il17对t84细胞通透性及gal9表达的影响.pdf

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细胞跨膜共同培养系统培养t 8 4 细胞单层 t 8 4m o n o l a y a r 模拟肠上皮屏障 通过测量i l 1 7 处理前后t 8 4 细胞单层的跨上皮电阻 t r a n s e p i t h e l i a l e l e c t r i cr e s i s t a n c e t e r 辣根过氧化物酶 h o r s e r a d i s h p e r o x i d a s e h r p 流量的检测 研究i l 1 7 对t 8 4 细胞单层通透性的影响 进 而研究t 8 4 细胞单层通透性变化后相应处理组t 8 4 细胞单层g a l 9 表达的变化 进一步探讨g a l 一9 与肠上皮黏膜屏障完整性的关系 摘要 方法 1 本实验利用t 8 4 细胞单层 研究i l 1 7 对t 8 4 对细胞单层通透性的影响 我们将i l 1 7 以及h r p 加入到细胞跨膜培养系统肠腔侧中 通过酶联免疫吸附 测定 e n z y m e l i n k e di m m u n ea s s a y e l i s a 的方法检测基底侧样本中的h r p 并 测量t 8 4 细胞的t e r 变化 以t 8 4 细胞单层t e r 及h r p 流量作为评价t 8 4 细 胞单层的通透性指标 2 不同浓度的i l 1 7 加入细胞培养系统中与t 8 4 细胞共同孵育 2 小时后测 量t 8 4 细胞单层t e r 及h r p 流量变化 从而评价不同浓度i l 1 7 对肠上皮细胞 系t 8 4 细胞单层的屏障功能的影响 3 细胞跨膜培养系统随机分为正常对照组 i l 1 7 组 并给予相应处理 共 同培养2 小时后 测量各组的t e r 以及h r p 流量 然后收集正常对照组 i l 1 7 组 t 8 4 细胞上清液 对测量各组的t e r 以及h r p 流量进行数据分析后 采用e l i s a 方法检测相应组细胞上清液中g a l 9 的变化 从而评价t 8 4 细胞单层通透性变化 后 肠上皮细胞系t 8 4 细胞单层的g a l 9 表达的变化 4 细胞跨膜培养系统随机分为正常对照组 i l 1 7 组给予相应处理 共同培 养2 小时后 测量各组的t e r 以及h r p 流量 收集正常对照组 i l 17 组各培养系 统中t 8 4 细胞 对测量各组的t e r 以及h r p 流量进行数据分析后 用免疫细胞化 学的方法检i 贝1 t 8 4 细胞通透性发生变化相应浓度i l 1 7 组的g a l 9 的表达 从而评 价t 8 4 细胞单层通透性变化后 肠上皮细胞系t 8 4 细胞单层的g a l 9 表达的变化 5 将上述所有实验结果采用s p s s1 7 0 统计软件系统进行分析 所有计量数 据均采用均数4 标准差进行描述 用s h a p i r o w i l k 检验方法进行正态性分析 用 l e v e n e 检验方法进行方差齐性分析 多组数据间的比较用单因素方差分析 o n e w a ya n o v a 对多组数据比较有统计学意义的再进行两两比较 l s d t 检验 两组数据的比较采用两独立样本的t 检验 相关性分析用s p e a r m a n 秩相 关 检验水准a 0 0 5 p 0 0 5 时认为差异具有统计学意义 么七蛋 拿口木 1 不同浓度i l 1 7 加入细胞跨膜培养系统肠腔侧后 各浓度的i l 1 7 对t 8 4 上皮细胞刺激前后 各浓度i l 1 7t 8 4 上皮细胞相对t e r c o m p a r a t i v et e r 表 现为 当i l 一1 7 浓度小于5 0 n g m l 时 增加肠腔侧i l 1 7 浓度 不引起上皮细胞 i i 摘要 跨膜电阻的下降 但当i l 1 7 浓度大于5 0 n g m l 时 随着i l 1 7 浓度增加 跨膜 电阻逐渐下降 与正常对照组及小浓度i l 1 7 组比较 差异有统计学意义 f 5 6 0 3 4 p o 0 5 不同浓度i l 1 7 加入跨膜培养系统肠腔侧 h r p 流量变 化如下 当i l 1 7 浓度小于5 0 n g m l 时 增加肠腔侧i l 1 7 浓度 不引起h r p 流 量的增加 但当i l 1 7 浓度大于5 0 n g m l 时 随着i l 1 7 浓度增加 h r p 流量逐 渐增加 与正常对照组及小浓度i l 1 7 组比较 差异有统计学意义 f 1 5 9 2 2 p o 0 5 2 光学显微镜下观察免疫细胞化学结果 i l 1 7 干预过的t 8 4 细胞 i l 1 7 组 细胞质 细胞核 细胞膜被染成棕褐色 相对于正常生长t 8 4 细胞 阴性 对照组 细胞质 细胞核 细胞膜被染成棕褐色程度明显降低 结果提示 细 胞单层通透性增加后 细胞表达的g a l 9 较细胞单层通透性正常的g a l 9 降低 用e l i s a 方法检测肠腔侧细胞上清液中g a l 9 的水平结果显示 高浓度i l 1 7 组明显低于正常对照组 差异有统计学意义 p o 0 5 提示i l 1 7 作用于t 8 4 细胞单层引起通透性改变后 相应作用组细胞上清液中g a l 9 的表达量较未干预 组明显降低 3 h r p 流量与g a l 9 的相关性分析结果 g a l 9 与h r p 流量之间r 0 9 4 2 尸 o 0 1 说明上清液中g a l 一9 浓度与h r p 流量之间呈负相关关系 结论 1 i l 1 7 能造成t 8 4 细胞单层通透性的增加 2 t 8 4 