（材料学专业论文）低温等离子体技术在玻璃片基表面活化修饰中的应用.pdf

摘要 摘要 本论文利用介质阻挡放电( d b d ) 这种低温等离子体技术对玻璃材料进行表面改性 处理，用以改善生物分子固定能力，完成了对固定生物分子的玻璃载体的表面预处理和 活化步骤的方法探讨。 通过s e m 、x p s 、f t - 喂以及接触角测定、酸性橙一7 对氨基的定量反应检测和u v - v i s 等方法表征了等离子体放电处理后的玻璃基片的表面形貌、表面羟基、氮基等基团的变 化、亲水性的改善、活化后表面所连接的氨基含量和最后固定核酸的效率。研究了d b d 等离子体处理对玻璃基片表面性质以及对氨基硅烷活化玻璃基片后表面连接氨基量和 随后基片固定核酸效率的影响。 分析表明，利用等离子体对材料表面的改性能力，以d b d 等离子体技术代蛰常用 的化学试剂处理方法对玻璃基片进行预处理，可引起玻璃基片表面键合和基团的显著变 化，使基片表面硅羟基团含量显著增加，同时亲水性增强，而表面粗糙度没有较大增加， 增强了玻璃表面与活化试剂氨基硅烷的连接能力。硅羟基团与氨基硅烷形成共价结合使 基片表面成为氨基化表面，增强了基片的活性，提高了表面的核酸固定效率。实验中对 影响玻璃基片亲水性能和固定生物分子效果的多项工艺处理条件进行了分析与优化。结 果表明，放电电压、频率、时间、气体放电间隙、玻璃基片厚度咀及氨基硅烷的浓度和 处理时间对玻璃基片表面羟基和氨基基团以及核酸固定效率有着直接影响，并确定了最 佳处理条件范围。 实验证实，介质阻挡放电( d b d ) 等离子体技术完全可以应用在改性、活化玻璃材料 载体以固定生物分子的领域之中。并获得较好效果。 关键词：介质阻挡放电( d b d ) 等离子体，表面改性，生物分子固定，玻璃基片， 氮基硅烷，硅羟基团 垒! ! 塑璺 _ _ _ - _ h - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ ，_ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ a b s t r a c t an o v e lm e t h o dw a sd e v e l o p e df o rs u r f a c ep r e t r e a t m e n ta n da c t i v a t i o no fg l a s sc a r r i e r f o rb i o m o l e c u l a ri m m o b i l i z a t i o n t oi n c r e a s et h ec a p a b i l i t yo fb i o m o l e c u l a ti m m o b i l i z a t i o n ， d i e l e c t r i cb a r r i e rd i s c h a r g em b d ) p l a s m at e c h n o l o g yw a si n t r o d u c e di n t os u r f a c e m o d i f i c a t i o no fg l a s sm a t e r i a l s u r f a c et o p o g r a p h y , g r o u pp r o p e r t i e sc h a n g e s ，h y d r o p h i l i cp r o p e r t yc h a n g e ，a m i n o g r o u pc o n t e n t ，d n ai m m o b i l i z a t i o ne f f e c to nt h es u r f a c eo fg l a s sp r e t r e a t e da n da c t i v a t e d w e r cc h a r a c t e r i z e dw i t hs e m ，x p s ，f t - i r ，c o m a c ta n g l ea n a l y s i s ，q u a n t i t a t i v ed e t e r m i n a t i o n o f a c i do r a n g e - 7f o ra m i n og r o u pc o u t c n t ，u v - v i s ，e t c i ti si n v e s t i g a t e dt h a tt h ee f f e c td b d p l a s m at r e a t m e n tc o n d i t i o n s o ng l a s ss u r f a c ep r o p e r t i e s ，a m i n og r o u pc o n t e n ta n dd n a i m m o b i l i z a t i o ne f f e c to fg l a s sa c t i v a t e dw i t ha m i n o s i l a n e a sar e s u l t ，d b dp l a s m af o ri t sd e