可溶衍生化 第一章绪论 甲壳素( c h i t i n ) 又叫甲壳质、几丁质、几丁聚糖、蟹壳素等，是自然界中唯一存 在的碱性多糖。壳聚糖( c h i t o s a n ) 是甲壳素脱乙酰基后( 壳多糖) 的衍生物，化学名称： 聚葡萄糖胺【( 1 ，4 ) 一2 一氨基一2 一脱氧一b d 一葡聚糖】。因其特殊的化学结构， 使壳聚糖具有膳食纤维的功能、高分子性能、成膜性、保湿性、吸附性、抑菌性、 抗辐射性及生物相容性和对动植物的器官组织细胞有生物功能。壳聚糖正在食品和 饮料业、保健品业、医药、日化、农业、养殖业、工业中的产品回收、分离工程、 生化工程、水质净化等环境工程学领域得到广泛的应用。但是甲壳素和壳聚糖既不 溶于水，也不溶于普通的有机溶剂，制约了它们的广泛应用。考虑到壳聚糖分子内 存在着游离氨基和羟基，经过化学改性可得到一系列壳聚糖衍生物，引入新的化学 活性基团，改变其物理化学性质，大大改善其可溶性，例如： 1 、酰化改性及应用 甲壳素和壳聚糖的酰化反应是化学改性研究最早的一种反应。通过引入不同分 子量的脂肪或芳香族酰基，所得产物在有机溶剂中的溶解度可大大改善。早期的酰 化反应是在乙酸和酸酐或酰氯中进行的，壳聚糖可溶于乙酸溶液中，加入等量甲醇 也不沉淀。所以，用乙酸甲醇溶剂可制备壳聚糖的酰基化衍生物。三氯乙酸二氯 乙烷、二甲基乙酰胺氯化锂等混合溶剂均能直接溶解甲壳素，使反应在均相进行， 从而可制备具有高取代度且分布均一的衍生物。酰化度的高低主要取决于酰氯的用 量，通常要获得高取代度产物，需要更过量的酰氯。当取代基碳链增长时，由于空 间位阻效应，很难得到高取代度产物f 。酰化壳聚糖反应通常发生在氨基上，但是 反应并不能完全选择性地发生在氨基上，也会发生o 一酰基化反应【2 】。在乙酸水溶液 中或在高溶胀的吡啶凝胶中，壳聚糖很容易发生n 一乙酰化反应。控制反应条件可 得到5 0 n 一乙酰化壳聚糖。由于它可在有机溶剂中形成凝胶，有较好的反应活性， 因此又可作为二次修饰的反应原料：如把水溶性甲壳素的水溶液加入吡啶和二甲基 甲酰胺等有机溶剂中，就可得到高溶胀性凝胶，用邻苯二甲酸酐和均苯四甲酸酐等 都可以与氨基发生n 酰基化反应【3 】。将溶胀的完全脱乙酰化壳聚糖加到邻苯二甲酸 第一章绪论 酐的吡啶溶液中，反应得到n ，o 邻苯二甲酰化壳聚糖，总取代度在0 2 5 1 8 1 之间， 溶于二甲亚砜、二氯乙酸和甲酸中，可以形成溶致液晶，它的临界浓度基本不受取 代度变化的影响【4 】。 为了甩壳聚糖制备有确定结构的衍生物和性能更好的功能材料，寻求一种容易 控制反应的方法显得尤为重要。在乙酸和酸酐或酰氯中进行的酰化反应条件温和， 反应速度较快，但试剂消耗多、分子链断裂十分严重【5 】。近年来的研究发现甲磺酸 可代替乙酸进行酰化反应。甲磺酸既是溶剂，又是催化剂，反应在均相进行，所得 产物酰化程度较高【6 】。如果能进一步提高衍生物的取代度，该方法具有潜在的商业 化价值。 2 、季铵化改性及应用 壳聚糖的季铵盐是一种两性高分子，一般情况下，取代度在2 5 以上季铵盐化 壳聚糖可溶于水。壳聚糖的季铵盐也可以分两个类型：一类是利用壳聚糖的氨基反 应制得，具体方法是用过量卤代烷和壳聚糖反应得到卤化壳聚糖季铵盐，由于碘代 烷的反应活性较高，是常用的卤代化试剂。j i a 等人【7 】用壳聚糖和醛反应，得到席夫 碱，再用n a b i - h 还原，然后和过量的碘甲烷反应制得了壳聚糖季铵盐。另一类是用 含有环氧烷烃的季铵盐和壳聚糖反应，得到含有羟基的壳聚糖季铵盐。许晨【8 】等人 用缩水甘油三甲基氯化铵和壳聚糖反应，合成了羟丙基三甲基氯化铵壳聚糖，它的 水溶性随取代度的增加而增大，完全水溶性产物的】0 溶液，可以与乙醇、乙二醇、 甘油任意比混合而不发生沉淀。壳聚糖季铵盐不仅有较好的抑菌性能，它还可以作 为优良的絮凝剂，在污水处理中得到应用。控带l j p h 值在9 1 3 之间，三甲基氯化铵壳 聚糖对谷氨酸钠生产废水c o d c r 的去除能力达到8 0 以上i b 】；而用壳聚糖作絮凝剂， 去除能力只有7 0 ，且只能在酸性环境使用。壳聚糖季铵盐处理油田污水和炼油废 水，既有絮凝作用，又可以有效杀灭硫酸盐还原菌s r b 菌。