细胞单层通透性增加后g a l 9 的表达量减少 关键词 i l 1 7 t 8 4 细胞单层 g a l 9 i i i a b s t r a c t t h ep a r a c e l l u l a rp e r m e a b i l i t yo ft 8 4m o n o l a y e r a n dg a l 9 e x p r e s si n f l u e n c e db yi l 1 7 p o s t g r a d u a t ej i n gl i u s u p e r v i s o rp r o f b a i s u if e n g d e p a r t m e n to fg a s t r o e n t e r o l o g y t h ef i r s ta f f i l i a t e dh o s p o t a lo fz h e n g z h o u u n i v e r s i t y z h e n g z h o u 4 5 0 0 5 2 c h i n a b a c k g r o u n d a b s t r a c t i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e i b d u l c e r a t i v ec o l i t i s a n dc r o h n sd i s e a s e i s e m e r g i n ga s ac h r o n i cn o n s p e c i f i ci n t e s t i n a l i n f l a m m a t o r y m o r b i d i t yi n c r e a s e o b v i o u si nr e c e n ty e a r s i t se x a c tp a t h o p h y s i o l o g i c a lm e c h a n i s mr e m a i n sl a r g e l y u n k n o w n i tw a ss h o w nr e c e n t l yt h a ta ni m p a i r m e n to fi n t e s t i n a lb a r r i e ri sa s s o c i a t e d w i t hc r o h n sd i s e a s ea n du l c e r a t i v ec o l i t i s a l o n g 矶t l lt h er e s e a r c ha b o u tt h l 7c e l l s a n dt h ec y t o k i n e si l 17i ts e c r e t i o n t h er o l eo fi l 一17i nt h ed i s e a s eg r a d u a l l y a t t e n t i o n g a l e c t i n 9i sam e m b e ro ft h eg a l e c t i nf a m i l y e x i s t si nv a r i o u so r g a n i s m s a k i n do fp o l y s a c c h a r i d ec o n n e c t i o np r o t e i n w ei np r e v i o u ss t u d i e sf o u n dt h a t g a l e c t i n 9m a yb ea s s o c i a t e d w i t ht h ec l o s ec o n n e c t i o nb e t w e e ne n t e r o c y t e g a l e c t i n 9i sl i k e l yt ob ei n v o l v e di nm a i n t a i ne n t e r o c y t ec o n n e c t e d h o w e v e r t h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ni n t e s t i n a lb a r r i e ra n di l 17 a n dt h ee x p r e s s i o no fg a l e c t i n 9 r e l a t i o n s h i pw i t ht h ei n t e g r i t yo ft h em u c o s a lb a r r i e ri sl e s sf r e q u e n t l ys t u d i e d o b j e c t i v e t 8 4c e l lm o n o l a y e r sw e r ec u l t u r e di nt r a n s w e l lc o m m o nc u l t u r es y s t e m sa c r o s s c e l lm e m b r a n ef o rs i m u l a t i n gi n t e s t i n a l e p i t h d i a lb a r r i e r t r a n s e p i t h e l i a le l e c t r i c i v a b s t r a c t r e s i s t a n c e t e r o ft h e t 8 4m o n o l a y e r sa n df l o wo fh r pw a sd e t e r m i n e da f t