s i r a b l ec a p a b i l i t yo fm a t e r i a ls u r f a c em o d i f i c a t i o n ， i n s t e a do fc h e m i c a ls o l u t i o nt r e a t m e n t ，m a yc h a n g eg r o u pp r o p e r t i e s ，i n c r e a s es i o hc o c u t a n dh y d r o p h i l i cp r o p e r t i e sw i t h o ms u r f a c et o p o g r a p h yw o r s e n e da n dm a k ei te a s i e rf o r l i n k a g eb e t w e e ng l a s sa n da m i n o s i l a n e o nt h es u r f a c eo fg l a s ss l i d e ，a tl a s t ，f o r m a m i n o - m o d i f i e ds u r f a c e 1 1 1d e t a j l b ym e a n so fa n a l y s i sa n do p t i m i z a t i o no nt h et r e a t m e n t c o n d i t i o n s ，t h er e s u l t si n d i c a t et h ed i r e c te f f e c to fd i s c h a r g ev o l t a g e ，f r e q u e n c y , t i m ea n dg a s d i s c h a r g eg a pd i s t a n c e ，g l a s ss l i d et h i c k n e s s ，a m i n o s i l a n ec o n c e n t r a t i o na n dt r e a t m e n tt i m e o nh y d r o x y lg r o u pa n da m i n og r o u p ，d n ai m m o b i l i z a t i o ne f f e c t f r o me x p e r i m e n t a la n a l y s i s ，d e t e r m i n a t e l y , i ti sl i k e l yt h a td b d p l a s m at e c h n o l o g yw i l l h a v eab r o a d e ra p p l i c a t i o ni nt h e l do fm o d i f i c a t i o na n da c t i v a t i o no f 酉a s sc a r r i e rf o r b i o m o l e c u l a ti m m o b i l i z a t i o n k e yw o r d s ：d i e i e c t ri cb a r r i e rd is c h a r g e ( d b d ) p ia s m a s u r f a c em o d i f i c a t ；o r l b i o m o i e o u i a ri 嗍o b iii z a t i o n g ia s ss ii d e ，a m in o s iia n e s ii a n o g r o u p 关于硕士学位论文使用授权的说明 论文题目：低显笠彦王住撞盔在玻璃苴基麦面鎏丝篮纽主趁廛且 本学位论文作者完全了解大连轻工业学院有关保留、使用学位论 文的规定，大连轻工业学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论 文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部 或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文 的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 是否保密( 否) ，保密期至年 月日为止。 学生签名：堕导师签名：盥丛 二秘年p 月2 。日 第一章引言 第一章引言 对玻璃材料进行表面处理修饰，改善表面基团性质的研究由来已久，其技术方法随 着各门学科领域的发展而有了长足进步，应用也进入了一个新的阶段，在日用产品、工 程建筑、军事国防、生物环境等领域均有它的身影。特别是生物医用领域中，在惰性的 无机或有机材料表面固定生物分子对于生物医用材料来说十分必要。玻璃材料表面固定 生物分子广泛应用于生物医用相容性材料、基因芯片、蛋白质芯片、酶传感器、细胞培 养基、组织工程生物材料等大量技术平台及工具中，具有广阔的应用前景及研究潜力。 固定生物分子的方法之一就是要对材料表面进行改性，在材料表面上产生官能团， 实现官能化。