食品检验中多重pcr的应用.doc

食品安全学综述食品检验中多重PCR的应用学生姓名：张晗学 号：20084061723班 级：七班专 业：食品科学与工程黑龙江八一农垦大学食品学院2010年9月1前言 多重PCR是在常规PCR基础上改进并发展起来的一种新型PCR扩增技术，是在同一反应体系中加人多对引物同时扩增多条目的DNA片段的方法，采用这一技术可同时检测多种病原微生物。该技术自1988年Chamberlain首次应用于杜氏营养不良症(Duchenne musculardystrophy)基因外显子缺失的检测以来，已经在遗传病诊断、转基因鉴定、病原体检测等各个领域成功的得到应用1-3。本文对多重PCR技术在食品病原细菌检测中的应用进展进行了综述。1.1研究的目的与意义食品中污染的病原细菌是引起食源性疾病的主要因素之一。据国家食源性疾病监测网的统计资料显示近十年来由微生物引起的食源性疾病事件和涉及人数最多，其中又以副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、沙门菌(Salmonella)、大肠杆菌(Escherichia coli)等病原细菌为主要的病原物质4。因此，快速的检测与鉴定食品中病原细菌是及时有效控制与预防病原细菌传播、预防食物中毒的重要前提。1.2国内外研究现状方法 传统的细菌学培养需经富集培养、选择性分离、形态特征观察、生理生化反应、血清学鉴定等过程，操作复杂、耗时费力，而且无法对人工难以培养的病原细菌进行检测旧。随着现代免疫学和分子生物学理论和技术的不断发展，乳胶凝集法、免疫磁珠分离法、酶免疫测定等免疫学技术、核酸探针技术和PCR技术因其特异性强、敏感性高、操作简单快速等优点已广泛应用于食品病原细菌的检测中。但这些方法都存在一个问题：即一次实验只能检测一种病原细菌，而食品样品中往往存在的病原细菌种类很多，有可能涉及不同种和型别的细菌。因此近年来出现了一些一次实验能同时检测多种病原细菌的检测方法5,6，多重PCR(Multiplex PCR)就是其中一种。1.3相关检测技术 众所周知，聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是一种体外酶促基因扩增技术。该项技术于1985年由美国的Kary mullis等人首创并由美国的Cetus公司开发。其基本原理是：在存在DNA模板、特异性引物、dNTP、适当缓冲液(M92+)的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核昔酸引物所界定的DNA片段进行扩增。这种扩增是通过模板DNA与引物之间的变性、退火、延伸三步反应为一个周期，循环进行，而且每一循环产生的DNA片段均能成为下一次循环的模板，故PCR扩增的目标DNA是呈指数增加。多重PCR是在常规PCR基础上发展起来的，原理与常规PCR基本相同。只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性引物，如果存在与各对引物特异性互补的模板，则可在同一反应管中扩增出一条以上的目的DNA片段。多重PCR的特点包括:(1)高效性，在同一反应管内同时检出多种病原菌或对多个目的基因进行扩增分析；(2)系统性，多重PCR很适宜对症状相同或易污染相同食品的一组病原菌进行分析；(3)经济简便性，多种病原菌在同一反应管中同时检出，将大大节省检测时间和试剂，为临床或食品安全检测提供更多更准确的信息7。2研究方案2.1研究方法2.1.1 食品样品前处理和模板DNA 的提取食品样品在提取 DNA 前经过梯度离心 ，先在500700rmin 离心5min 去除食品成分 ，然后10，00012，000rmin离心10min 沉淀菌体。模板DNA 的提取使用改良异硫氰酸胍法。在去上清的的离心管内加入100L 裂解液（终浓度为4molL 异硫氰酸胍 ；25mmolL 柠檬酸钠 ；畅14molL（ 巯基乙醇 ；畅5 十二烷基肌氨酸钠 ；20g L 糖原 ；20 mg L 蛋白酶 K） ，混匀 ,5565 水浴2030 min ，用等体积酚、氯仿、异戊醇V酚 V氯仿V异戊醇25241 抽提一次 ，加入20预冷1 倍体积的异丙醇沉淀5 min ，12，000r min室温离心10 min ，20 预冷75 乙醇漂洗 ，干燥后溶于去离子水 ,20 保存备用。