季铵盐壳聚糖还是一种 新型的性能优良的表面活性剂，唐有根等人通过壳聚糖接枝二甲基十四烷基环氧丙 基氯化铵，再磺化引入s 0 3 h ，合成了一种吸湿性极强、具有优异表面活性的新型 壳聚糖两性高分子表面活性剂，经测定，在环境湿度较大时，它的吸湿率超过了透 明质酸p j 。 3 、烷基化改性及应用 ：烷基化反应可以在甲壳素的羟基上( o 一烷基化) ，也可以在壳聚糖的氨基上进行 m 一烷基化) ，以n 一烷基化较易发生。一般是甲壳素碱与卤代烃或硫酸酯反应生成 烷基化产物。用不同碳链长度的卤代烷对壳聚糖进行改性，可制各乙基壳聚糖( e c t s ) ，丁基壳聚糖( b - - c t s ) ，辛基壳聚糖( o - - c t s ) 和十六烷基壳聚糖( c - - c t s ) 【1 o 】 2 第一章绪论 。壳聚糖的烷基化反应主要发生在c 2 上的一n h 2 上，c 3 、c 6 位的- - o h 上也可发生 取代反应。烷基化壳聚糖可用于化妆品中，还可用于医学方面。 4 、醚化改性及应用 用类似纤维素改性的方法，碱性甲壳素与醚化试剂反应，可以得到羟烷基甲壳 素和羧烷基甲壳素。醚化甲壳素在化妆品方面有广泛的用途。另外，在医药方面， 可作创可贴、止血剂【l l 】；羧甲基壳聚糖能抗心率失常1 羽；交联羧甲基壳聚糖具有两 性离子交换能力；羟丙基甲壳素或羟丙基壳聚糖溶于水，可代替甲基纤维素制备人 工泪液该制剂能保护角膜。在食品工业中，羧甲基甲壳素可作保鲜剂。 5 、酯化改性及应用 常见的酯化反应有硫酸酯化和磷酸酯化【13 1 。用含氧无机酸作酯化剂，使甲壳素 或壳聚糖中的羟基形成有机酯类衍生物，反应一般为非均相反应，通常发生在c 6 位 的一o h 上。硫酸酯化甲壳素或壳聚糖的结构与肝索相似，抗凝血性高于肝素而且没 有副作用，还可制成人工透析膜。甲壳素硫酸酯能明显的抑制动脉粥样硬化斑块的 形成【1 4 1 。壳聚糖与c s 2 和n a o h 的水溶液在6 0 下反应6 h 后再与丙酮反应，可得到n 一黄原酸化壳聚糖钠盐。它是一种重金属去除剂，其水溶液可喷丝制壳聚糖纤维。 6 、s h i f t ( 喊反应及应用 壳聚糖上的氨基可以与醛酮发生s h i f t 碱反应，生成相应的醛亚胺和酮亚胺多糖 【”】。可用此反应来保护游离一n h 2 ，在羟基上引入其它基团：或用硼氢化钠还原得 到n 取代的多糖。这种还原物对水解反应不敏感，有聚两性电解质的性质。利用s h i r 碱反应可以把还原性碳水化合物作为支链连接到壳聚糖的氨基n 上，形成n 支链 的水溶性产物。 7 、接枝反应及应用 通过在甲壳素或壳聚糖的葡胺糖单元上接枝乙烯基单体或其它单体，合成半聚 合物多糖，可将合成聚合物的优异性能赋予甲壳素或壳聚糖。甲壳素及壳聚糖的接 枝物主要用于环境科学方面，如用作絮凝剂、离子交换树脂、生物降解塑料等。 1 2 壳聚糖在肥胖治疗领域的应用 1 2 1 肥胖及其危害 近年来，肥胖现象越来越普遍，呈全球流行态势。1 9 7 6 1 9 8 0 年间，美国人超 重或肥胖的比率为4 7 ；rj 6 而1 9 9 9 年的统计数字表明，超重或肥胖的比率已经上升 第一章绪论 到了6 1 t 1 7 】。在英国，1 9 8 0 年，肥胖的发病率分别为：成年男性6 ，成年女性8 ； 1 9 9 8 年，肥胖的发病率分别增长为1 7 和2 1 【1 8 】。加拿大心脏暨中风基金会最近发 表的一份年度报告指出，肥胖已取代香烟成为加拿大人健康最大的威胁。在我国， 随着经济发展和膳食方式的改变，我国人群肥胖增加的速度很快。1 9 9 2 年全国营养 调查时，2 0 - - - 7 4 岁超重者为1 4 ，而肥胖患病率尚不足3 。有数据表明，我国2 0 世 纪9 0 年代期间，成人超重者为2 4 4 ，肥胖者占3 o l ，超重与肥胖之比为8 ：1 ，可见 肥胖增长的潜在速度是很快的。武阳丰等【1 9 1 分别在“六五”期间( 1 9 8 1 1 9 8 5 年) 、“八 五”期间( 1 9 9 2 1 9 9 4 年) 、“九五”期间( 1 9 9 8 年) 对全国范围1 5 个人群进行了调查：在约 1 6 年的时间里，中年人群超重率男性平均上升了1 3 7 ，女性上升了9 5 ；我国部 分人群，特别是北方大中城市超重率己高达5 0 6 0 ，发展趋势与发达国家的进展 十分相似。