目前对这项技术的研究还在不断探索和更新之中，一些问题仍有待解决， 比如工艺复杂。处理效果不均匀，生产成本高，可能引入有害污染等。在应用中仍然占 有很大比例的化学试剂处理方法就存在上述缺点，并且这种方法的工艺缺陷长期存在， 难以克服。所以发展和改进表面改性处理技术迫在眉睫。目前国内外已经对此开展了广 泛而富有成效的研究，多种物理、化学方向气相、液相形式工艺技术显示出了巨大的发 展潜力。 低温等离子体技术( l o w - t e m p e r a t u r ep l a s m a ) 因其多种优点和出众性能在材料处理和 表面改性中表现出了良好的研究和应用前景。它作为一种性能独特的材料处理加工技 术，已经形成一个崭新的研究及应用领域。基于低温等离子体表面改性特有的性质，如 反应体系处于低温，反应仅涉及材料的浅表面( 纳米级) ，空间处理均匀性强，可处理形 状复杂材料，表面处理均匀性好，在电子、化工、生物医学材料的表面改性等方面得到 了广泛应用与发展，显示出了良好的应用性能。而且在这项技术领域中，等离子体放电 处理、等离子体聚合等技术已经处于应用阶段，包括射频、辉光、电晕等等离子体处理 技术形式也己获得广泛研究。 论文研究了低温等离子体对玻璃材料表面处理的应用可行性以及固定生物分子的 能力。将介质阻挡放电( d b d ) 等离子体技术应用在材料表面处理中，无疑拓宽了生物医 用材料表面处理的工艺选择范围。可以预测，发展新型的生物分子固定技术，相信也将 在未来成为本领域发展方向之一。 第二章文献综述 2 1 当前研究动态 第二章文献综述 2 1 表面改性用于固定生物分子的应用现状 材料科学、生命科学及信息科学的蓬勃发展和交叉融合催生了一批新科技的诞生。 其中，生物化学、分子生物学及组织工程学等学科于其中脱颖而出，迅速在生命科学、 医学、应用工程技术领域确立了不可替代的地位，衍生出了许多先进技术，应用工具及 研究平台，例如新兴的生物芯片、生物传感器、生物医用材料等。 图2 - i生物芯片示意图 f i g 2 - i s c h e m a t i cd i a g r a mb i o c h i p 生物芯片技术是生命科学领域的一项新型应用型技术，在基因表达分析、医学临床 检测及诊断、药物筛选与开发、环境监测等领域有着广阔的应用前景【1 ，1 。芯片制作中寡 核苷酸或d n a 等生物分子的固定主要是指通过生物化学、微加工技术和微电子技术， 根据分子间特异性相互作用原理，将生命科学领域中不连续的分析过程集成于硅片基、 玻璃基片或塑料片表面的微型生化分析系统，以实现对细胞、蛋白质、基因片断以及其 2 一 第二章文献综述 他生物样品的准确、快速、高通量的检测【3 】。随着工艺的成熟，目前生物芯片制作主要 是采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子比如核酸片段、多肽分子甚 至组织切片、细胞等生物样品有序地固化于支持物的表面，组成分子阵列，然后与己标 记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器比如激光共聚焦扫描对杂交信号进行 快速、并行、高效地检测分析，由于常用玻璃基片硅片作为固相支持物，且在制各过程 模拟计算机芯片的制备技术，所以称之为生物芯片( b i o c h i p ) 技术m 】。目前在生物芯片研 究领域中存在各种类型的芯片，而且还有各种新型的生物芯片不断被开发出来。按芯片 上探针的不同，可以将生物芯片划分为基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片和组织芯片。 其中以基因芯片应用最为广泛，对它的研究投入也最多。 该技术主要包括四个基本要点：芯片构建制备、样品制备、生物分子反应和信号检 测。其中的芯片制备方法正在深入研究之中。1 9 9 8 年底美国科学促进会将基因芯片技术 列为1 9 9 8 年度自然科学领域十大进展之一，可见其在科学史上的意义。 图2 - 2 基因芯片与蛋白质芯片 f i g 2 - 2g e n e c h i pa n dp r o t e i n c h i p 生物芯片应用的前提是作为探针的生物样品在片基载体表面的有效固定，而片基载 体对生物样品的亲和性决定了最终的固定效果n 为使片基载体对生物样品有良好的亲 和性，常选用某些化学试剂对片基进行活化修饰，即通过化学反应在片基表面键合上所 需的活性基团，形成具有不同生物特异性的亲和载体，用于偶联各种蛋白质、核酸、酶、 3 第二章文献综述 多肽等生物样品。因此，寻找固定效果稳定、简便易行、成本低的载体官能团修饰方法， 是生物芯片制备过程中的重要环节。这一环节概括而言就是固定生物分子这项关键技 术。 生物分子固定是指将生物活性分子上的某些基团与载体表面的反应性基团通过某 种作用如物理吸附或化学键合，牢固、稳定的固定在生物材料载体表面，并保持生物分 子的活性以获得其特殊性能的技术。这些生物分子包括多肽，蛋白质( 包括酶，蛋白质 分子，抗体，抗原) ，d n a ( 包括d n a 片段，e d n a ，聚合酶链反应产物，寡核苷酸) ， 细胞，细胞生长因子( 胰岛素) ，甚至组织等哺】。