【word】 抗菌肽在反刍动物生产中的应用.doc

抗菌肽在反刍动物生产中的应用第32卷第2期2011年4月内蒙古农业大学journalofinnermongoliaagriculturaluniversityv01.32no.2apr.2011抗菌肽在反刍动物生产中的应用火焱,罗旭光(内蒙古农业大学动物科学学院,呼和浩特010018)摘要:抗菌肽是动植物先天性免疫系统的组成部分.本文综述了抗菌肽的概念,功能,作用机理和分类,分析其在反刍动物生产上的应用和发展前景及存在的问题.关键词:抗菌肽;反刍动物;应用中图分类号:$852文献标识码:a文章编号:10093575(2011)02031904antimicroblalpeptidesanditsapplicationtoruminantproductionhouyan,luxuguang(collegeofanimalscience,innermongoliaagriculturaluniversity,huhhot,010018,china)abstract:antibacterialpeptidesarepartofthenaturalimmunesystemofallplantsandanimals.thearticlefocusesonconcept,function,mechanismofactionandclassofantimicrobialpeptides,andgivesananalysisintoruminantproduction,possibleapplicationsandtheexistingproblemsofantibacterialpeptides.keywords:antimicrobialpeptides;ruminant;application抗菌肽(antibacterialpeptides)是生物体产生的一种具有强抗菌作用的阳离子多肽,一般其分子量小于5ku,氨基酸数目小于100,是生物先天免疫的重要组成成分.1972年,瑞典科学家boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能j,随后首先从惜古比天蚕蛹诱导分离到具有抗菌活性的多肽,命名为cecropins.迄今为止已在许多生物包括昆虫,鸟类,动物,植物及原核生物中发现600多种内源性抗菌活性肽.可大致分为4类:cecropins(杀菌肽),富含pro残基的magainins(蛙皮素),富含gly残基的melittins(蜂毒素)和富含cys残基的defensins(防御素).这些抗菌肽除了具有广谱的抗菌活性外,同时还有高效的抗真菌和(或)抗病毒和(或)原虫和(或)抗肿瘤活性性j.这些抗菌肽不仅有广谱抗细菌能力,而且有的对真菌,病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用此外,还具有稳定性好,水溶性好,抗菌机理独特,对高等动物正常细胞无害等特点.目前许多抗菌肽的cdna已被克隆测序,并对某些抗菌肽基因进行了初步的基因定位和表达调控的研究引.近几年来,有关抗菌肽及其应用逐渐成为动物学,植物学,药理学及生理学领域研究的热点.1反刍动物抗菌肽分类根据分子结构特征,牛抗菌肽主要分为两大类:防御素(defensins)和cathelicidins.前者含有6个保守半胱氨酸,形成3个分子内二硫键;后者含有保守cathelin区域,形成结构各异的抗菌肽.牛抗菌肽共有13种,主要包括牛13一防御素(bovineneutrophildefensins,bnd),气管上皮抗菌肽(trachealantimicrobialpeptide,tap),舌抗菌肽(bovinelingualantimicrobia,llap),肠上皮细胞抗菌肽(intestinalepi.thelialantimicrobialpeptide,即肠肽素)及牛肽聚糖识收稿13期:20101103基金项目:内蒙古自然基金(项目号200711020406)作者简介:火焱(1959一),女,副教授,主要从事动物组织胚胎方面的研究320内蒙古农业大学2011年别蛋白bovinepeptidoglycan(pgn)recognitionproteins,bpgrps.绵羊抗菌肽分为阳离子抗菌肽和阴离子抗菌肽两大类,11种.