我国目前肥胖分布的总体规律是：北方高于南方，中部地区介于其间； 女性高于男性；大城市、中小城市、内地农村依次递减。这种规律主要与地理地貌、 生活方式、经济收入、劳动强度和文化结构等密切相关。另外，我国儿童、青少年 肥胖现象也十分突出，2 0 0 0 年我国国民体质监测资料表明【2 0 】：城市7 , - - 1 8 岁青少年中 的肥胖患病率男性高达1 0 ，女性高达5 ，分别是1 9 9 5 年的1 7 倍和1 6 倍。据报道， 儿童时期4 0 的肥胖者成年后将发生肥胖，可预测我国在近几十年的肥胖患病率还 会进一步增加。按上述资料估算，我国目前拥有超重者至少2 - - - 3 亿，肥胖者至少3 4 千万。 1 2 1 1 肥胖病因简介 肥胖是指因体内热量摄人大于消耗，造成脂肪在体内积聚过多而导致体重超常 增加，当查不出明显的代谢内分泌疾病等病因者称为单纯性肥胖( s i m p l eo b e s i t y ) ， 约占肥胖的9 5 以上。肥胖属现代“文明病”，其发病与人民生活水平密切相关。随 着科技进步、社会生产力的发展，人体的体力活动减少和高热卡饮食，造成体内热 卡过剩并以脂肪的形式在体内堆积，形成肥胖。引起肥胖的病因相当复杂，主要可 分为遗传因素和环境因素两大类： 、遗传因素1 2 卜趵j 作为一种复杂的基因表型，肥胖呈现出一种复杂的遗传现象。体重指数( b m i ) 、 皮褶厚度、局部脂肪分布、热量摄入代谢率和热量消耗、休息时的代谢率等均受遗 传因素影响。这些影响是多基因作用的结果，但也与主基因的作用密切有关。近年 来已发现了十多个易感基因与肥胖症相关，对这些基因的功能及其发病机制正在深 入研究。肥胖的基因表型是复杂的多基因系统，且伴有基因一基因和基因环境的相 4 第一章绪论 互作用，来自动物模型的资料已经表明，单基因突变在肥胖发生中具有重要地位。 目前，与肥胖相关的基因研究集中在瘦素基因( l e p t i n ，通过白色脂肪细胞产生瘦 素来表达，基因缺陷是o b d , 鼠肥胖的原因) 、瘦素受体基因( 受体存在于下丘脑、 肾脏和脂肪细胞，主要调节摄食、体温和自发性体力活动) 、神经肽y 基因( n p y ， 是瘦素作用的中枢部位，是调节食欲的重要因素) 、p 3 一肾上腺素能受体基因( p 3 一 a r ，在白色和棕色脂肪细胞膜上的特异性肾上腺能受体，活化u c p ) 、人解偶联蛋 白基因( u c p ，由棕色脂肪细胞产生，促进产热) 和葡萄糖转运体4 基因( g l u t 4 ， 如白色脂肪细胞产生，受胰岛素调节的葡萄糖转运蛋白) 等。 目前认为，人类肥胖者瘦素水平升高( 但仍然有一部分病人存在瘦素分泌相对 不足，对这类病人可用瘦素治疗) ，主要是中枢发生瘦素抵抗状态( 这种抵抗是发 生在受体本身还是受体后水平还需深入探讨) 。n p y 广泛分布于中枢和周围神经系 统，被认为是强有效的刺激摄食因素。b 3 一a r 起产热和促进脂肪分解作用，u c p 3 存在于线粒体内，促进产热过程。肿瘤坏死因子一a ( n 晒一a ) 是激活状态时巨噬 细胞产生的细胞因子( 当机体处于被感染、创伤、肿瘤等应激状态时n 盯一a 水平上 升) ，机体注入重组t n f a ，可作用于脂肪组织，减少胰岛素介导的葡萄糖摄取， 促进l e p t i n 的合成。 二、环境因素 l 、教育水平与社会经济地位教育水平高低明显影响到个体许多行为和生活 方式。在发达国家，含脂肪、碳水化合物丰富的食品价廉，低收入阶层摄入量大， 故经济地位越低其肥胖的患病率越高。 2 、运动运动不足不仅使机体能量消耗减少，而且在肌肉组织由于胰岛素抵 抗性增大而直接导致糖耐量低减，这些都促进肥胖发生。 3 、饮食因素高脂肪高热量饮食且过少食入蔬菜及其他膳食纤维有助于肥胖 发生，此外，嗜零食、甜食和晚餐进食过饱也是促成肥胖的重要因素。 4 、生活方式有人观察每天看电视4 h 以上者发生肥胖是看电视l h 以下者的两 倍，其原因为少动。 