固定这些生物分子的技术广泛应用于生 物医用相容性材料、d n a 芯片、蛋白质芯片、酶传感器、细胞培养基、组织工程生物 材料等大量技术平台及工具中，生物分子固定技术的重要性由此可见一斑f 9 】。 也就是说，利用某些方法对载体表面进行修饰、活化、改性将d n a 分子固定于其 上，并获得良好的生物相容性、稳定性、高特异反应性是必不可少的。与其相似，生物 分子固定技术在其它方面的地位也是举足轻重 i o , 1 1 】，但现有方法都存在着缺陷，寻找新 的生物分子固定技术已成为必然趋势。 2 1 2 目前的制备技术 用于制作基因芯片的材料可以是无机材料、天然或人工合成的有机高分子材料制成 的膜或片，但目前实际使用的主要是玻璃片和硅片，其中玻璃基片的应用最为普遍a 基 片载体表面先采用表面化学或组合化学的方法进行预处理，目的是要在基片表面生成大 量有益基团，如羟基等。然后利用羟基等基团再连接可用于固定生物分子的官能团如氨 基、巯基、醛基等对基片进行活化处理。如果将构建生物芯片比作建设大厦，那么自然 而然，羟基等基团的生成就是大厦的一层基础，这层基础的产生、质量都将直接影响到 后续步骤的完成和性能，所以也成为芯片制作处理的关键步骤。 目前预处理的方法主要还是化学试剂处理方法，利用强碱、强酸试剂对片基进行化 学腐蚀、离子交换反应，离解出玻璃基片表面的n a + 、k + 、c a 2 十等阳离子，使表面键合 断键成为s i o h 基团。但湿法的缺点也是很明显的，湿法试剂无疑会引入杂质离子，这 对于应用在生物化学分析领域的生物芯片这种分析工具来说将是影响分析结果的大 因素；同时化学试剂也会强烈腐蚀玻璃等所应用基片的表面，使得表面粗糙度加大，这 也将影响芯片荧光分析，增大基片的荧光本底，减弱荧光分析的分辨能力，加大了分析 的难度，降低生化分析的效率，并会成为未来生物芯片发展的瓶颈l l “， 第二章文献综述 参考低温等离子体表面处理技术的优点和作用效果，可以认为等离子体处理将有可 能代替化学试剂处理方法成为芯片预处理的方法之一。由其作用原理可知，等离子体可 以在基片表面生成大量羟基，面不会有化学试剂处理的缺点，且操作简单，不涉及有危 险性的化学试剂，而且具有大规模、连续性生产的商业应用的潜在能力。故本论文就以 低温等离子体处理技术为主，对这种技术在玻璃表面改性及其应用进行研究。 2 2 低温等离子体技术 2 2 1 等离子体简介 等离子体是由大量相互作用的但仍处于非束缚状态下的带电粒子组成的非凝聚系 统，是与固态、液态、气态处于同一层次的物质第四态，宇宙中的物质主要以这种状态 出现。根据等离子体的物理性质，等离子体分为高温等离子体与低温等离子体两类。低 温等离子体又叫非平衡等离子体，根据工作气体压力的不同，非平衡等离子体又分为低 气压非平衡等离子体与高气压非平衡等离子体两类。等离子体这种正负带电粒子与其它 中性粒子的集合体，在一定的空间内正负电荷接近相等，呈准电中性。在电场作用下， 这些带电粒子从电场中获得能量。由于电子的质量比重粒子的质量小得多，因此电子可 以很快被加速到较高的速度获得能量，而质量较大的带电粒子则加速较慢。获得能量的 带电粒子在与其它带电粒子或中性粒子碰撞时又会失去能量，在一定条件下具有一定的 平均动能。 在低气压条件下，如果激励电场足够高，以致电子与其它部分带电粒子的平均动能 比其它粒予的杂乱运动能量高得多，称为非平衡等离子体。反之，在高气压条件下，如 果激励电场较低，电子及其它部分带电粒子与其它粒子之间的碰撞频繁，从而使两者的 平均动能基本相等，称为平衡等离子体【l ”。 低温等离子体化学是2 0 世纪6 0 年代以来，在物理学、化学、电子学、真空技术等 学科交叉发展起来的一门新兴学科。低温等离子体技术是一种新型的材料加工处理方 法，由于其独特的性能已被应用在许多领域，特别是在表面处理、改性方面有着很多优 势特点 j 4 , t 5 】： 1 可激活高能量的化学反应的同时，反应体系却处于低温； 2 反应仅涉及材料的浅表面，不损伤材料基质； 3 属干式技术，节水节能，降低成本，无公害； 第二章文献综述 4 反应时间短，效率高，可以实现传统的化学反应所不能实现的反应： 5 可处理形状复杂材料，材料的表面处理均匀性好。 最早使用低温等离子体对材料表面进行处理、直接接枝官能团( 氨基、羧基、羟基 等) 的研究始于5 0 年代末。r o s s m a n n 首先利用氧等离子体处理在聚乙烯( p e ) 表面接枝 含氧官能团。h o l l a h a n 等利用含氮等离子体在聚丙烯( p p ) 表面接枝含氦官能团。现在， 人们已了解到等离子体的诸多应用特性，例如对于很多聚合物材料来说，控制相关参 数，利用特定的气体可于材料表面产生特定的官能团。例如，0 2 、h 2 0 、0 2 0 3 、0 2 h 2 0 2 、 空气等气体可产生羟基等含氧官能团；n 2 、n 2 1 2 、n h 3 可产生氨基等含氮官能团等， 这些特性也已被应用于很多领域【i “”。 等离子体表面处理所用的气体可分为反应性和非反应性气体。在等离子体官能化 处理中常使用反应性气体( 0 2 、n h 3 、n 2 和h 2 等) ，它们能够在放电气氛中产生大量相 应的活性粒子( 电子、离子、原子、亚稳态粒子等) 。这些粒子拥有足够的能量，表现出 相当强的反应活性，可与聚合物或其他材料的表面键化合，发生反应，在材料表面引 入所需官能团。