e r t r e a t m e n tw i t hi l 17 s ot h a tp e r m e a b i l i t yo ft h et 8 4m o n o l a y e r sw a sg o t t h e r e f o r e e n a b l i n gu st ob e t t e re x p l o r et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ni n t e s t i n a lb a r r i e r a n di l 17 w h i l et 8 4c e l l m o n o l a y e rp e r m e a b i l i t yc h a n g e d f u r t h e r e x p l o r eg a l e c t i n 9 r e l a t i o n s h i pw i t ht h ei n t e g r i t y o ft h ei n t e s t i n a le p i t h e l i u mm u c o s ab a r r i e r m e t h o d s 1 t 8 4m o n o l a y e r sw e r ee m p l o y e di nt h i ss t u d y t oe v a l u a t et h ei n f l u e n c eo f p a r a c e l l u l a rp e r m e a b i l i t yo ft 8 4m o n o l a y e rb yi l 一17a n dh r p w e r ea d d e dt ot h e a p i c a lc h a m b e r s o ft r a n s w e l l s y s t e m s h r p i ns a m p l e sw a sd e t e r m i n e db y e n z y m e 1 i n k e di m m u n ea s s a y e l i s a h r pf l u x a n dt e rw e r ep e r f o r m e dt o e v a l u a t et h ep e r m e a b i l i t yo ft 8 4m o n o l a y e r s 2 i l 17w i md i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa n di l 17w e r ea d d e dt ot h et r a n s w e l l s y s t e m s h r pf l u xa n dt e rw e r ep e r f o r m e d2ha f t e rt h e a d d i t i o no fi l 17w i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n st oe v a l u a t et h ep e r m e a b i l i t yo f t 8 4m o n o l a y e r s 3 t r a n s w e l ls y s t e m sw e r er a n d o m l yd i v i d e di n t og r o u p s t h en a i v ec o n t r o l g r o u p t l l ei l 17w i t h d i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o ng r o u p s h r pf l u xa n dt e rw e r e p 娟n i l e d2h a f t e rt h ea d d i t i o no ff l a g e l l i n c o l l e c t i o n i n gt h eb a s a lc h a m b e r sl i q u i d g a l 9l e v e l si nb a s o l a t e r a ll i q u i d w e r ed e t e r m i n e db ye l i s a t oe v a l u a t e r e l a t i o n s h i pb e t w e e nt 8 4 c e l lm o n o l a y e rp e r m e a b i l i t ya n dg a l 9e x p r e s s i o n 4 t oo b s e r v et 8 4c e l lm o n o l a y e rp e r m e a b i l i t yi n c r e a s e dt h ec e l lg a l 9e x p r e s s c h a n g e c e l l sw e r ec o l l e c t e df r o mt h ep l a t e s2ha f t e rt h e a d d i t i o no fi l 1 7 t h e n t 8 4c e l lm o n o l a ye r e x p r e s sg a l 9d e t e r m i n e db yi m m u n o c y t o c h e m i s t r y 5 t h ed a t aw a sr e c o r d e db ys t a t e s t e c a ls o f h n a r es p s s l 7 0 m e a s u