5 、激素分泌异常高胰岛素血症可导致胰岛素抵抗，造成代谢异常，脂肪细 胞增大产生肥胖。经过锻炼体重下降，胰岛素抵抗可改善，血浆胰岛素水平也可随 之下降。 1 2 。1 。2 肥胖对健康的危害 一项涉及7 5 万人的大规模前瞻性研究发现 2 7 】，肥胖患者由于各种原因引起总死 第一章绪论 亡率升高，在体重超出平均水平4 0 的人群中，死亡危险增加了1 9 倍，w h o 最近对 肥胖者发生某些健康问题的相对危险性作了报道： l 、肥胖与心血管危险因素 2 8 】 一些心血管的危险因素，( 如高血压、血脂异常等) 均和肥胖有关，研究表明， 肥胖可能是冠心病的独立危险因素，随着体重指数升高，心血管疾病的发病危险电 上升。肥胖患者发生高血压的危险性显著增加，且常伴有血脂增高，其特征是t o 、 l d l 、a p o b 升高和h d l 减低，近来有人提议，预测香港华人体脂异常的最佳b m i 切点男性为2 3 k g m 2 ，女性为2 4 k 咖2 。 2 、肥胖与2 型糖尿病【2 9 1 全身肥胖和腹部肥胖与2 型糖尿病密切相关，在许多亚太地区患者中，2 型糖尿 病与胰岛素抵抗及高胰岛素血症相关。( 近年来有人提出香港华人发生2 型糖尿病最 佳体重指数切点为：男性2 4 3 k g m 2 ，女性2 3 2 k g , m 2 ) 。在肥胖发病率上升的同时， 2 型糖尿病的发生率也同步上升。 ， 3 、代谢综合征( 3 0 】 肥胖患者易发生胰岛素抵抗，糖尿病( 或糖耐量异常) ，血脂增高( 以甘油三 脂明显) 、高血压、冠心病和中风。文献中又称为x 综合征、胰岛素抵抗综合征， 对人体健康构成重大危害。 4 、对女性生殖系统的影响【3 1 ，3 2 】 肥胖女性易患多囊卵巢综合征、月经失调、不育且流产发生率较高。有报道认 为激素替代治疗能防止妇女腹部脂肪沉积。 5 、对呼吸功能的影响【3 3 】 肥胖患者易并发肺动脉高压、睡眼呼吸暂停综合征，严重者可猝死。 6 、对胃肠疾病的影响f 3 4 】 肥胖者易患脂肪肝、胆囊炎、胆结石等病。 7 、对肌肉骨骼的影响 肥胖者可致脊柱及四肢机械负荷增加，可致背痛、骨关节炎，并可致血尿酸增 加引起痛风。 8 、对肿瘤的影响【3 5 】 美国癌症协会一项对肥胖者的前瞻性研究表明：肥胖者发生癌症的危险度增加 ( 男女分别为1 3 3 ，1 3 ) ，其中肥胖男性好发结肠和直肠癌，女性好发胆囊、胆道、 乳腺、子宫和卵巢肿瘤。 6 第一章绪论 1 2 2 壳聚糖应用于肥胖及其相关疾病的治疗 1 2 2 1 治疗机理 很早人们就发现从发现单纯的壳聚糖可以吸附自身重量很多倍的油脂，相关动 物实验发现：壳聚糖能有效阻止消化系统吸收胆固醇和甘油三脂，防止胆固醇及脂 肪酸在体内蓄积，促进这些物质从体内排出【3 6 1 。如饲喂高脂肪混合饲料的大鼠，同 时加入壳聚糖两周后，实验组的粪便中脂肪含量明显高于对照组【3 7 ) 。杨铭铎等【3 8 】通 过模拟体外消化，发现当壳聚糖与脂肪酸比例为l ：8 时，壳聚糖可以较好的络合胆 汁酸，干扰机体对脂肪的吸收，使摄入的脂肪排出体外。 壳聚糖能够减肥的机理是因为在与胃肠道有相同p h 条件下能形成带有正电荷 的氨基群，胃肠道内，带负电荷( ) ( 一c o o 一) 的分子，如脂肪、脂肪酸( 包括油酸、 亚油酸、棕榈油、硬脂酸等) 、其他脂质以及胆汁酸( 胆酸、脱氧胆酸、石胆酸) ，被 壳聚糖带有正电荷的氨基群强烈吸附。壳聚糖还可以通过疏水键结合中性脂质，干 扰它们的正常乳化。这种静电作用和疏水结合引起了大的聚合物形成，而在人体的 消化过程中只能被轻微的降解。因此，壳聚糖与脂肪、脂肪酸、其他脂质以及胆汁 酸形成离子复合物，抑制了它们吸收而被正常地排除体外。 此外，壳聚糖作为调血脂药物的研究日益受到人们的重视，由于壳聚糖容易和 胆汁酸结合并全部排出体外，那么，为了保持胆汁酸正常含量就必须在肝脏中将胆 固醇转化为胆汁酸，其结果是血液中的胆固醇含量必然下降，从而降低血脂。张淑 琴等【3 9 】通过对进行口服壳聚糖的安全性及调脂观察。