而非反应性气体( a t 、h e 、h 2 等) 的粒子不能直接进入到材料表面键中， 单独使用时必须利用其高能离子轰击材料，使表面化学键断裂或者激发表面粒子，产 生自由基，同时使表面受到一定程度的刻蚀。 某些稀有气体混合使用时，稀有气体原子和其他气体原子中的大量再结合的电子 保持在寿命较长的激发状态( 亚稳态) ，能够激发电离其他电离能较小的气体分子，产生 彭宁效应( p e n n 血g e f f e c t ) ，进而提高气氛中多种粒子的反应活性；菲反应气体还可以在 聚合中作为聚合膜前驱气体的载气或与反应性气体混合使用，可以大大增加反应的可 控性和成膜均匀度。 2 2 2d b d 等离子体介绍 一般来说，产生低温等离子体的方法有辉光放电、射频放电、徽波放电、电晕放电 及介质阻挡放电等五种。参考低温等离子体技术，本实验选用介质阻挡放电( d b d ) 等离 子体对基片进行处理。介质阻挡放电( d i e l e c l r i cb a r r i e rd i s c h a r g e ，简称d b d ) 是具有较高 电子能量的非平衡等离子体，而且比其他低温等离子体技术更容易在常压下产生，属于 大气压非平衡等离子体。它是等离子体研究的重要课题之。它的优点是：工作气压比 辉光放电高，工作频率宽；电介质层对放电有镇流作用，防止放电发展到电弧阶段，有 利于在高气压产生大体积均匀放电，所以有广阔的应用前景。 一6 第二章文献综述 除了具有低温等离子体的优点之外，d b d 还避免了低气压低温等离子体操作复杂等 缺点，是极为适合大规模工业应用的一种气体放电形式。目前，这种放电在物质合成、 准分子光源、激光发生器、环境保护以及表面改性、处理等方面都获得了广泛应用口6 2 8 1 。 2 2 3d b d 等离子体的基本原理 d b d 是有固体绝缘介质插入放电空间的一种气体放电形式。从原理结构上看，d b d 主要有平板式与圆管式两种基本结构( 如图2 3 所示) ，包括高压 极( h i g hv o l t a g e e l e c t r o d e ) 、接地极( g r o l m de l e c t r o d e ) 、电介质( d i e i e c t r i c ) 、高压交流电源( h i g l lv o l t a g ea c g e n e r a t o r ) ，两极中间为放电间隙( d i s c h a r g eg a p ) ，虽然结构不尽相同，但产生放电的机 理是相同的。 睁睁 q e d 赋 o i s c h 工r o eb 踮 图2 3d b d 装置结构 f i g 2 - 3 s c h e m eo f d b dd e v i c e 在两个放电电极间插入电介质层是d b d 装置晟主要的结构特征。当加在两个电极间 的电压达到一定值时，在气体间隙中就会发生放电，产生的电子和正离子在外加电场的 作用下分别向阳极和阴极移动，由于电子的质量与正离子相比要小很多，且气体间隙一 般为毫米量级，因此可以认为正离子在放电空间是不动的。电子在运动中不断与气体分 子发生碰撞，产生了大量新的电子，当这些电子到达阳极时，就会在介质表面集聚下来。 介质表面的电子与在放电空间的正电荷共同产生了一个与外加电场方向相反的附加电 场，随着介质上集聚电荷的增加，附加电场的作用也在增强，气隙中总的电场强度就会 - 7 号 第二章文献综述 下降，当气体间隙内场强下降n d , 于气体的击穿场强时，放电中断。在d b d 中，采用的 都是交流电源，因此放电中断后在电源的下半个周期还会再次出现。在大气压或高于大 气压条件下，间隙内的气体放电由许多在时间上和空间上随机分布的微放电构成。这些 微放电的持续时间很短，一般为纳秒量级。研究表明，微放电通常呈现一些相当均匀的 圆柱形微通道，每一个微通道就是一个强烈的流光放电击穿过程，带电粒子的输运过程 及等离子体化学反应就发生在这些微放电通道内 2 9 _ 3 l 】。 d b d 等离子体的基本化学过程与光子、电子、基态原子( 或分子) 、激发态原子( 或 分子) 以及正离子和负离子等基本粒子间的相互作用密切相关。气体在未被电离前，初 始状态可以是简单的原子气体，例如惰性气体( h e ，n e ，a r ，k r ，x e ) ，或者是金属气原 子( a u ，a g ，c u ，c d ) ，也可以是双原子分子气体( n 2 ，c o ，h f ) ，还可以是 多原子分子气体，例如氟甲烷c h 3 f 等中性粒子。 当将一激励电场施加到d b d 气体介质上时，气体就会被电离，从些气体原子或 分子中分离出一个或多个电子，其结果是气体中包含了电子、离子及中性原子或分子。 电子、离子就是带电粒子，不同的气体被电离将会产生不同能量的电子及不同的种类的 离子。例如，在氦气中放电可以产生h e + ，h e 2 + ，在空气中放电则可以产生大量的正负 离子，包括卜r ，n z + ，o + ，0 2 + ，n o ，0 2 - ，n 0 2 + ，0 3 等等。在d b d 中，带电粒子主 要是通过粒子间的非弹性碰撞、光致电离、热电离及附着效应等方式产生的。