通过它们的结构把阳离子绵羊抗菌肽又可分为:防御素(defensin)和cathelicidins.阴离子绵羊抗菌肽到目前仅仅发现1种,即气管表面活性阴离子抗菌肽(saaps)引.2反刍动物抗菌肽作用机理目前,关于牛防御素的作用机理尚不明确.一些研究者认为,抗病原微生物的过程是由于其分子表面所带的正电荷可与表面带相反电荷的靶细胞发生反应,形成电压依赖的离子渗透性膜通道,破坏细胞膜的完整性,继而导致细胞死亡.shaiy认为抗菌肽杀菌作用的具体过程大致可分为3步:(1)抗菌肽分子通过静电作用结合于细胞膜带负电荷的磷脂双层,使磷脂双层局部变薄;(2)在细胞膜电势的作用下,抗菌肽分子的疏水部分插入细胞膜,而其两性分子仅一螺旋插人膜内,多个抗菌肽分子共同形成离子通道,使膜通透化;(3)改变细胞膜的通透性及细胞能量状态,导致细胞膜去极化,呼吸作用受到抑制以及细胞atp含量严重下降,最终导致靶细胞死亡.harder_1叫等发现人的抗菌肽(b一防御素23)能够抑制细菌细胞壁的形成,使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻,并使细胞壁穿孑l,最终导致菌死亡.另外,抗菌肽带有正电荷,通过正负电荷间的静电作用就可以吸附到细菌等病原体的细胞膜表面,然后把疏水尾插入到细胞膜的疏水区域,从而改变膜构象,形成众多离子通道j,接着膜内的k+通过离子通道大量外流,造成atp合成下降,最后菌体因细胞呼吸受阻而死亡_】”j.由于抗菌肽形成离子通道的时间很短,有时不足以杀死病原体.在这种情况下会有一部分抗菌肽继续留在细胞内,与胞内多聚阴离子(如dna)起作用直至杀死病原体.抗菌肽的作用机理让细菌很难有机会产生有抗性的突变体,这对于开发新一类抗菌药物是很重要的.带正电荷的抗菌肽分子与带负电荷的细菌外膜lps结合,使正常膜结构被破坏,从而促进抗菌肽穿透外膜.外膜结构的破坏允许多种分子进入菌体内,包括疏水化合物,小分子蛋白和抗菌化合物,还可以自我促进抗菌肽的大量吸收.抗菌肽也可促进传统抗生素穿透细菌外膜,这可能是抗菌肽增强抗生素作用效果的主要原因l14j.saaps作用机理是锌离子盐桥作用.saaps富含阴离子,需要与锌结合形成阳离子盐桥才能发挥正常功能.盐桥能使多肽克服负电荷差,顺利穿过细菌外膜,不引起任何形态上的改变.一旦进入细胞质,saaps可能与核糖体相连,阻止核糖核酸酶的活性,最终引起胞质蛋白的沉淀和析出.3反刍动物体内的抗菌肽从牛气管黏膜分离得到的tap是从哺乳动物上皮细胞分离纯化得到的第一个抗菌肽,为其他哺乳动物上皮细胞抗菌肽的发现奠定了坚实的基础.schonwetter等研究表明,在牛气管上皮发现的抗菌肽tap和舌上皮发现的抗菌肽lap均属13一defensin家族,分别由42和38个氨基酸组成,都有抗g一菌和g+菌及真菌活性作用.在牛的中性粒细胞中发现了l3种b一防御素即bnbdli3.另lap,tap,bnbd一3,bnbd一9和bnbd一12在牛的乳腺组织也有表达.从牛奶中也分离出3种抗菌肽,试验表明其具有抑制肠毒性大肠杆菌及单核细胞增多性李氏杆菌的生长.在葡萄球菌引起的小白鼠脓毒血症中,应用牛的抗菌肽bmap一28可减少tnf一仅和no的释放,降低了死亡率.在水牛的回肠内发现有b一防御素的存在,其氨基酸和核苷酸序列均与lap最接近引.brogden等(1996)首次从绵羊肺的表面活化剂中分离到了3种阴离子抗菌肽,被命名为saaps(表面活化剂相关阴离子肽)el9.后来在支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,blaf)和呼吸道组织中也分离到了saaps_20j.目前,分离到的saaps仅有7个氨基酸长,这些肽在镁盐溶液中具有抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌活性,但溶于磷酸盐缓冲液时其活性大大降低.与阳离子抗菌肽的作用机制不同,saaps不是通过在细菌细胞膜上形成穿孔引起细菌死亡,相反,它们可引起细菌内死亡和细胞内容物絮凝作用.至今,在绵羊中至少已发现10种抗菌肽基因,从绵羊,山羊白细胞分离的抗菌肽oabac5和ch.bac5与牛bac5同源,富含pro,具有广谱抗菌特点,且在低盐浓度下仍有抗菌活性l2川.shamova等研究发现,富含pro的bac5肽类在反刍动物中高度保守,这可能有利于其先天的防御体系.