实验组服用壳聚糖前后胆固 醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇均降低，差异有显著性意义，壳聚糖对于胆固 醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇具有调节功效，通过对壳聚糖几种衍生物对血 脂的体外吸附实验选择出吸附能力较好的一种进行口服壳聚糖的安全性及调脂观 察。由体外血脂吸附结果看，壳聚糖对胆固醇、三酰甘油、高密度脂蛋白胆固醇、 低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇与胆固醇之比有良好的调脂作用。l e h o h x 和g r o n d i n 柏】研究了壳聚糖和消胆胺对老鼠血浆和肝脏胆固醇水平、肝脏重量、 羟甲基戊二酸单酰c o a ( h m gc o a ) 还原酶的影响。在给实验动物喂饲包含1 胆 固醇s d 0 2 胆酸的固醇食物基础上，添加了5 壳聚糖的试验组抑制了血浆和肝脏胆 固醇的增加，分别为5 4 和6 4 。而消胆胺完全阻止了它们的增加。与正常饮食组 比较，h m gc o a 还原酶活性在固醇食物组和固醇一壳聚糖混合膳食组均显著下降， 而在消胆胺组却增加了其活性。而h m gc o a 还原酶是胆固醇合成的限速酶，其活 性的下降使胆固醇的合成效率降低。 7 第一章绪论 1 2 2 2 壳聚糖用于治疗肥胖的安全性 作为口服的减肥药物，对壳聚糖的安全性研究就显得尤为重要。为了解壳聚糖 的口服安全性，石玲掣4 l 】进行了小鼠的最大耐受量测定及大鼠的长期毒性研究。以 小鼠2 4 h 最大灌胃药量以及一次性最大腹腔注射药量表示最大耐受量。大鼠按临床最 大用药剂量的2 0 倍、1 0 倍、5 倍分别灌胃3 个月，作长期毒性试验。最大耐受灌胃量 为4 9 8 0 m g k gb w ，是临床用量的1 2 4 5 倍，一次性最大腹腔注射量为1 6 6 0 m g k g b w ，两组小鼠全部存活。3 组大鼠喂药3 个月后全部存活，体重和血常规、肝功能、 肾功能、血糖、血脂等生化指标均正常。人体解剖及病理检查与正常对照组均无差 异。结果表明：壳聚糖长期口服，无明显毒副作用，使用安全。吴晴斋等【4 2 】选用6 1 5 d 的妊娠小鼠，研究了甲壳质的致畸胎作用，日剂量为2 2 5 m g k g 、9 0 0 m g k g 、 3 6 0 0 m g k g ，连续给药1 0 d ，没有明显的胚胎毒性和致畸作用。吴晴斋等【4 3 】还研究 了甲壳质对小鼠的致突变实验，他们将甲壳质研制成粉末，临床前用蒸馏水配制成 不同浓度的混悬液。实验采用a m e s 实验中规定的4 株标准菌株t a 9 7 、t a 9 8 、t 1 0 0 和t a l 0 2 ，按照m a r o n 等修订方法进行检测，共两批实验，每批实验，每一浓度测试 点做3 个平行皿，最后计算两批实验的平均值。实验结果的评价，是以比较各剂量的 回变菌落数与阴性对照组的倍数为基础，如相当于或大于阴性对照组的两倍，并在 一定剂量范围内存在剂量反应关系，则判定为阳性。结果表明：壳聚糖浓度在1 o 一 1 0 0 0 0 0u i i l l ，无论在加与不加s 9 活化系统条件下，均无致突变作用。o n i s h i 和m a c h i d a 4 4 研究了壳聚糖的生物降解性、体内分布和尿排泄量。生物降解性分别以溶 菌酶、小鼠血浆、尿为介质培养得到观察，发现壳聚糖和荧光素标记的壳聚糖硫酸 盐因为三种介质的存在其生物降解性加速。气相色谱法测定其分子量，发现降解产 物分子量相当小。壳聚糖盐的体内分布和尿排泄在腹膜内给药l h 、1 4 h 和2 4 h 后得到 测定。发现壳聚糖盐很快分布到肾脏和尿内，很少分布到肝、脾、腹部和血浆。大 部份壳聚糖盐在1 4 h 后被分泌到尿中，且其分子量比长时间体外生物降解所获得的产 物小。因而，壳聚糖有很好的生物降解性并且很容易从尿中排泄，进一步表明壳聚 糖不会在体内产生蓄积效应。w u o l i j o k i 等做的实验表明，壳聚糖有很好的耐受性， 没有严重的副反应或者实验室安全指标的变化，如血清脂溶性维生素a 和e 以及血清 铁和转铁蛋白都做了检测。