在非弹性 碰撞的情况下，参与碰撞的粒子总动能在碰撞前后通常要发生变化，同时粒子内部的能 量和结构也会发生变化。如果这种能量的变化使分子或原子发生激发或电离，带电粒子 也就产生t 3 2 3 3 1 。 2 2 4 d b d 介质阻挡放电应用的可行性 d b d 等离子体因其理化特性与应用技术的研究，并很快成为低温非平衡等离子体研 究的一个热点。圊其他处理方法相比，介质阻挡放电最大的特点是可以在较大空间内获 得高能量、高密度的非平衡等离子体，能够满足高质量流量等离子体化学反应的需要， 也是最有可能获得工业应用的方法之一。 d b d 表面改性能力主要是由于d b d 电介质层的镇流作用，它可将电荷较均匀分布于 整个电极表面，可避免在放电间隙内形成火花放电或弧光放电，使得d b d 可在大气压下 获得大面积非平衡等离子体，电子温度适宜( 1 1 0 e v 级) ，可产生高密度的电子、激发 态原子、自由基等，活化材料表面，断裂化学键，生成官能团。通过对工作气体组分、 一8 一 第二章文献综述 压力、放电功率、电压频率、放电间隙等参数的变化可对放电形貌进行调整，优化处理 效果。目前，应用d b d 等离子体对材料改性处理已形成一定规模，聚合物表面能低，亲 水性和附着强度较差，因此利用d b d 对聚合物表面进行改性成为近年来的热门研究领域 3 4 - 3 9 ，但对无机材料的研究较少。所以此项研究拥有一定的创新性和较高的可行性。 2 3 研究意义及内容特点 2 3 1 研究意义 本课题拟研究低温等离子体技术在玻璃片基表面活化修饰方面的应用。玻璃片基是 生物芯片的常用载体之一，与其他载体材料相比，它可以耐受高温和高离子强度的溶液 洗脱；其疏水表面能使杂交体积降到最小，因而可得到较高的点密度。同时，玻璃基片 的荧光信号本底低，不会引起强的背景干扰。因此，以玻璃基片为载体的芯片更具有应 用和发展前景。 目前，对玻璃载体进行表面修饰以利于生物分子固定的应用技术主要分为化学试剂 处理方法和物理法。但现有技术大都依赖各种化学试剂进行物理、化学反应，利用物理 吸附、化学键合等原理达到固定的目的，如偶联剂、活化剂、手臂形连接分子、树枝状 连接分子试剂等等。也有少部分采用了一些新技术，如光阻、光化学、自组装单层膜 ( s a m s ) 、辐射接枝技术等【4 0 郴】。化学试剂处理方法常需要特殊的针对性试剂，而试剂中 的成分可能残留在材料固相内，对体系造成影响( 例如生物体系) 。相比之下，物理法激 发气相以进行表面反应几乎无此缺陷，且在应用上表现出高度的灵活性。以现在的应用 可将物理法分为两类：表面处理以及薄膜沉积( 例如等离子体聚合) ，低温等离子体技术 在这两个方面已被成功利用。 低温等离子体技术在材料表面的改性处理方面已有多种应用，比如亲水化、疏水化、 染色性、耐磨性、反射性、光电导性、杀菌、细胞培养、组织相容性、反渗透膜、分离 膜等多种光学特性、电气特性、透过特性、医用特性等方面【4 4 , 4 5 。国外的一些研究者对 含氮等离子体对于有机材料的官能化处理及其生物分子固定能力进行了研究【舶。4 9 1 ，还利 用低温等离子体于玻璃片基及纤维上聚合有机膜，接枝活性官能团 5 0 , 5 1 】，采用氧等离子 体对石英片及硅片基处理并以化学试剂进行处理后修饰进而固定细膨5 2 , 5 3 ；国内，几个 研究组近年来也开始在此方面进行了研究 5 4 , 5 5 】。 利用低温等离子体技术进行聚合物表面的官能化处理已有许多报道，多个研究组利 一9 第二章文献综述 用含氮等离子体对有机载体进行官能化处理并固定上生物分子，如细胞等；对于玻璃载 体，有人利用低温等离子体在玻璃片基及纤维上聚合有机膜，获得具有多种官能团( 一 n h 2 ，一c o o h 。- - c 0 0 r ) 的表面，并固定蛋白质类以及d n a 生物分子取得进展；另 外，人们还进行了相关方面的研究，如以铁片、石英为片基进行低温等离子体聚合固定 生物分子，不同含氮等离子体在聚合物上接枝含氮官能团，并已经开始优化低温等离子 体反应条件的途径，如接枝含氮官能团时低氧污染的重要性以及对此方面进行表征的方 法研究等【”5 ”，但在玻璃片基表面活化修饰方面的应用还少见报道。因此，有可能利用 此项技术进行玻璃片基表面的活化修饰，以满足固定生物分子的需要。本课题将在这方 面作一些有益的尝试。而且由于d b d 等离子体的常压处理特点，其处理工艺适合于连 续性处理，在未来商业应用中也必将有广阔的发展空间。 2 3 2 研究内容 本课题尝试将低温等离子体技术用于玻璃材料表面活化，通过研究其对玻璃材料表 面性能以及对生物分子固定效果的影响，寻找合适的工艺参数和条件，为扩大此项技术 在生物医用材料领域的应用范围提供实验依据。 具体研究内容：首先，以低温等离子体对载体表面进行表面活化、修饰、改性或接 枝处理，或总称为官能化处理。通过低温等离子体聚合、引发聚合、接枝、活化等方式 将活性官能团引入至载体表面，对载体表面进行表征，分析表面性质、形貌。其次，通 过化学修饰方法对低温等离子体处理后的表面进行再处理，并进行表征。然后在经不同 方式处理的玻璃片基表面连接某种生物分子，并对固定效果进行分析表征，以确定合适 的修饰方法和工艺参数。 