2.1.2引物设计及特异性检测选择沙门氏菌的侵袭蛋白基因（invA）、单核细胞增生性李斯特菌的溶血素基因 O（Hly ）、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因（nuc）和福氏志贺氏菌的侵袭性质粒抗原基因（ipaH）作为目的基因 ，用Primer5分析软件分别设计出 4对引物，引物由上海生物工程公司合成。以4种标准菌株DNA 为模板 ，PCR 扩增后进行测序验证。另将混合引物分别以 37株菌株的基因组 DNA 为模板进行 PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测其特异性。2.1.3 人工感染食品检测 分别将四种细菌过夜培养计数 ，用生理盐水以10倍梯度稀释，同时以生理盐水作为空白对照，按以下方式感染经灭菌处理的食品 ：（1）每种菌按1 106、1 105、1 104、1 103、1 102、1 101、1（cfumL ）7个浓度分别感染牛奶 ，直接提取 DNA 进行 PCR检测 ；（2）4种菌随机任意组合感染（感染量1 108cfumL）牛奶 ，直接提取 DNA 进行 PCR 检测 ；（3）4种菌按1 104、1 103、1 102、1 101、1（cfumL）5个浓度分别感染牛奶，37 振荡培养0 、2、 4、 6、8 h 后 ，各取 1mL 提取 DNA ，进行PCR检测。试验重复三次。2.2技术路线 在同一PCR反应管中同时加入多种病原细菌的特异性引物进行多重PCR 扩增，可快速实现多种病原细菌的同时检测和分析。2.3所用仪器与材料2.3.1仪器 PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统2.3.2试剂 10PCR buffer、dNTPs 、Taq 酶、DNAMarker DL2000，其它化学试剂均为化学纯。2.3.3菌种及来源 沙门氏菌（Salmonel la ATCC13067)、单核细胞增生性李斯特菌（L ister ia monocy togenesATCC7644）、金黄色葡萄球菌（Stap hy lococcus aureus ATCC6538）、 福 氏志贺氏菌（Shigel laATCC12022）、表皮葡萄球菌（Staphy lococcus ep idermidis ATCC12228）、枯草芽孢杆菌（Baci l lussubti lis ATCC6638）、蜡样芽孢杆菌（Baci l lus cereus ATCC11778）、大肠杆菌（ Escher ichia coliO157：H7VT（N）NCTC12900）、大肠杆菌（Escher ichia coli ATCC8739）、副溶血弧菌（V畅 parahaemolyticus ）、摩根 氏 菌（ Morganel laMorganii）、绵羊李斯特菌（L ister ia iv anov ii ）、英诺克李斯特菌（ L ister ia innocua ）、肺炎链球菌（Strep tococcus pneumoniae）、流感嗜血杆菌（Hemop hi lus in f luenz ae） 、化脓性链球菌（Strep tococcus p yogenes） 、结核分枝杆菌（Mycobacter ium tuberculosis ），另有7 株沙门氏菌、4 株单核细胞增生性李斯特菌、5 株金黄色葡萄球菌和4株福氏志贺氏菌3 研究内容3.1引物特异性 将4株标准菌分别与其对应引物进行PCR 扩增并将产物进行测序结果与 GeneBank 的目标基因序列完全一致，说明这4对引物能有效扩增目的基因。将4对引物等量混合，分别以37株菌株的基因组DNA 为模板进行 PCR扩增 ，结果表明其中8株沙门氏菌、5株单核细胞增生性李斯特菌、6株金黄色葡萄球菌、 5株福氏志贺氏菌全部呈阳性，另外13株呈阴性。这表明所选引物具有很强的特异性。3.2人工接种食品的检测3.2.1灵敏度 单一菌体人工感染牛奶 ，不经过培养直接提取DNA 进行 PCR检测 ，根据结果可以得出最低检测限分别为 ：单核细胞增生性李斯特菌1103cfumL沙门氏菌、福氏志贺氏菌、金黄色葡萄球菌均为1102cfumL。3.2.2特异性 4种致病菌随机组合人工感染牛奶，进行多重PCR 检测，可以有效地检出4种致病菌，其特异性很强，未发生交叉影响。3.2.3富集培养时间根据结果可以得出接种后经过48h培养，在牛奶的检测灵敏度即可达1cfumL。3.2.4重复性用同样的方法人工感染新鲜猪肉、腊肉、青菜，实验结果一致，说明本方法具有很好的重现性。3.3市售食品的检验在市场上采集牛奶、酸奶 、生猪肉、青菜、腊肉、香肠、凉菜的食物样品各20份（共140份）进行多重PCR 检测 ，同时用传统方法进行对比检测 。