在8 周的实验中，当壳聚糖在胃肠道内吸附其他化合物， 如脂肪及其他营养素时，可能不会显著干扰血清维生素和其他一些重要营养素的水 平。但是，建议要同时食用壳聚糖或营养素添加剂时，有一个适宜的间隔期也是必 要的。 8 第一章绪论 因壳聚糖添加剂大多来源于水生贝壳类动物产品，所以对水生贝壳类动物有变 态反应的人群应提高警惕性。壳聚糖产品可能被重金属污染，如铅、汞、铁和铜等， 因而小孩、孕妇、乳母应避免使用壳聚糖。还没有壳聚糖与药物有相互作用的报道， 但是当壳聚糖与高脂溶性药物同时使用时要提高警惕性。 通常说来，虽然某些研究中的剂量高达6 9 d ，但是人们服用壳聚糖用于高胆固 醇血症时使用1 0 0 0 - 1 2 0 0 m g 次，每天2 次；当用于减肥时，壳聚糖使用量可在1 5 g d ，采用多次使用。关于使用壳聚糖后的副反应，如恶心、腹泻以及便秘。目前， 还没有关于这些副反应严重到使受试者停止使用壳聚糖的报道。 综上，壳聚糖无毒性，不与体液反应，对组织也不起抗原抗体反应，并且可生 物降解，对细胞具有亲和性，尤其适合在医疗保健方面的应用。因此，加强壳聚糖 在医药与医疗保健方面的应用研究，将对肥胖及其相关性疾病的预防和治疗发挥积 极的作用，也具有广阔的前景。 1 3 壳聚糖衍生物应用于减肥领域的研究 1 3 1 国内外的研究现状 单纯使用壳聚糖作为药物虽然在肥胖及其相关领域的取得了有效的成果，但是 也存在着不少缺点，如壳聚糖作为聚阳离子化合物，对脂肪物质在胃中会分解的胆 固醇、甾醇、甘油三酸酯等中性脂质吸附能力不强；壳聚糖在肠道环境中为不溶解 状态，降低了其对脂肪酸的吸附效率 4 s 。通过对壳聚糖进行改性，利用其衍生物来 减肥和相关疾病方面的治疗的尝试，具有很积极的意义。目前国内外对此方面的研 究也开展的不少，主要集中在两个方向： 一、通过将壳聚糖与油脂的复合，这种结合是通过离子键的作用。这种复合盐 经过哺乳动物的消化后，可能通过疏水作用而与其他一些脂类结合，这种被壳聚糖 微团结合后的脂类绝大部分被哺乳动物排泄而非吸收。因为，壳聚糖复合盐含水甚 微，所以胃内的盐酸不能将其水解，壳聚糖脂类微团到肠腔后由于其在上消化道的 高吸水性，体积越来越大，并不断结合过多的脂类。被结合的脂类避免了被酶水解， 因此，促进了脂类物质包括胆固醇、固醇和三酰甘油的排泄。例如王星【4 6 】将壳聚糖 与硬脂酸复合，用紫外光谱研究了其对小麻油与橄榄油脂的吸附情况，加入硬脂酸 壳聚糖复合物后两种油吸光度大大降低，说明其具有明显的吸油效果。反常的是复 合物用量增大，并非吸油量增大，其原因有待进一步研究。结果证明，壳聚糖与硬 9 第一章绪论 脂酸间主要以盐键结合，复合物能明显吸附中性油脂：将定量的壳聚糖与定量的油 酸，在一定的温度条件下，经高速搅拌器均化而成的高质量乳液，制备得到壳聚糖 油酸脂，观察了7 8 名肥胖症患者应用壳聚糖油陵酯前后体重和血脂的变化。结果表 明：应用6 0 天降低体重总有效率为9 7 4 ，平均降低3 8 k g ，胆固醇、甘油三酯明显 降低( p n m p c c s ，o p c s n m p c c s ，c s n m p c o p c s ，n m p c 和o p c s 对l d l 的选择性系数较高。对t g 吸附效率的变化，可能是由于空间位阻效应的影响；对t c 、l d l 、h d l 的吸附率 的变化，可用静电效应来解释：表明具有阴离子性的亚磷酸根、磷酸根基团引入后， 静电吸附增强了与l d l 、t c 此类带有阳离子基团的物质的作用力，使吸附性能大 幅增加，同时亲水性基团的存在使其对于各脂蛋白的作用环境较壳聚糖有了很大的 改善，作用面积大为增加。对l d l 吸附率增高的同时，对于带负电性的h d l 的吸 第一章绪论 附性能较壳聚糖有所下降，由7 1 9 8 降至2 8 4 7 、1 5 5 2 ，这是由于磷酸基团的 负电性与h d l 发生静电排斥，所以吸附效率变化程度较大。而o p c s 的接枝度较 高，因此其吸附变化较大，恰恰也验证了阴离子效应的变化。血脂吸附剂的作用是 希望对l d l 的高吸附率而对h d l 少吸附。因此阴离子型壳聚糖衍生物的吸附选择 性达到了预期的一定目标。 