在绵羊体内发现有两种p一防御素存在,即sbd一12,通过rtpcr检测显示sbd一1mrna表达较广,即在气管和整个消化道都有sbd一1mrna表达,而sbd一2的mrna只表达于舌和回肠远端.在山羊体内也发现2种b一防御素,即gbdl一2,gbd一1主要分布于舌和呼吸道,gbd一2分布于整个肠道.羊的阳离子抗菌肽samp一29,在多种微生物引起第2期火焱等:抗菌肽在反刍动物生产中的应用321的盲肠结扎败血症中,可减少炎性介质的产生和降低体内内毒素的循环水平.4反刍动物抗菌肽应用前景及存在的问题抗生素广泛使用及滥用导致耐药菌问题已经成为当今全球的公共健康问题.奶牛乳房炎是当今造成世界各国奶牛业损失最大的一种疾病.全国奶牛每年因乳房炎造成的损失约为100亿元.奶牛发生乳房炎后,一方面会导致牛奶废弃,奶产量,品质下降等损失;另一方面乳房炎患牛乳汁中有害菌还能使人患病.尽早发现,及时隔离,有效处理乳房炎患牛,已成为提高奶牛养殖效益急待解决的重要问题.但是因为乳房炎致病菌种类复杂,有真菌,革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,霉形体和病毒等150多种,且各种菌致病机理也不一样,临床治疗时必须将几种抗生素进行组合和超剂量使用,才能保证50%到80%之间临床治愈率.临床上对抗生素毫无节制地大量使用既会导致病原菌产生变异,生成具有更强抗药特性的新变种,更会在乳中残留通过食物链危害人类健康.所以,在奶牛生产中迫切需要一种既能抗多种细菌,又不产生耐药菌株,无残留且能在奶牛乳腺发挥特殊功效的药物,来防治奶牛乳房炎,降低奶牛饲养成本.牛抗菌肽具有广谱抗菌,热稳定,不易产生耐药性,作用机制独特等特点,在牛疾病治疗,特别是奶牛乳房炎的治疗等方面有着广阔的应用前景.绵羊抗菌肽最显而易见的用途是用于治疗绵羊疾病绵羊b一防御素和saaps在控制该病原菌的传播方面起重要作用(brogden等,1998)引.体外研究结果表明,saaps能有效杀死溶血性曼氏杆菌(brogden等,1996).体内试验结果表明,绵羊阴离子肽(ap)可减缓肺组织感染羊的炎症反应和细菌浓度(kalfa等,2001)引.感染后投药比感染前投药效果更显着.试验结果还显示发生在ap和溶血性曼氏杆菌问的结合和绵羊上皮细胞蜂窝状小窝有关(heidari等,2002).bordgen等(2001)研究了smap29和smap34对mhaemolytica菌和包括绿脓杆菌(paeruginosa)在内的其他绵羊病原菌的作用,结果表明,两者都具有广谱抗菌活性,其中smap29的活性更高一些.目前,研究的焦点主要集中在抗菌肽和溶血性曼氏杆菌(mannheimiahaemolytica)的关系上.该菌是一种绵羊呼吸道病原菌,如果不被控制可增殖扩散到上呼吸道和肺组织,引起急性肺炎引.反刍动物抗菌肽研究方面虽然已取得了许多创新性成果,但至今还有许多问题没有解决.各种反刍动物抗菌肽在机体细胞中的表达调控目前尚不清楚,对反刍动物抗菌肽与微生物膜结合以及形成离子通道的精确分子机制等方面的研究尚为空白.呼吸道,消化道,生殖道黏膜是机体的三大防御黏膜,目前还没有发现牛生殖道抗菌肽.与目前临床广泛使用的传统抗生素相比,抗菌肽的抗菌活性还不够强.反刍动物抗菌肽的基因工程和应用产品的开发研究相对滞后.为此,需要建立反刍动物抗菌肽体外高效表达系统,解决反刍动物抗菌肽的基因沉默以及表达产物生物学活性问题.这方面如若获得突破,将使反刍动物抗菌肽临床实际应用成为可能.参考文献:1bomanhg,nissoni,rasmusonb.inducibleantibacterialdefensesystemindrasophialj.nature,1972(237):232235.2morimotom,morih,otakt,eta1.inhibitoryeffectoftaehyplesiniontheproliferationofhumanimmunodeficiencyvirusinvitroj.chemotherapy,1991(37):32734.3bakerma,maloywe,zasloffm,eta1.anticancerefficacyofmagainin2andanaloguepeptidesj.cancerres,1993(53):30523057.4韩新燕,汪以真,许样荣.