r e m e n td a t a w e r e e x p r e s s e d a sm e a n s4 s t a n d a r dd i v i a t i o n s h a p i r o w i l ko fn o r m a l i t yt e s t w a su s e di nt h ed a t ao fs t a t i s t i c sa n a l y s i s l e v e n et e s to fh o m o g e n e i t yo fv a r l a n cw a s u s e di nt h ed a t ao fs t a t i s t i c sa n a l y s i st o o t h r e eo rm o r eg r o u p s w e r ea n a l y z e d w i t ht h ea n a l y s i so fv a r i a n c e a n o v a a n dt h ec o m p a r i s o nb e t w e e nt w og r o u p s w a sp e r f o r m e dw i t hl s d tt e s t d i f f e r e n c e s b e t w e e nt w o g r o u p s w e r e a n a l y z e d w i t ht h es t u d e n t s t t e s t t h e ns p e a r m a nc o r r e l a t i o nw a su s e dt o v a b s t r a c t d e s c r i b et h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ev a r i a b l e s d i f f e r e n c e sb e t w e e nm e a n sa tal e v e l o f 尸 o 0 5w e r ec o n s i d e r e ds i g n i f i c a n t r e s u l t 1 i l l7w l t hd i f f e r e n tc o n c e n t r a t i o n sa d d e dt ot h e a p i c a l c h a m b e r so f t r a n s w e l l w h e ni l 17c o n c e n t r a t i o nl e s st h a n5 0 n g m l t oi n c r e a s et h ef l a g e l l i n c o n c e n t r a t i o nw i t hl u m i n a ls i d e d o e sn o tc a u s ead e c l i n ew i t ht e ra n dai n c r e a s e s w i t hh r pf o w w h e ni l 17c o n c e n t r a t i o n g r e a t e r t h a n5 0 n g m l w i mt h e c o n c e n t r a t i o no ff l a g e l l i ni n c r e a s e s 1 1 1 et r a n s m e m b r a n er e s i s t a n c eg r a d u a l l yd e c l i n e a n dh r pf l o wg r a d u a l l yi n c r e a s e c o m p a r ew i t hn a i v ec o n t r o lg r o u pa n dt h es m a l l c o n c e n t r a t i o nf l a g e l l i ng r o u p t h ed i f f e r e n c ew a ss t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n t 2 i m m u n o c h e m i c a lr e s u l t so b s e r v e du n d e ra i lo p t i c a lm i c r o s c o p ec e l l s i l 17 t h r o u g ht h e i n t e r v e n t i o no ft 8 4c e l l s i l 17g r o u p c y t o p l a s m n u c l e u s c e l l m e m b r a n ew a sd y e db r o w n w i t hr e s p e c tt ot h en o r m a lg r o w t ho ft 8 4c e l l s n e g a t i v e c o n t r o lg r o u p c y t o p l a s m n u c l e u s c e l lm e m b r a n ei s d y e db r o w ns i g n i f i c a n t l y r e d u c e de x t e n t t h er e s u l t ss u g g e s tt h a t c e l lm o n o l a y e rp e r m e a b i l i t yi n c r e a s e d g a l 9 o v e rt h ec e l lm o