1 4 论文工作的提出 目前肥胖已在全球范围内广泛流行，1 9 9 9 年w h o 以正式宣布肥胖是一种疾病。 由于肥胖症的高发因素和高危后果，已引起人们的关注。肥胖症是遗传因素与环境 因素共同作用所导致的营养代谢障碍性疾病，是慢性疾病发生的主要诱因。它可以 诱发与心血管疾病相关的多种代谢功能异常，会增力1 i i 型糖尿病、冠心病、中风、 充血性心力衰竭、高血压、脂质异常血症、睡眠时呼吸暂停综合症及某些癌症( 如卵 巢癌、胸腺癌和结肠癌) 等的发病率和死亡率。随着世界上许多国家工业化和城市化 的程度不断加深，肥胖症的发病率和死亡率也随之不断升高，预防和治疗肥胖症已 经成为2 1 世纪的首要健康问题。 壳聚糖无毒性，不与体液反应，对组织也不起抗原抗体反应，并可生物降解， 对细胞具有亲和性，尤其适合在医疗保健方面的应用，自从2 0 世纪7 0 年代末发现其 具有降血脂和降胆固醇作用以来，将壳聚糖应用于肥胖及其相关疾病的治疗方面的 报道就层出不穷。但是由于壳聚糖不溶于水，需要较大的口服剂量才能显示出效果， 有可能引发恶心、便秘等副反应。本文拟通过对壳聚糖进行改性，增强其溶解能力 和对胆酸、油脂、血脂等的吸附能力，期望能研制出适宜用于治疗肥胖的医药与食 疗保健品的壳聚糖衍生物。 为此，本论文拟进行如下课题设计和研究工作： 为提高壳聚糖对油脂的吸附能力，设计制备油酸酰化壳聚糖衍生物，利用其 油溶性直接改善其对肠胃中油脂的吸附作用，用于防止肠道消化吸收脂肪，降低血 清中的胆固醇，从而达到预防和治疗肥胖的目的。 为提高壳聚糖对胆酸的吸附能力，设计制备壳聚糖季铵化阳离子衍生物，导 致其在中性介质中的离子化程度大为提高，进而极大的提高壳聚糖对胆酸的吸附能 力。同时，也有可能提高壳聚糖对血脂的吸附能力。 综上，本文的工作重点是： ( 1 ) 选择合适的试剂，制备水溶性长链烷基化壳聚糖季铵盐，通过正交实验，优 1 2 第一章绪论 化最佳反应条件，并通过红外光谱、核磁共振谱等方法对其结构进行表征。 ( 2 ) 考察长链烷基化壳聚糖季铵盐对脱氧胆酸盐的吸附性能，并讨论对可能影响 其吸附性能的条件和因素；扫描电镜观察壳聚糖和长链烷基化壳聚糖季铵盐吸附胆 酸盐前后的形貌变化。 ( 3 ) 测试长链烷基化壳聚糖季铵盐对血脂的体外吸附能力，作出初步的分析和讨 论。 ( 4 ) 制备油溶性油酰化壳聚糖衍生物，通过正交实验，筛选出最佳反应条件，并 对其结构进行表征。 ( 5 ) 考察油酸酰化壳聚糖衍生物对油脂的吸附性能，并讨论对可能影响其吸附性 能的条件和因素；扫描电镜观察壳聚糖和油酸酰化壳聚糖衍生物吸附油脂前后的形 貌变化。 ( 6 ) 测试油酰化壳聚糖对油脂和血脂的体外吸附能力，作出初步的分析和讨论。 第二章长链季铵化壳聚糖的制备与性能研究 第二章( 2 羟基3 一二甲基长链烷基铵基) 丙基壳聚糖的制备与性 能研究 2 1 合成路线设计 季铵化壳聚糖属于阳离子型壳聚糖衍生物，溶解性好，既保留了壳聚糖的结构 特点又具有了阳离子吸附剂的优良的特性，季铵盐型壳聚糖的合成是首先长链叔胺 与环氧氯丙烷反应生成环氧丙基长链烷基二甲基氯化铵，然后再与壳聚糖在一定条 件下反应，从而制得( 2 羟基3 一二甲基长链烷基按基) 丙基壳聚糖。它的合成路线如 图2 1 所示： ， 图2 1 季铵化壳聚糖的合成路线j f i g 2 - 1s y n t h e s i sp r o c e s so fq u a t e r n a r ya m m o n i u mc h i t o s a nd e r i v a t e s 季铵化壳聚糖的结构式如图2 2 所示：( 式中r 为长链烷基c i l h 2 。+ 1 ) c h 3 图2 2 季铵化壳聚糖的结构示意图 f i g 2 - 2m o l e c u l a rs t r u c t u r eo fq u a t e r n a r ya m m o n i u mc h i t o s a nd e r i v a t e s 1 4 第二章长链季铵化壳聚糖的制备与性能研究 2 2 实验部分 2 2 1 仪器及主要原料 实验仪器：h z q - x 1 0 0 振荡培养箱、w f z 2 6 a 型紫外分光光度计、m o d e l p e r k i n e l m e rd s c 7 型差示扫描量热仪、n i c o l e t5 6 0e s pf t i r 红外光谱仪、p h s 一 2 c 型精密酸度计( 上海雷磁仪器厂) 、e g g 公司q c a 9 1 7 型石英晶体微天平 ( q c m ) 等。 