（纺织化学与染整工程专业论文）dtp高效降解菌的特性研究及对pet纤维的降解初探.pdf

天津工业大学硕卜研究生学位论文 摘要 聚对苯二甲酸7 , - - 酯( p e t ) 是通用的高分子材料之一，广泛应用于各个领 域。为了对p e t 进行减量处理和表面改性及能有效地处理p e t 废弃物，人们开 始了对p e t 降解菌及微生物对p e t 降解性能的研究。而由于p e t 具有疏水性而 且结构致密，现有的菌种都不能对其进行生物降解，所以只能通过人工培养，筛 选出p e t 的高效降解菌。 因为对苯二甲酸二乙酯( d t p ) 与p e t 的基本单元结构上相似，因此本实验以 d t p 为模拟物来培养和驯化p e t 的降解菌，并对其降解性能进行研究。另外，作 为一种化学试剂d t p 本身也是一种环境荷尔蒙，对生物体内分泌系统有扰乱和破 坏作用。 本课题从对d t p 有降解作用的混合菌悬液中分离出5 株纯种菌，并从中筛选 出对d t p 降解作用最好的菌株f 4 。经革兰氏染色试验判定菌株f 。为革兰氏阳性 菌，经氧化酶和过氧化氢酶试验判定菌株f 4 为好氧菌。 我们对菌株f 4 的生长特性进行了试验。结果表明在培养基m 5 中菌株f 4 的生 长情况最好，远远好于培养基m 1 ，m 2 和m 3 中的生长。d t p 浓度对菌株f 4 的生 长速率和生长总量均有影响，d t p 的浓度越高，菌体的总量就越大：在较高d t p 浓度下菌株f 4 的生长速率也大于在低浓度下的生长速率。另外，作为代谢产物的 对苯二甲酸对菌株f 4 的生长有一定的抑制作用。菌株f 。的最佳生长温度是3 0 。c ， 最佳p h 值为7 5 ，并且菌株f 4 在振荡情况下的生长情况要好于静止条件下培养 的。 本课题还对菌株f 4 降解d t p 的影响因素及其动力学进行了分析。菌株f 。降 解d t p 的最适温度为3 0 。c ；最适p h 值为7 5 ；菌株f 4 对d t p 的降解适合于振 荡培养，且振荡速率越高降解效果越好；随降解液中接种量的增加，d t p 的降解 率也增大。菌株f 。对d t p 的降解符合一级动力学特征。 为了对d t p 及p e t 纤维的生物降解进行深入探讨，我们提取了菌株f 。的胞 外和胞内酶的粗酶液，并进行研究。初步认定菌株f 4 的d t p 降解酶主要定域于 胞内。提取酶e 自对d t p 的催化降解反应的米氏常数k 。为o ，6 2 6 9 l ，即3 8 天律工业大学硕士研究生学位论文 1 0 一m o l l 。提取酶e 自对d t p 降解的最适p h 值为7 8 ，最适合的温度为3 0 。c 左 右。 为与提取酶进行比较，本课题还用s i g m a 公司的脂肪酶进行与提取酶同样的 试验。s i g m a 脂肪酶对d t p 的催化降解反应的米氏常数k 。为7 8 2 9 l ，即4 7 1 0 m o l l ；最适p h 值为7 8 ，最适合的温度为3 0 。c 左右。由k 。可知，提取酶e 。对d t p 的亲和力大于s i g m a 脂肪酶，它更适合于d t p 的降解。 本课题分别用s i g m a 脂肪酶、菌株f 4 及其提取酶对p e t 纤维进行了降解实 验。菌株f 。对p e t 纤维确有降解作用。s i g m a 脂肪酶对p e t 纤维的降解作用十 分微弱。单纯用提取酶e ”和e 一对p e t 纤维进行降解，基本上都没有什么效果； 而提取酶e * 和em 的混合物对p e t 纤维则有一定的降解效果。提取酶的混合物 对p e t 纤维的降解效果比菌株f 4 的降解效果好许多。 尽管对p e t 纤维的生物降解效果还不是很理想，但目前的研究成果为今后的 进一步研究奠定了基础。 关键词：生物降解；d t pp e t 纤维 i i 天津工业大学硕士研究生学位论文 a b s t r a c t p o l y ( e t h y l e n et e r e p h t h a l a t e ) ( p e t ) h a sb e e nu s e dw i d e l yi nt h ew o r l d i no r d e rt o d i s p o s a l p e tw a s t e ro rm o d i f yt h es u r f a c eo fp e tf i b e r , b i o d e g r a d a t i o no f p e tf i b e rh a sb e e ns t u d i e d b e c a u s eo f i t sh y d r o p h o b i c n a t u r ea