n o l a y e rp e r m e a b i l i t yo fn o r m a lc e l l se x p r e s s i n gt h eg a l 9r e d u c e d l e v e l s b ye l i s ai n c e l l s u p e r n a t a n t s l u m i n a ls i d es h o w e dg a l 9 h i g h c o n c e n t r a t i o n so fi l 17w e r es i g n i f i c a n t l yh i g h e rt h a nt h en o r m a lc o n t r o lg r o u p t h e d i f f e r e n c ew a ss t a t i s t i c a l l y s i g n i f i c a n t p o 0 5 i l 1 7a c t so nt i p st 8 4c e l l m o n o l a y e rp e r m e a b i l i t yc a u s e db yt h ec h a n g ei nt h e r o l e o fc e l l s u p e m a t a n t s c o r r e s p o n d i n ge x p r e s s i o no fg a l 9i nt h ei n t e r v e n t i o ng r o u pw a ss i g n i f i c a n t l yl o w e r t h a nt h o s ew i t h o m 3 h r pf l o wa n dc o r r e l a t i o na n a l y s i so ft h er e s u l t so fg a l 9 b e t w e e ng a l 一9a n d h r pf l o wr 0 9 4 2 p 0 01 e x p l a i nn e g a t i v ec o r r e l a t i o nb e t w e e nt h ec o n c e n t r a t i o n o ft h es u p e m a t a n tg a l 一9a n dh r pt r a f f i c c o n c l u s i o n 1 i l 1 7i n c r e a s eh u m a ni n t e s t i n a l e p i t h e l i a l c e l ll i n et 8 4m o n o l a y e r s p a r a c e l l u l a rp e r m e a b i l i t y v i a b s t r a c t 2 a f t e rt 8 4c e l lm o n o l a y e r si n c r e a s e dp e r m e a b i l i t yr e d u c e dt h ee x p r e s s i o no f g a l 9 k e y w o r d s i l 17t 8 4m o n o l a y e rg a l 9 v i i 目录 目录 正文部分 缩略词表 i i l 1 7 对t 8 4 细胞通透性及g a l 9 表达的影响 1 前言 1日 舌 材料和方法 3 结果 9 讨论 1 2 结论 1 6 参考文献 17 综述部分 i l 1 7 及t n f 仅与i b d 的研究进展 1 9 参考文献 2 8 附录部分 个人简历及在学期间发表的学术论文与研究成果 3 2 致谢 3 3 缩略词表 英文缩写 m d u c c d t e r h r p e l i s a t n f h e 几 t i m 3 g a l 9 i f n t l r 缩略词表 英文全称 i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e s u l c e r a t i v ec o l i t i s c r o h n sd i s e a s e t r a n s e p i t h e l i a le l e c t r i cr e s i s t a n c e h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e e n z y m e l i n k e di m m u n ea s s a y t u m o rn e c r o s i sf a c t o r h e m a t o x y l i n e o s i n i n t e r l e u k i n tc e l li m m u n o g l o b u l i nm u c i nd o m a i n3 g a l e c t i n 9 i n t e r f e r o n t o l l l i k er e c e p t o r 中文译名 炎症性肠病 溃疡性结肠炎 克罗恩病 跨上皮电阻 辣根过氧化物酶 酶联免疫吸附测定 肿瘤坏死因子 苏木素 伊红 白细胞介素 t 细胞免疫球蛋白粘多糖蛋白3 半乳糖凝集素9 干扰素 t 0 l l 样受体 丽舌 i l 1 7 对t 8 4 细胞通透性及g a l 9 表达的影响 研究生刘静 导师冯百岁 郑州大学第一附属医院消化内科 河南郑州4 5 0 0 5 2 上 一 刖看 炎症性肠病 i n f l a m m a t o r yb o w e ld i s e a s e i b d 是发生在消化道的慢性非特 