实施方案： 一、利用d b d 等离子体表面处理玻璃材料表面，选择并调整各种工艺参数，如工 作压力、放电功率、放电电压及时间、放电间隙等，比较不同条件的处理结果， 优化处理方法； 二、对低温等离子体处理后的片基进行再修饰活化，并对片基表面进行表征； 三、在经过不同处理的片基上连接生物分子，对固定效果进行表征； 四、研究修饰方法和技术参数对玻璃载体表面结构和性能的影响，以及对生物分子 固定效果的影响，以便对修饰方法进行优化。 关键技术： 1 0 第二章文献综述 本课题采用新型表面处理手段低温等离子体技术，通过选择合适的相关处理参 数，探讨对处理工艺的优化，以获得较佳的结果。 第三章实验与表征方法 3 1 实验方法 3 1 1 实验原理 第三章实验与表征方法 采用d b d 等离子体可直接处理玻璃表面，断裂表面硅氧键结合的碳等杂质分子、 氢键缔合的水分子等，活化表面键，生成大量羟基。依靠这些羟基，它们可与，- 氨丙基 三乙氧基硅烷( 氨基硅烷) 的乙氧基发生反应，将硅烷连接在表面。然后利用氨基可直接 固定生物分子，或者连接其他间隔长链、带有特定官能团的分子( 例如带有醛基的长链 分子1 进而固定生物分子。在验证效果实验中，提取了乳酸杆菌的d n a ，将其固定于本 实验硅烷化处理的玻璃基片样品上，对其观察效果。实验原理可分为以下四个步骤： 1 d b d 等离子体处理玻璃基片表面，参与作用的有电子、离子、激发态原子等： 鹏。0 2 玻璃表面生成大量羟基完成预处理 1 2 o e o e 旷u o e e e e e o e n 妙 第三章实验与表征方法 3 。与氨基硅烷反应进行活化处理； h ，n 。i c h 2 c h ， 氍+ c 2 h 5 0 一女t - o c z h ， 0 c 2 h 5 ， h 2 nh 2 7啦￥ 4 利用分子链末端的氨基连接d n a 分子固定生物分子 图3 1 实验原理图 f i g 3 - 1 m e c h a n i s mo f t h et r e a t m e n t 第三章实验与表征方法 3 1 2 所用材料设备 实验中使用到的材料、药品列于表3 1 中，所用到的仪器设备列于表3 2 中。 表3 1 所用材料列表 1 i a b 3 1l i s to f m a t e r i a l s 中文名称 英文名称 分子式分子量纯度或规格 生产厂家 三篓r - a m i n o p r o p y l - c g h 2 a 0 3 n s i t r i e t h o x ： 喜纂怒言y s i l a n e 乙氧基硅烷 伺毋l 性化上篮_ j 无水乙醇 a l c o h o l c 2 h 5 0 h 4 6 0 7分析纯 丙酮 a c e t o n e c h 3 c o c h 3 5 8 0 8 分析纯 酸性橙7 a c i do r a n g e 7 c 1 6 h 2 6 0 4 n 2 n a 3 5 0 3 3 化学纯 氢氧化钠 s o d i u mh y & o x i d e n a o h4 0 0 1 分沂纯 盐酸溶液h y d r o c h l o r i ca c i d 玻璃粉 g l a s sp o w d e r 盖玻片g l a s ss l i d e 分析纯 粒度1 0 0 - 1 2 0 u m 2 4 r a m 2 4 m m o 1 3 - o 1 7 r a m 天津科密欧化学 试剂开发中心 天津科密欧化学 试剂开发中心 天津科密欧化学 试剂开发中心 天津科密欧化学 试剂开发中心 天津科密欧化学 试剂开发中心 自制 北京玻璃集团 1 4 第三章实验与表征方法 表3 - 2 设备列表 1 h b 3 2l i s to fd e v i c e s 名称厂家 v f 高压高频电源 t d s 3 0 0 0 b 型示波器 z k - 5 0 0 数显真空仪 g w - 1 0 k 功放器 7 8 h w 型恒温磁力搅拌器 6 5 1 1 型电动搅拌器 h h 6 恒温水浴锅 r w 1 0 红外干燥箱 k q 2 2 0 0 超声波清洗仪 德国s i e m e n s 公司 美国t e k t r o n i x 公司 北京大学物理系 美国t e k t r o n i x 公司 上海精密仪器仪表有限公司 江苏金坛市荣华仪器有限公司 江苏金坛市荣华仪器有限公司 大连星海科学仪器公司 上海精密仪器仪表有限公司 3 1 3 实验过程 整个实验处理过程包括三个步骤： 1 等离子体处理玻璃基片，对玻璃基片进行预处理( p r e t r e a t m e n t ) ，增加羟基基团； 2 以氨基硅烷处理玻璃基片，对玻璃基片活化处理( a c t i v a t i o n ) ，接枝氨基基团，利于 固定生物分子； 3 选择核酸分子固定在活化压的玻璃基片上，以验证活化后的基片性能。 3 1 3 1 预处理玻璃基片 玻璃基片的预处理是为了利于基片能够连接氨基而进行的前期处理，如果预处理效 果不理想，没有生成足够的相应基团( 如羟基等) ，或者表面性质发生了不利于活化步骤 的变化，都会造成下一步活化效果的不理想，严重影响最后固定生物分子的效果。本实 验中采用了d b d 等离子体处理玻璃基片表面，这也是本实验的重要步骤之一。 