n di t s c o m p a c t s t r u c t u r ep e tc a nn o tb e d e g r a d e db y m i c r o o r g a n i s m si ne n v i r o n m e n t ，s ow eh a v et os c r e e na n di s o l a t ep e t d e g r a d i n gm i c r o o r g a n i s m s v i a e x p e r i m e n t i nt h i s p a p e rw eu s e d t pa ss i m u l a c r u mt of i n d s t r o n g e rp e t d e g r a d a t i o nm i c r o o r g a n i s m s i na d d i t i o n ，d t pi t s e l fi s a ne n v i r o n m e n t a l h o r m o n e f i v es t r a i n sh a v e b e e no b t a i n e d ，a n dt h es t r o n g e s td t p d e g r a d a t i o n a l s t r a i nh a sb e e ni s o l a t e dw h i c hw a sn a m e d f 4 t h ec h a r a c t e r i s t i c so ff 4h a s b e e n s t u d i e d m 5 i st h e b e s tf a v o r i t em e d i u mt o f 4 ，a n dt h eh i g h e r c o n c e n t r a t i o no fd t pi nm e d i u m ，t h ef a s t e rf 4g r o w t os o m ee x t e n tt a i s a ni n h i b i t o ri nt h eg r o w t ho ff 4 t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo f t h eg r o w t h o f f 4 i s3 0 。ca n dt h eo p t i m u m p h i s7 5 t h ei n f l u e n c ef a c t o ro fd t p d e g r a d a t i o nb yf 4h a sb e e ni n v e s t i g a t e d t h eo p t i m u m t e m p e r a t u r eo fd e g r a d a t i o ni s3 0 。c a n dt h eo p t i m u m p h i s 7 5 t h ee f f e c to f d e g r a d a t i o ni ns h a k i n gi sb i g g e rt h a nm o t i o n l e s sa n dt h e e f f e c ti n c r e a s ew h e ni n o c u l a t i o nr i s e t h e d e g r a d a t i o nk i n e t i c o fd t p i i i 天律工业大学硕士研究生学位论文 a c c o r d sw i t hm o n o d e q u a t i o n t h ec r u d e e n z y m e e x t r a c t e df r o mf 4h a sb e e nr e s e a r c h e d t h e i n t r a c e l l u l a r e n z y r f l e h a sm o r ee f f e c tt h a ne x t r ac e l l u l a re n z y m e t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h o ft h ec r u d ee n z y m ea c t i v i t yt od t pw e r e 3 0 。