异性炎症性肠病 病因尚不明确 包括溃疡性结肠炎 u l c e r a t i v ec o l i t i s u c 和 克罗恩病 c r o h n sd i s e a s e c d 两种 其病程漫长 容易复发 难以治愈 这 样一个反复模式 严重影响了病人的生活质量 目前随着人们生活水平的提高 及饮食结构的改变 i b d 在我国的发病率呈逐年上升局趋势 u c 病变主要发 生于结肠和直肠 并常伴有脓血便 是结肠癌的高危因素之一 c d 则多见于回 肠末端和临近的结肠 常有瘘管形成 并常并发肠梗阻 由于此类疾病反复发 作 使很多患者面临着终生治疗 治疗花费巨大 患者的家庭经济负担和精神 负担较大 目前 由于i b d 的病因及发病机制的研究尚不十分清楚 临床上对 于该类疾病的治疗主要以对症治疗为主 所以研究该病的发病机制以及寻找新 的治疗方法仍是热点 大量研究结果显示i b d 是基因和环境因素共同作用从而导致肠道的菌群失 调以及黏膜屏障破坏 异常免疫应答反应有关 根据i b d 动物模型的研究结果 显示 i b d 的组织损伤是由免疫和非免疫细胞共同作用的结果 细胞因子在其中 发挥着重要的作用 c d 4 t 细胞群在炎症性肠病的发病及转归中发挥着重要的 作用 主要通过一些与之相关的细胞因子损害肠道粘膜 引发粘膜炎症 l 传 统观念认为t h l 和t h 2 在i b d 的发病中发挥着重要作用 c d 被认为与t h l 细 胞分泌的干扰素 t n f a i l 1 2 等密切相关 而u c 则认为主要与由t h 2 细胞 分泌的i l 4 和i l 1 3 由于影响肠上皮粘膜的紧密连接所诱导形成的 2 3 但是临 床针对c d 的临床实验研究结果显示 利用抗i f n y 及抗i l 1 2 p 4 0 对c d 的疗 日u舌 效并不显著 此外t n f a 单抗也仅对5 0 的c d 患者有反应 4 矧 这就提示了该 病的黏膜反应中有其他的细胞因子的参与 t h l 7 细胞是一种新近发现的一组不同于t h l t h 2 细胞的c d 4 十t 细胞亚 群 它的发现源于对自身免疫性疾病模型的研究 i l 1 7 被认为是由该细胞特 异性分泌的一组细胞因子 其包括i l 1 7 a b c d e f 这6 个家族成员 将这群细胞命名为t h l 7 细胞 自i l 1 7 发现以来 i l 1 7 一直被认为是一种炎性 细胞因子 与多种自身免疫性疾病有关 近期i l 1 7 抗体在在银屑病 葡萄膜炎 等的试验已经进入临床试验 7 1 但在i b d 中的临床治疗效果不甚理想 那么i l 1 7 在i b d 中的发病机制可能与其他的自身免疫性疾病不同 还有待于我们进一步 研究 半乳糖凝集素9 g a l e c t i n 9 g a l 9 是g a l e c t i n 家族的一员 存在于各种生 物体内 是一种多糖连接蛋白 g a l 9 可以使i f n t n f 和i l 1 2 等炎症因子下 谢引 也是t 细胞免疫球蛋白粘多糖蛋白3 tc e l li m m u n o g l o b u l i nm u c i nd o m a i n 3 t i m 3 的天然配体 二者结合后可产生多种生物学效应 在诱导细胞凋亡和自 身免疫疾病中发挥重要的调节作用 9 g a l 9 t i m 3 分子可以下调自身免疫性疾 病 并诱导免疫耐受 阻断体内的g a l 9 t i m 3 通路后会导致i b d 病情加重e i o 那么激活这条通路可能起到治疗作用 也提示g a l 9 可作为潜在的i b d 治疗药 物 我们在前期研究发现g a l 9 可能与肠上皮细胞之间的紧密连接有关 g a l 9 很可能参与维持上皮细胞连接的功能 那么上皮细胞屏障功能受损是否与g a l 9 的表达水平有关 值得我们进一步研究 目前 i l 1 7 在i b d 中的促进还是抑制关系仍然存在争议 本实验就在 t r a n s w e l l 跨膜培养系统上培养t 8 4 细胞单层 以此模拟肠上皮屏障 采用i l 1 7 处理 测量处理前后极化t 8 4 细胞单层 t 8 4m o n o l a y e r 的跨上皮电阻 t r a n s e p i t h e l i a le l e c t r i cr e s i s t a n c e t e r 的改变及对大分子物质辣根过氧化物酶 h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e h r p 流量的检测 研究上述细胞因子对t 8 4 细胞单 层通透性的影响 并检测通透性发生改变的相应组的t 8 4 细胞单层g a l 9 的变化 进而探讨肠上皮屏障受损是否是与g a l 9 水平的改变有关 2 材料和方法 1 实验材料 材料和方法 1 1 实验细胞 人结肠腺癌细胞株t 8 4 购子中国科学院上海细胞所 1 2 药品与试剂 d m e m f 1 2 培养基 美国g i b c o b r l 公司 胎牛血清 美国g i b c o b r l 公司 a n t i g a l 9 a n t i b o d y a b 6 9 6 3 0 美国a b e a m 公司 r e c o m b i n a n th u m a ni l 17 2 0 0 17 美国p e p r o t e c h 公司 辣根过氧化物酶 h r p 鼎国生物有限公司 二氨基联苯胺 d a b 显色试剂盒 博奥森生物技术有限公司 过氧化物酶标记的链霉卵白素 s p 染色试剂盒 博奥森生物技术有限公司 人g a l 9e l i s a 试剂盒 博士德生物有限公司 1 3 主要仪器 t r a n s w