多重 PCR 方法的阳性率为11畅4 ，传统方法的阳性率为5 ，假阳性率为5畅7 。说明本方法灵敏度比传统的高 ，能满足食品检测的要求。细胞增生性李斯特氏菌有 Hly 、InI、inlAB、plcA等8,9；福氏志贺氏菌有 ipaC 、 ipaH 等10。经过大量的分析 ，本研究选择沙门氏菌 invA 基因 、单核细胞增生性李斯特菌 Hly 基因、金黄色葡萄球菌nuc基因和福氏志贺氏菌 ipaH 基因作为检测的靶基因 ，特异性很强 ，而且都是各自最主要的致病因子与侵袭性因子 ，因此以它们作为检测靶基因能够保证检测的准确性和特异性。 本研究通过优化多重 PCR 反应条件，建立了四种致病微生物的多重 PCR 检测体系，可同时扩增出4条目标片段，并且4种致病微生物任意随机混合均能成功扩增，有很强的特异性。而且快速准确 、简便 、灵敏度高，10h 可出检测报告（包括培养时间），经过增菌4 8h 其最低检出限可达1cfumL，具有较强的实际应用价值，可为食品卫生检验和临床检验提供有效的方法参考。4 预期目标 多重PCR虽为一种特异灵敏、简便快速、高通量的检测技术，但其在实际应用中也存在不少问题，污染问题就是其中之一。一旦有极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果；多对引物同时扩增，各种实验条件控制不当，很容易导致扩增失败或非特异性产物；引物的设计及靶序列的选择不当等都可能降低其灵敏度和特异性。此外，对食品样品迸行检测时，增菌培养基选择不当易使有的细菌生长缓慢或被抑制，导致假阴性的结果。今后的发展方向主要集中在以下几个方面：(1)不断增加反应体系中引物对的数量，提高一次扩增反应所能检测的范围；(2)优化反应条件，提高扩增效率；(3)研究筛选能同时富集多种病原细菌的培养基；(4)与其他技术结合，如荧光PCR、反转录PCR，提高检测敏感性和特异性，缩短检测时闻。尽管多重PCR技术存在着一定的弊端，但随着该技术的进一步普及、发展和完善，将会在食品病原细菌的检测中得到更多的应用。参考文献1Chamberlain J，Gibbs RADeletion screening of the duchenne muscular dystrophy locus via multiplex DNA amplificationJNucleid AcidsResearch，1988。16：11141一111562Elfath EM，Ahmed AM，Cooper ed，et一Multiplex PCR：optimizationand application in diagnostic virologyJClin Microbiof Rev。2000，i0：5595703陈文炳，邵碧英，李寿崧，等。应用多重PER同时检测多种转基因成分J检验检疫科学，2002，12(3)：ll134Malomy B，Tassios PT，Radstrom P，et a1Standardization ofdiagnosticPER for the detection of foodbome pathogensJIIlt J Food Microbiul，20035：39一钙5刘秀梅，陈艳，王晓英，等19922001年食源性疾病暴发资料分析一一国家食源性疾病监测网J卫生研究，2004(6)：7257276苏世彦，庄平。陈忘名食品微生物检验手册M北京：中国轻工业出版社，1998，7陈庆森，冯永强，黄宅华，等食品中致病菌的快速检测技术研究现状与进展J食品科学，2004，24(“)：1481528陈福生，高志贤，王建华食品安全检测与现代生物技术M北京：化学工业出版社，20049 Ramesh A ， Padmapriya B P ，Chrashekar A ， et al Application of a Convenient DNA Extraction Methodand Multiplex PCR for the Direct Detection of Stap hylococcus aureus and Yersinia enterocolitica in MilkSamples J Mol Cell Probes ，2002，16：307314 10 Jung Y S ，Frank J F ，Bracket t R E Plymerase ChainReaction Detection of L isteria monocytogenes onFrankfurters Usin