动物抗菌肽的研究进展j.中国兽医,2002,22(2):205207.5邱晓燕.抗菌肽的免疫功能和应用前景j.生物学通报,2002,37(1):2425.6rainardp,rioletc.innateimmunityofthebovinemammarygland(j.vetres,2006,37(3):369400.7dziarskir,guptad.mammalianpgrpslnovelantibacterialproteinsj.cellmicrobio,l2006,8(7):10591069.8陈琛,王新华,薄新文等.绵羊抗菌肽研究进展j.生物技术通报,2007(2):369shaiy.mechanismofthebinding,insertionanddestabilizationofphospholipidsbilayermembranesbycthelicalantimicrobialandcellnon-selectivemembranelyticpep-?tidesj.biophysbiophysicaacta,1999,1672:5570.10hamerj,bartelsj,christopherse,eta1.isolationandcharacterizationofhumanbetadefensin一3,anovelhumaninduciblepeptideantibioticj.jboilchem,2001,276(8):57075713.11马卫明,佘锐萍,靳红,等.猪小肠抗菌肽的抗菌作用研究j.中国兽医杂志,2005,41(1):37.12fembanmp,buletp.structureactivityanalysisofthanatin,a21一residueinducibleinsectdefensepeptidewithsequencehomologytofrogskinantimicrobialpeptides322内蒙古农业大学2011芷13141516171819j.proenatlacadsci,1996,93:12211225.cheny,xux,hongs,eta1.rgdtaehyplesininhibitstumorgrowthj.cancerres,2001,61(6):24342438.米宝明,严作廷,宗瑞谦,王东升.牛抗菌肽研究进展j.中兽医医药杂志,2009(5):22brogdenka,eta1.antimicrobialagents,2003,22(4):465478.nannettey.,yount,jllnyuan,eta1.cloningandexpressionofbovineneutrophil13一defensins,biosyn-theticprofileduringneutrophiliematurationandlocalizationofmaturepeptidetonovelcytoplasmicdensegranulesj.biolchem,1999,274(37):2624926258giacomettia.,cirioni0.,ghisenir.,eta1.theantimicrobialpeptidebmap一28reduceslethalityinmousemodelsofstaphylococealsepsisj.critcaremed,2004,32:24852490shoshanabascomb,mammadmanafi.useofenzymetestsincharacterizationandidentificationofaerobicandfacultativelyanaerobicgrampositivecocci(j】.clinicalmicrobiologyreviews,1998,11(2):318340brogdenka,delaj,blandj,eta1.isolationofovineptdmonarysurfactant-associatedanionicpeptidebaeteri-cidalforpasteurellahaemolytica.proceedingsofthena.tionalacademyofsciencesoftheunitedstatesofamerica,1996,93:412