e l lp e r m e a b l ef i l t e r 美国c o m i n g 公司 m i l l i c e l l e r s 细胞电阻仪 美国m i l l i p o r e 公司 双目显微镜 日本o l y m p u s 公司 显微照相仪 日本o l y m p u s 公司 h e p ac l a s s l 0 0 细胞孵箱 美国t h e r m o 公司 单人生物安全柜 美国t h e r m o 公司 台式离心机 美国t h e r m o 公司 微量移液器 德国e p p e n d o r f 公司 多功能酶标仪 美国b e c k m a nc o u l t e r 公司 3 材料和方法 2 实验方法 2 1 主要试剂 缓冲液的配制方法 1 0 0 1m p b s 液 磷酸二氢钾 k h 2 p 0 4 0 2 9 磷酸氢二钠 n a 2 h p 0 4 1 1 5 9 氯化钠 n a c l 8 9 氯化钾 k c l 0 2 9 加入超纯水约8 0 0 m l 充分搅拌 溶解 然后加入浓盐酸调p h 值至7 4 最后定容到1 l 高温高压灭菌后室温保 存 2 磷酸盐缓冲液 p b s t 磷酸二氢钾 k h 2 p 0 4 o 2 9 磷酸氢二钠 n a 2 h p 0 4 1 1 5 9 氯化钠 n a c l 8 9 氯化钾 k c l o 2 9 吐温一2 0 o 5 m l 加蒸馏水约8 0 0 m l 充分搅拌溶解 然后加入浓盐酸调p h 值至7 4 最后定容至 1 l 常温保存 3 碳酸盐缓冲液 取0 1 7 9n a 2 c 0 3 溶于蒸馏水中定容至8 m l 取0 2 9 9 n a h c 0 3 溶于蒸馏水中定容至1 7 m l 将两者混合加7 5 m l 蒸馏水 定容至1 0 0 m l 室温保存 4 t m b 显色液 t m b 干粉溶于d m s o 配成l m g m l 之后按1 0 0 9 0 0 加 入0 1 m 柠檬酸与0 2 m 磷酸氢二钠混合缓冲液 再以1 0 0 0 1 加入3 h 2 0 2 现配 现用 5 d a b 显色剂 l m l 蒸馏水中依次滴加d a b 染色试剂盒中显色液a b c 各一滴 混匀后使用 6 盐酸酒精分化液 浓盐酸l m l 7 5 酒精9 9 m l 混匀后使用 室温保存 2 2 方法 1 细胞培养 t 8 4 细胞株 来源于人结肠癌细胞 可分化成为有极性的肠上皮细胞 培养 条件如下 p h7 4 的1 7 5 c m 2 培养瓶中 培养基的成分如下 d m e m f 1 2 培养 基 添加1 5 m mh e p e s 2 m ml 谷氨酰胺 1 4 r a mn a h c 0 3 1 0 0 u m l 青霉素 1 0 0 u g m l 链霉素 培养于3 7o c 5 c 0 2 的细胞培养箱中 隔日换液 当细胞融 合达到8 0 左右以后 通过胰酶消化进行传代 2 t 8 4 细胞单层通透性的检测 将t 8 4 细胞以 5 x 1 0 5 l x l 0 6 c e l l s c m 2 培养于t r a n s w e l l 1 2 m m 细胞跨膜 培养系统上 再培养6 7 天 将测量t 8 4 细胞单层的t e r 及h r p 流量 作为评 4 材料和方法 价t 8 4 细胞单层通透性的指标 t a k e 孵零搿黔l of r o mb a s a lc h m 触r 图1t r a n s w e l l 细胞跨膜培养系统 a t e r 测定 t e r 与t 8 4 细胞单层完整性相关 t 8 4 细胞接种到t r a n s w e l l 细胞跨膜培养系统后 每天使用m i l l i c e l l e r s 系统检测t 8 4 细胞单层t e r 上 皮成熟的指标为 t e i 也1 0 0 0 q c i i l 2 方法如下 采用参考文献中测定方法以及 制造商所提供的说明书 应用m i l l i c e l l e r s 细胞电阻仪测定各细胞跨膜培养系 统的t e r 当t e r 1 0 0 0 1 c m 2 后 随机进行分组 正常对照组 i l 1 7 组 分 别加入干预因素检测作用前后t 8 4 细胞单层的t e r 值 每次实验中设置2 个不 接种细胞的空白孔 细胞单层t e r 实际测量t e r 空白孔t e r t r a n s w e l l 有效 膜面积 使用t v c m 2 表示 实验中为了确保所测数据的准确性采取如下措施 为了保证t r a n s w e l l 上下两室静水压相等 在t r a n s w e l l 肠腔侧加入5 0 0 u l 培养 基 基底侧加入1 5 m l 培养基 每次测量时将t r a n s w e l l 的三个孔进行反复测量 每个孔进行反复测量到连续三次出现相同结果再记录 并分别记录三个孔中测 量值 取三个孑l i i i 量值的平均值做为实际测量t e r 每次测量时均统一在恒定 温度下 2 3 进行 b h r p 流量的检测 将j a c o bc 等所 l l 报导的方法通过修改后用于检测 h r p 流量 以此作为t 8 4 细胞单层的通透性评价指标 方法如下 将t 8 4 细胞单层培养在t r a n s w e l l 细胞跨膜培养系统中 在肠腔侧中加入i l 1 7 加 入i l 一1 7 2 h 后更换上下腔培养基 在肠腔侧加入h r p o 0 0 1 m m 放至3 7o c 5 c o2 细胞培养箱中继续进行培养 2 h 后收集t r a n s w e l l 细胞跨膜培养系统 基底膜侧中的培养基 并采用酶联免疫吸附测定 e n z y m e 1 i n k