1 5 第三章实验与表征方法 介质放电阻挡等离子体装置结构如图3 2 ，装置外形为圆柱形不锈钢装置，反应装 置包括上下安装的两个电极，上电极下表面由3 m m 厚、直径1 0 c m 石英玻璃覆盖，连接 高压电源，圆形直径1 0 c m ，作为介质材料。下电极圆柱形，接地连接，表面直径为2 2 r a m ， 承载待处理玻璃基片。上、下电极高度均可调，以调整优化气体间隙。接地极串连一个 5 0o 电阻以测定电流。 实验时，将清洗好的玻璃基片放置在下电极上，完全覆盖电极圆形表面，以使装置 形成双电极均覆盖电介质的介质阻挡放电系统。使等离子体能够对玻璃基片处理充分。 工作气体为空气，常压处理时空气流通，反应装置内部保持大气压。低压处理时需要密 闭反应容器，开启真空泵，调节球形阀控制压力。放电时接通高压交流电源，通过示波 器观察电流、电压变化，通过功放器调整电压和交流频率。 h i g h - v o l t a g ep r o b e 图3 - 2d b d 等离子体反应器结构 f i g 3 - 2 s t r u c t u r eo f d b d p l a s m at r e a t m e n td e v i c e 3 1 3 2 活化玻璃基片表面 在固定生物分子领域，将玻璃基片表面氨基化，使之具有大量游离的氨基基团，可 以固定生物分子的过程称为表面的活化。这是固定生物分子的必要过程之一，生物分子 1 6 第三章实验与表征方法 的固定就是因为氨基等基团与生物分子产生的键合或吸附而相互连接起来的。实验中采 用了一种氨基化试剂r - 氨丙基三乙氧基硅烷，简称氨基硅烷( a m i n o s i l a n e ) ，无水乙 醇为溶剂，对已进行过预处理的玻璃基片进行活化。 将d b d 等离子体处理后的玻璃基片快速放入到已配制好的氨基硅烷乙醇溶液中( 体 积百分比浓度分别为1 ，5 ，1 0 ，2 0 ) ，恒温浸泡1 h ，同时保持振荡，取出后使用 无水乙醇冲洗，以去除物理吸附的氨基硅烷分子，再用去离子水冲洗5 次，在干燥箱中 保持1 0 0 干燥l h ，取出待用。 3 1 3 3 生物分子的固定 固定生物分子是检测玻璃基片表面预处理和活化的重要手段，经过处理的基片的生 物分子固定性能将通过实际固定进行性能检验。乳酸杆菌核酸因为其提取的方便性和实 验的代表性，本实验中的生物分子选取了这种生物分子用于检测基片固定性能。 1 乳酸杆菌孩酸提取 提取过程： ( 1 ) 取3 7 过夜培养的1 5 m l 乳杆菌培养基，离心分离处理，控制在5 0 0 0 转分，分离 5 m i n ： ( 2 ) 弃掉上清液，将沉淀重新溶于5 6 0 1 a lt e 缓冲液，使体系体积共6 0 0 p h ( 3 ) 加入6 p 1 溶菌酶( 5 0 m 咖1 ) ，4 1 a l r n a 酶，保持3 7 0 c , x 立夜； 涂片观察细菌是否破壁，如果破壁，加入1 0 s d s3 0 d ，温度保持5 5 2 ，水浴加热 4 h ； ( 5 ) 加入酚氯仿异戊醇抽提两次，离心分离保持1 2 0 0 0 转，分，离心1 0 r a i n ，取上清液 加无水乙醇，沉淀3 0 m i n ； ( 6 ) 选择1 4 0 0 0 转，分，保持离心分离l o r a i n ，弃掉上清，7 5 乙醇洗一次，然后使用5 0 p i t e 缓冲液溶解沉淀，将溶解的d n a 溶液集于一个离心管内，进行实验。 经检测可知提取出的核酸为单链d n a ，1 0 0 - - 5 0 0 b p ( 碱基对，b a s ep a i r ) 长度a 2 核酸在基片上的固定 利用微量移液器移取3 0 p l 核酸溶液，稀释1 0 0 倍，获得3 m l 溶液，摇晃均匀，将 氨基硅烷处理后的玻璃基片放入溶液内，超声波震荡反应4 5 m i n ，取出玻璃基片，用去 离子水冲洗，在干燥箱中3 0 c 干燥。 7 第三章实验与表征方法 3 基片生物分子固定性能测试 将已经固定好核酸的玻璃基片放入到5 m l 高盐度的溶液之中，溶液浓度为2 m o l l ， p h = 1 0 ，反应4 5 m i n 6 0 m i n ，得到定量的解吸核酸溶液，使用紫外光谱检测设备在 2 6 0 n m 波长处检测溶液的吸光度。 3 1 3 4 化学处理玻璃基片 为了与等离子体处理改性的玻璃基片的性能进行对比，实验中还用化学试剂处理了 玻璃基片，利用这种常规方法使玻璃基片表面羟基化，可以比较并分析出常规预处理和 实验所采异j 钓新型预处理方法的效果差异。 具体过程：将干净玻璃片放入重铬酸钾与硫酸混合溶液中浸泡5 h ，取出后用去离子 水清洗，然后放入6 m o l l 的n a o h 溶液l h ，再用去离子水清洗，烘千干燥。 3 2 表征方法 3 2 1 红外光谱( f t - i r ) 对玻璃基片表面基团的表征 使用美国p e r k i n - e l m e r 公司出品的s p e c t r u mo n e - bf t - i r 设备( 波数范围： 4 0 0 0 c m d 4 0 0 c m 1 ) 检测样品表面基团变化。 3 2 2 基片表面接触角的测定 使用承德试验机厂出品的j y - - b 型接触角测定仪( 误差34 ) 测定样品表面与水的 接触角。 。