ca n d7 - 8r e s p e c t i v e l y t h em i c h a e l i s m e n t e n sc o n s t a n t ( k m ) o f d t p e n z y m i cd e g r a d a t i o n w a s3 8m m o l l t h ec o n t r o le x p e r i m e n t sh a v eb e e nd o n ew i t hs i g m ae s t e r a s e t h e o p t i m u mt e m p e r a t u r ea n dp h o ft h ec r u d ee n z y m ea c t i v i t yt od t p w e r e 3 0 。ca n d7 - 8 t h em i c h a e l i s m e n t e n sc o n s t a n t ( k m ) o fd t pe n z y m i c d e g r a d a t i o n w a s4 7mm o l l i nt h i s p a p e rs i g m ae s t e r a s e ，f 4a n di t s i n t r a c e l l u l a re n z y m eh a v e b e e nu t i l i z e di nt h ed e g r a d a t i o no fp e t f i b e r t h er e s u l ts h o w e dt h a tf 4 a n ds i g m ae s t e r a s eh a v es o m ee f f e c tt op e tf i b e r ，b u tt h i se f f e c ti sv e r y w e a k t h e r ei sn oe f f e c tu s i n gi n t r a c e l l u l a re n z y m ea n de x t r ac e l l u l a r e n z y m e t od e g r a d ep e tf i b e rs e p a r a t e l y , b u tt h em i x t u r eo fi n t r a c e l l u l a r e n z y m e a n de x t r ac e l l u l a re n z y m eh a ss o m e e f f e c t t h ee x p e r i m e n ti nt h i sp a p e re s t a b l i s h e dag o o df o u n d a t i o nf o rt h e f t l r t h e rr e s e a r c h k e y w o r d s ：b i o d e g r a d a t i o n ；d t p ；p e t f i b e r 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究 成果除了文中特别加以标注和致谢之处外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过 的研究成果，也不包含为获得丞洼王些太堂或其他教育机构的学位或证书而使用过 的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说 明并表示了谢意。 学位论文作者签名：讹键哩 签字日期：_ “陴， 月卜? 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解云洼王些盍堂有关保留、使用学位论文的规定。特 授权丞湟王些太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 并采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编以供查阅和借阅。同意学校向国家 有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权说明) 学位论文作者签名：7 吃龟哩 导师签名 狐健西 签字日期：v 】年i t 月i 日签字曰期：年月 | 三| 天津二f ：= 业大学碳l 一研究生学位论文 第一章前言 1 1 研究的背景 1 1 1 聚酯( p e t ) 废弃物的处理 ( 1 ) p e t 制品的发展现状 聚酯纤维( p e t ) 由英国化学家w “n f i e l d 和d i x o n 于1 9 4 1 年发明，1 9 4 9 年率先在英国实现工业化生产。由于聚酯纤维( p e t ) 具有良好的机械性能，从 而成为合成纤维中发展速度较快的品种。