主要药品：壳聚糖( 分子量5 0 0 0 、1 万、2 3 万) 、十六叔胺、十八叔胺、甲醇、 乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、甲酰胺、油酸、n n 二甲基乙酰胺( d m a c ) 、n ，n 二甲 基甲酰胺( d m f ) 、环氧氯丙烷、氯仿、环己烷、二甲基亚砜( d m s o ) 、血清( 天 津市黄河道血站) 、高密度脂蛋白试剂盒、低密度脂蛋白试剂盒等。( 试剂非特殊注 明均为分析纯) 2 2 2 ( 2 一羟基。3 一二甲基长链烷基铵基) 丙基壳聚糖( c 1 6 q c ，c 1 8 q c ) 的制 备 2 2 2 1 ( 2 - 羟基一3 二甲基十六烷基铵基) 丙基壳聚糖( c 1 6 q c ) 的制备 ( 1 ) 环氧丙基二甲基十六( 八) 烷基氯化铵的制备 以异丙醇一水( 体积比为2 1 ) 混合溶剂为反应介质，十六( 八) 烷基二甲基叔 胺与环氧氯丙烷( 投料摩尔比1 ：1 2 ) 在5 0 - - 5 5 c 下反应6 7h ，减压蒸去溶剂，用 乙醚洗涤除去未反应物，得环氧丙基二甲基十六( 八) 烷基氯化铵。反应过程如下 图： c i c 彳三h c h 2 + 甲c 一2 ) 2 c h 2 0 n c h c h 2 一! + _ h a c h 3 c 。一 ( c h 2 ) m c h 3 洼；m 1 5 1 7 ( c h 2 ) m c h 3 ( 2 ) ( 2 一羟基一3 - 二甲基十六( 八) 烷基铵基) 丙基壳聚糖( c 1 6 q c ) 的制备 在1 0 9 壳聚糖中加入4 2 的n a o h 溶液，搅拌均匀，而后加入】5 m l 异丙醇， 缓慢、分批加入上述反应所得黄色蜡状固体，加热条件下反应一段时间。用盐酸调 p r = 1 ，分别用甲醇、乙醇过滤、洗涤，真空烘干，得灰色粉末，反应过程如下图： 第二章长链季铵化壳聚糖的制各与性能研究 o n c h l c h 一3 c h 2c h 2 - - n t - - m e z c l ( 与h 2 ) m c h 一 一 - o h h ( o h ) c h 2 掣n t m 2 e 糯2 c i 为了确定制备c 6 q c ，c 1 s q c 的最佳的反应条件，对其合成进行了正交实验，其 中考虑壳聚糖与环氧丙基二甲基十六( 十八) 烷基氯化铵的配比、温度和时间三因 素，制定三水平三因素正交实验，具体条件如表2 1 所示： 表2 - i 正交实验表 t a b l e2 1t h eo r t h o g o n a l i t yt e s td e t a i l s 投料比( t o o l ：m 0 1 )温度反应时间 g i q 曼g i g q gl 竺2l 皇2 实验一 l ：1l ：l4 01 2 。 实验二1 ：1l ：16 02 4 实验三 l ：1l ：l80，48 实验四 1 ：21 ：26 01 2 实验五l ：2 1 ：28 02 4 实验六 1 ：21 ：24 04 8 实验七 1 ：31 ：38 01 2 实验八 1 ：31 ：36 02 4 实验九 1 ：31 ：34 0 4 8 2 2 2 2 季铵化度测定 采用电位测定法测季铵化度，实验中用银电极作为测量电极，甘汞电极作为参 比电极。具体方法如下：精密称取衍生物加蒸馏水3 0 m l 溶解，用o 1 m o l m l 硝酸银 标准溶液滴定，电位法指示终点。 计算公式： 季铵化度= 0 i v ( 一0 1 v 5 1 5 ) 1 6 1 + 0 1 v 其中：0 1 ：a g n 0 3 浓度； v ：消耗a g n 0 3 的体积m l ； 1 6 第二章长链季铵化壳聚糖的制备与