2 0 世纪中叶以来，随着世界石油工业 迅猛发展，聚酯的原料市场得到极大丰富，这更加快了聚酯产品的发展速度。 聚酯纤维一直是合成纤维领域中产量最大、种类最多的品种。2 0 0 0 年，全世界 涤纶纤维总产量为1 8 8 2 5 万吨，其中长丝1 0 7 1 9 力1 吨f ”。作为一种性能优良 的高分子材料，聚酯除用作合成纤维外，还广泛应用于食品包装、胶片、薄膜 制品以及工程塑料等。据报道，世界范围聚酯年产量约数千万吨，而其消耗量 仍以每年1 1 的速度在增长吼 ( 2 ) p e t 制品的环境行为和生态效应 随着p e t 产业的快速发展和广泛应用，每年都会产生大量的p e t 废弃物， 我国每年约有4 0 0 k t 的聚酯废料产生【3 1 ，虽然这些聚酯废料本身毒性不大，不会 直接对环境造成危害，但由于其废弃物数目巨大，而且很难在自然条件下降解， 故认为它也是环境有害物质。 e d g e 4 1 和a l l e n 5 1 预测p e t 的存在周期为1 6 4 8 年，r u d a k o w a 6 1 研究认为 p e t 在人体与动物体内的降解将持续3 0 年；聚酯瓶在湿度4 5 一1 0 0 、温度2 0 的环境中存在3 0 4 0 年，其性能仅有5 0 的损失；相同条件下，聚酯胶片可 以存在9 0 1 0 0 年之久。因而从环境和生态角度考虑，p e t 废弃物已成为全球 性的环境污染有机物。 ( 3 ) 目前常用的p e t 废弃物的处理方式及其局限性 p e t 废弃物多以工业垃圾和生活垃圾的形式存在。p e t 制品形成的垃圾为 固体垃圾，它们密度小，体积大且难以分解，很难处理。目前，固体垃圾的处 灭津工业人学硕士研究生学位论文 理方法主要有三种：填埋、焚烧和回收再利用。大多数国家以填埋为主要方式。 填埋法虽然是最古老最简单的方法，它操作简单且成本较低，但这种方法却具 有许多不容忽视的缺陷，如占用大量土地、会污染土壤和地下水、释放有毒物 质、滋生病菌及将可利用的资源全部浪费等，因此许多国家都在积极采取各种 措施减少填埋处理。焚烧会产生许多有毒气体且焚烧的费用较高，因此焚烧在 一定程度上受到限制。 较之填埋与焚烧，循环利用是一种较科学的处理方法。1 9 9 3 年在日本随着 “促进再生资源的利用”法令的实施，指定聚酯瓶为第一大类回收产品并成立 了再循环公司；欧洲及美国等国家也纷纷开发并实施了p e t 聚酯的回收利用技 术。但聚酯废弃物的回收再利用并不能成为解决其环境污染问题的最佳方法。 首先可以进行再生的聚酯废料有一定限制，含有大量添加剂或含有其他难以去 除杂质以及已经是多次再生的产品，回收再利用有很大困难：其次大量不便收 集的聚酯产品，如农膜、垃圾袋等也不适合回收再生；再有回收代价太大或没 有回收价值的产品也不值得回收再利用。所以只有较少的一部分p e t 废弃物实 现了循环利用。以美国为例，在p e t 废弃物的处理方面也只实现了对部分p e t 塑料瓶的回收。 ( 4 ) 生物降解p e t 的研究现状 要想更好地处理p e t 废弃物，需要寻找新的途径。于是，生物降解的方法 进入人们的视线。自然界的光、热、水以及微生物等都可引起高聚物材料的降 解。p e t 有着良好的化学稳定性，自然条件下很难发生降解。但p e t 含有容易 受酶以及水分子破坏的酯键。这为生物降解p e t 提供了可能。而且微生物具有 极其多样的代谢类型及极强的变异性，因此人们完全有可能通过人工培养，筛 选出p e t 的高效降解菌。近年来的研究事实也表明许多原以为不可生物降解的 高分子也都找到了能降解它们的微生物或酶。研究工作者正在寻求用微生物来 降解p e t ，如果能够成功地找到高效降解菌，生物降解将是处理p e t 废弃物的 最好方法。 据报道日本京都工艺纤维大学已有人发现涤纶分解菌【7 】，可在2 个月内使涤 纶纤维强度最高降低5 0 。日本福井大学末信一郎教授等人也在进行这方面的 研究，并在培养、筛选微生物方面取得了显著的进展 8 】。此外，匈牙利塞哥德大 天津t 业大学硕士研究生学位论文 学的研究人员也在致力于微生物降解p e t 的研究。 1 1 2p e t 纤维的表面改性 ( 1 ) p e t 纤维在服装中的应用及存在问题 自从1 9 4 9 年开始商业化生产以后，聚酯纤维得以快速发展，并成为世界上 应用最广泛的合成纤维。聚酯纤维具有很多优良的性能，例如：高强度和高弹 性、良好的化学稳定性和耐磨性、良好的拉伸性、回复性和抗折皱性。但由于 它的疏水性和化学稳定性，聚酯纤维也有许多不良特性，如：易起球、易产生 静电、手感差、光泽耀眼、透气性差、难于染色和不易去污。由于这些缺点的 限制，聚酯纤维的织物很多隋况下只能用于低档服装面料和装饰用布。 ( 2 ) 传统的p e t 纤维表面改性的方法 人们曾尝试用各种方法对聚酯纤维进行处理，以改善其性能。表面改性是 改善聚酯纤维性能的重要方法。聚酯纤维的表面处理工艺有化学处理、光学处 理、等离子体处理等 9 - 13 】，这些方法可引起表层( o 0 1 l o o t a n ) 的物理或化学变 化，不影响纤维和织物的整体性质。聚酯纤维及其织物的化学处理应用最多， 它包括碱减量、氨解和强氧化剂氧化膨润等方法。其中碱减量法是目前聚酯纤 维表面处理技术工业化的成功实例。但是在碱减量过程中易损伤纤维，从而使 强度和质量下降。并且由于碱减量后纤维对光漫射的原因，织物的染色效果在 视觉上不够丰满，为了获得一般涤纶织物的同样效果，往往需要使用未碱减量 织物的1 5 2 倍染料。碱减量的织物虽然很容易达到衣料的日晒牢度，但由于 染料的迁移，其水洗牢度和摩擦牢度偏低。另外耗水量大和对环境的污染问题 已引起人们的重视。虽然碱减量是一种改善聚酯纤维性能的有效方法，但用新 的技术代替碱减量法处理聚酯纤维织物已经成为研究聚酯表面处理技术的重要 课题。 ( 3 ) 生物方法对p e t 纤维表面改性的研究进展 随着生物技术的迅猛发展，人们开始用酶来处理纤维及其织物。酶在纺织 加工中的应用始于1 8 5 7 年，当时，人们利用麦芽的提取物在织物印花前去除它 上面的淀粉浆。今天酶已经广泛地用于棉、麻、丝、毛等天然纤维的前处理和 后整理，但是酶在合成纤维化学加工中的应用，还处于探索阶段。 目前已有美国和日本的研究人员用微生物及酶对聚酯进行处理试验。试验 天津丁业大学瑚卜研究生学位论文 结果表明，经过处理的聚酯在形态、机械性能、亲水性和吸湿性、染色性能、 导电性能等方面均有明显改善。 佐藤用分支孢子菌属的分子孢子菌f 肼j 8 菌的酶，处理聚酯长丝和薄 膜，研究有关处理后的纤维表面状态变化和机械性质的变化等【1 4 1 。通过比较电 子显微镜观察表面状态的照片可以知道，通过此菌分泌分解酶的作用，在纤维 表面产生了许多裂缝和空隙。 在m e e y o u n gy o o n 等人的试验中，将低取向、低结晶的聚酯纤维x l d 2 0 4 分别用缓冲液和加有聚酯酶的缓冲液在p h 为8 6 ，温度为4 0 的条件下处理3 0 天，其纤维的物理变化通过s e m 观察，可看到x l d 2 0 4 纤维经聚酯酶处理后的 显著变化：在纤维表面产生大面积的鳞状体，这种降解显然不同于经n a o h 处 理后纤维表面产生的典型孔洞。丽且x l d 2 0 4 纤维经聚酯酶处理后失去光泽。 m e e y o u n gy o o n 等人的试验结果表明，经聚酯酶处理后，聚酯织物的断裂强度 和断裂延伸度明显降低，并有4 的减量【”1 。 m e e y o u n gy o o n 等人用g e n e n c o r i n t e r n a t i o n a li n c 的聚酯酶对纯聚酯纤维织 物d a c r o n 5 4 和d a c r o n 6 4 进行处理后，发现它们与水的接触角的明显变小，这说 明聚酯酶处理后的d a c r o n 5 4 和d a c r o n 6 4 织物的亲水性均有提耐1 5 】。y o u l o h s i e h 和l i s aa c r a m 用i c n 公司的脂肪酶处理p e t 织物后，其水接触角降为4 3 2 度，用g e n e n c o ri n t e r n a t i o n a li n c 脂肪酶处理p e t 织物后，其水接触角降为5 7 4 度 m 1 。 聚酯纤维被酶催化水解后产生的羧基，使其提高了与阳离子染料亲和力。 m e e y o u n gy o o n 等人通过总色差值的测定，得出了所有经聚酯酶处理的聚酯织 物试样与阳离子染料的结合均有显著增加的结论。试验结果表明经聚酯酶处理 的d a c r o n 5 4 ，d a c r o n 6 4 和c o f t e r r a 织物试样比用缓冲液处理的对照样均显示出更 深的颜色旧1 。经聚酯酶处理后的d a c r o n 6 4 织物对阳离子染料的结合尤为得到改 善。这一结果有力地证明了聚酯酶处理后聚酯表面羧基增多，从而增进了其与 阳离子物质的结合。 聚酯纤维的质量比电阻为1 0 1 3 。1 4 欧姆克厘米2 ，几乎是纤维中最高的。因 此它的导电能力很差，静电现象十分严重，给生产和服用造成极大的不便。同 本科研人员用脂肪酶处理白布后，用奥尼斯特式静电测试仪h 0 1 1 0 测它的带电 4 天津工业大学硕士研究生学位论文 特性。用织物和针织物的带电性试验方法( j i s l1 0 9 4 a 法) 在相对湿度6 5 情况 下进行测定【i ”。结果表明经处理后的织物导电性能有很大的改善，其中用从一 种酵母菌中提取的酶处理后，织物导电性增加最大。 1 2 研究的目的 p e t 制品的存在时间还不是很长，所以自然界中不会有天然的以p e t 为底 物的微生物存在，只能通过人工的方法进行分离、筛选和培育。若通过驯化和 培养找到能有效降解p e t 的菌株，就为处理p e t 废弃物找到一条有利于环保的 途径和方法。由p e t 降解菌生产出的酶，可以用于p e t 织物的减量加工和表面 改性，来改善p e t 纺织品的服用性能。 由于p e t 具有疏水性和高结晶度。要直接从p e t 着手筛选到能高效降解它 的微生物或酶非常困难。所以本实验以对苯二甲酸二乙酯( d t p ) 作为模拟物来 驯化和培养p e t 的降解菌。 另外，对苯二甲酸二乙酯作为一种化工产品，其本身也具有一定的污染性。 虽然它没有被列入优先控制污染物名单，但是有关部门经过检测发现它们对生 物体内分泌系统有扰乱和破坏作用，所以它也是一种环境荷尔蒙【17 1 。故研究对 苯二甲酸二乙酯( d t p ) 的生物降解也有积极的意义。 1 3 研究的内容 本课题拟从对d t p 有降解作用的混合菌中分离和筛选出一株d t p 的高效降 解菌，对其生长特性和降解d t p 的影响因素进行分析，研究其降解d t p 的动力 学，并将其用于对p e t 纤维的降解。 本课题还拟从这一d t p 的高效降解菌中提取出酶并进行初步定域，对提取 酶降解d t p 的动力学进行研究，对提取酶降解d t p 的影响因素分析，并将其用 于对p e t 纤维的降解。为与提取酶进行比较，本课题还用s i g m a 公司的脂肪酶 进行了对照试验。 灭津工业大学硕_ j 研究生学位论文 第二章理论 2 1 生物降解及其特点 生物降解是指有机物在酶的作用下经一系列生物化学反应转化为较简单化 合物的现象。有人提出了三种不同程度的生物降解【1 8 】： ( 1 ) 初步降解：即指母体高聚物的一部分结构发生了变化，原有分子的完整性 已经改变，但其对环境的危害尚未去除，其分解产物仍对环境质量或生物体健 康有不良影响。 ( 2 ) 环境可接受的生物降解，即母体高聚物虽然还没有被彻底降解，但已被降 解到对环境无害的程度，从保护环境不受损害的目的出发，这种程度的降解也 是可以接受的。 ( 3 ) 最终( 完全) 降解，即母体高聚物已完全无机化，在好氧条件下，高聚物 彻底氧化分解的最终产物是h 2 0 和c 0 2 ，可能还有氨、硫酸盐等无机产物。在 厌氧条件下，高聚物将通过水解酸化、产氢、产乙酸及产甲烷等阶段最后生成 甲烷和二氧化碳等气体。 与物理降解和化学降解相比，生物降解具有以下特点： ( 1 ) 生物降解反应迅速。 化合物形态和结构的改变，可以通过化学反应或生物作用来实现。尽管化学 反应也会使有机污染物的结构发生变化，但这种转化通常是细微的，产物与母 体化合物在结构上和毒性上经常很相似。但是生物作用则大不相同，生物作用 的实质是在酶的催化作用下进行的一系列生化反应。这种生化反应通常很彻底， 可使许多有机物降解为对人体无害的c o z 和i - 1 2 0 。另外酶促反应迅速，因此生 物降解反应非常迅速。 ( 2 ) 微生物在生物降解中起着重要作用。 环境中有植物、动物和微生物三大类生物，它们都能使有机物降解或转化， 但大量研究表明，使环境物质转化和降解的主要是微生物。这与微生物的生理 特征有关。首先，微生物在环境中存在的种群数量极大，分布极广，几乎分布 天津工业大学碗：l ：l i ) f 究生学位葩文 在人类活动所涉及的全部空间，即使在一些恶劣的极端环境中也会存在着各种 各样的微生物种类。其次，微生物细胞个体很小，有很大的比表面积，生理功 能多样化，易于适应环境，易于与环境中各种底物( 营养物质或污染物质) 接 触，并通过细胞膜与底物发生物质交换。第三，微生物简单的生殖方式和快速 的繁殖速度，也正是环境微生物被广泛利用的重要特征。随着生物工程技术的 发展，已经可以通过生物工程手段构建具有某种特殊功能的微生物新物种或菌 种，为人类的某个特殊目的服务。微生物在环境中与底物发生相互作用，通过 其代谢活动，会使底物发生氧化反应、还原反应、水解反应、脱羧基反应、脱 氨基反应、羟氧化反应、酯化反应等各种生理生化反应。这些反应的进行，可 以使绝大多数的物质，特别是有机物发生不同程度的转化、分解或降解，有时 是一种反应作用于物质，有时会是多种反应作用于物质或者作用于物质转化的 不同阶段。 ( 3 ) 生物降解常与微生物生长联系在一起。 生物降解的过程是有机物发生转化的过程，同时也是微生物呼吸与同化的过 程。在呼吸过程中，微生物利用有机物作为能源提供动力；在同化过程中，微 生物利用有机物中的碳和呼吸产生的能量构建细胞自身。同化作用的结果表现 为微生物生长，这样微生物可以有更多的酶来催化生物化学反应，从而加速底 物转化。可以用一个简洁的表达式表明这一原理： 碳源+ 能源+ 营养物+ 末端电子受体型型! 马微生物生物量+ 终产物+ 能量 ( 4 ) 生物降解受外界影响因素大 以上表达式虽然简明的阐述了生物降解过程的基本原理，但还不能包括生物 降解过程的全部内容。如环境条件( p h 值、温度、水分等) 会对生物降解过程 产生重要影响，环境中不同的碳源、不同的营养成分、不同的氧化还原电位以 及不同微生物种群也都会对生物降解过程产生影响。 归纳而言，影响微生物降解过程有微生物体系、碳源能源( 有机物) 、其他 营养因素及环境条件三大要素。各要素内部互相作用，各要素之间又彼此相互 作用，增加了这种作用的复杂性。因此同一种底物的生物降解过程往往有很大 的不同，形成的产物也有很大的差异，所以说环境中生物降解产物往往有不确 定性。 天津工业大学硕士研究生学位论文 2 2 微生物系统 2 2 1 微生物的营养 ( 1 ) 微生物的营养类型1 1 ”2 】 微生物种类多样，各类微生物对营养的需求有很大不同。根据对碳源和能 源的不同需求，微生物可以组合为四种不同的类型，见表2 1 表2 1 微生物的营养类型 类型碳源能源典型微生物 光能自养菌c 0 2光能蓝细菌、紫硫细菌、绿硫细菌藻类 光能异养菌有机物光能紫色非硫细菌( 红螺菌科细菌) 化能自养菌c 0 2无机还原物硝化细菌、硫化细菌、铁细菌、氢细菌 化能异养菌有机物有机物绝大多数细菌和全部真核微生物 ( 2 ) 微生物的营养要求【1 9 】 通常称微生物的营养物有六大要素，即碳源、氮源、能源、生长因子、无 机盐和水。 碳源 碳源是组成微生物细胞的主要元素，其构成细胞的骨架。化能异养型微生 物以有机碳化物作为必需的碳源和生命活动的能源。在实验条件下，制各培养 基最常用的碳源为葡萄糖，可为许多微生物利用。其他糖类如蔗糖、麦芽糖、 甘露醇、淀粉、纤维素，以及脂肪、有机酸、醇类、烃等可作为培养不同微生 物时选择使用的碳源。蛋白质、氨基酸既是氮素养料，同时也是碳素养料。米 粉、玉米粉、麦麸和米糠等常用作微生物固体发酵的碳源。自养型的微生物以 c 0 2 作为碳素营养在细胞内合成有机物质，故不需要向他们提供现成的有机碳化 物作为碳素营养。 能源 能为微生物生命活动提供最初能量来源的营养物或辐射能，称为能源。对于 各种异养菌来说，不少碳源同时也是能源，所以这些有机物具有双重的营养功 能。 氮源 氮是合成蛋白质和核酸必需的物质。绝大多数微生物都需要化合态氮作为 氮素养料，因而常用于培养基的氮源，分无机氮和有机氮两类。无机氮有铵赫、 天津1 二业大学硕上研究生学位论文 硝酸盐等。大多数真菌利用铵赫及硝酸盐；许多细菌能利用铵豁，但不能利用 硝酸盐。有机氮有蛋白胨、牛肉膏或牛肉浸汁、多肽及各种氨基酸等。此外， 豆芽汁、酵母膏等也是常用的有机氮源。 生长因子 生长因子是一类需要量很少但却能促进微生物生长的有机化合物的统称， 主要是氨基酸、嘌呤和嘧啶碱以及维生素。氨基酸为蛋白质的组分，嘌呤和嘧 啶为核酸的组分，维生素则是辅酶或辅基的成分。虽然所需要的量很少，但缺 少他们微生物不能生长和繁殖。有的微生物可以自己合成这类物质，有的则需 要外源供给，没有外源供应就不能很好的生长。前者称为生长因子自养型，后 者则称为生长因子异养型。 无机盐 微生物需要的无机盐包括常量元素和微量元素两大类。常量元素包括磷、 钾、钙、镁、硫、钠等六种，其浓度为1 0 4 1 0 。3 m o l l 左右。它们分别参与细胞 结构物质的组成、能量转移、物质代谢以及调节细胞原生质的胶体状态和细胞 透性等，如磷作为核酸、a t p 和细胞膜的重要成分，硫作为某些氨基酸和维生 素的成分，钠、钾、镁在细胞生理活动中起重要代谢调节作用，铁是细胞中血 红素和氧化还原酶系的重要组成成分。微生物生长时所需微量元素的浓度范围 为l o 一1 0 。6 m o l l ，微量元素主要有铁、硼、锰、铜、锌、钴和钼等，它们多是 辅酶和辅基的成分或酶的激活剂，在酶代谢中起重要作用。 水 水是微生物生存的基本条件，在细胞的生长和繁殖过程中起重要作用。除 休眠体( 如芽孢、孢子和孢囊等) 外，微生物细胞的含水量一般为7 0 9 0 。 水是许多营养物质的溶剂，水与微生物细胞正常胶体状态的维持、养料的吸收、 代谢废物的排泄以及细胞内的全部代谢生理活动息息相关。 2 2 2 微生物的生长规律【1 蚴o 】 微生物细胞在合适的外界条件下，会不断地从环境中吸收营养物质，进行 新陈代谢。如果同化作用的速度超过异化作用的速度，就出现个体细胞的生长。 随着个体的生长和繁殖，就会引起群体的生长。在微生物的研究中，一般只有 群体的生长才有意义。所以，本实验中所指的生长均是指群体生长。 灭津工业大学硕士研究生学位论文 为了研究微生物的生长规律，需要做出其生长曲线，。一般微生物的生长曲 线可分为四个时期：延滞期( 又称停滞期) 、对数期( 又称指数期) 、稳定期( 或称 静止期) 和衰亡期( 或死亡期) 。 典型生长曲线中四个时期的划分是根据微生物的生长速率常数，即每小时分 裂次数的不同而划分的。这种划分只适合于单细胞微生物如细菌和酵母菌，而 对于丝状生长的真菌或放线菌而言，其生长曲线是“非典型的”。典型生长曲线 与非典型生长曲线的差别在于后者缺乏对数生长期。 当菌种接到新鲜培养基中后，一般并不立即生长繁殖，而是要经过一段时 间的调整和适应，如合成多种酶、完善体内的酶系统及其他的细胞成分。于是 在生长曲线中就表现出一段延滞期。虽然在延滞期微生物生长缓慢，但它是一 个为下一步的快速增长做准备的时期。此时细胞内的基因开始转录，在基因转 录过程中，d n a 转录产生m r n a ，m r n a 启动各种活性酶的合成。在延滞期， 细胞的生长节奏是由m r n a 而不是由d n a 控制的。在这一时期微生物对环境 因素的反映极为敏感。所以延滞期菌种的特点是细胞质均匀，代谢活力很强， 蛋白质和r n a 含量增加，菌体体积显著增加，形成诱导酶的能力强，对环境的 变化敏感。 微生物的种类、菌龄、接种量和培养基成分都会影响延滞期的长短。例如 大肠杆菌延滞期短：分枝杆菌的延滞期较长。菌种年轻，正值旺盛生长期，则 延滞期可能很短，甚至不明显；如菌种已衰老，则延滞期可能延长，因这时酶 已不完全，体内储藏物质已消耗得差不多，进入新的培养环境后需要有个恢复 生长的过程。接种量大，延滞期可缩短；接种量小，延滞期可能延长。如果种 子培养基与新接种的培养基成分相同，则对菌的生长有利。原来简单，新的培 养基成分丰富，延滞期可缩短；原来易利用，新的培养基复杂，延滞期会拉长。 菌体通过延滞期的准备，微生物适应了新的环境，其生长就进入了对数期。 到对数期就进入了大量繁殖时期。此时菌种迅速分裂，使菌数按几何级数增加。 对数期世代时间最短，细胞生长速度最高，代谢活力最强。菌种的遗传性、温 度、营养和氧气均会影响对数期的长短。 经过对数期的生长，由于营养消耗、供应不足与代谢产物的积累，会有一 部分菌死亡，于是菌体进入了稳定生长时期。这时菌数达到最高峰；活菌数达 天津t 业大学硕士研究生学位论文 到动态平衡，即一部分死亡，一部分继续分裂，死亡的与新生的菌数相当，菌 数增长速度降至零。 由于营养缺乏和代谢产物积累造成的自身中毒，使细胞生长受阻，死亡率 明显增加，时间和菌数的对数成反比，生长曲线呈直线下降。这时菌株的生长 进入衰亡期。在衰亡期菌体把酶、储藏物等也作为营养，并逐渐耗尽。菌体原 生质中出现液泡与空泡，有的菌体自溶、解体，有的则形成芽孢。 2 2 3 影响微生物生长的环境因子c 1 8 2 2 2 5 t 6 1 ( i ) 温度 温度对任何生物而言都是重要的生态因子，当然微生物也不例外。温度可以 直接影响到生物体的活动、生长代谢以及存活等。 每一种生物都有一个适宜的温度范围。微生物在最适温度范围内具有最大 的生长速率、最佳的代谢效率和最高的成活率，在偏低的温度范围内，代谢率、 生长速率和成活率都随之下降，而在偏高的温度范围内，代谢会加快，生长速 率则出现不定的变化，存活率等则会明显下降。长时间处于较高温度的环境中， 对微生物种群的存活和竞争力的影响都是很重要的。 根据最适温度，可将微生物分为三类( 表2 2 ) ： 表2 2 微生物与最适温度的关系 类型最适温度( ) 低温性微生物 5 一1 0 中温性微生物 2 5 _ 4 0 高温性微生物 5 0 6 0 ( 2 ) p h 值 环境的p h 值必定会影响到微生物的生长与代谢，因为p h 值是影响生理生 化反应的重要影响因子，环境的p h 值的变化会引起微生物细胞表面特性的变化， 从而引起细胞体生理生化过程的变化，最终导致微生物代谢与生长的变化。一 般的微生物要求环境p h 值在5 - 9 之间，或者最宽的范围也是在4 1 0 之间，且 最适宜的p h 值较窄，在6 5 7 ，5 之间。 一些微生物在环境中对p h 值变化十分敏感，即适应范围很窄，但也有的微 生物对p h 值变化范围反应不灵敏，也即其适应范围较宽。一些在环境中因自身 天津工业大学硕士研究生学位论文 活动对p h 值产生影响的微生物对p h 值的变化范围适应较宽，因为微生物的生 长代谢对p h 值的变化有一定的缓冲作用，例如在碱性环境中通过产酸而调节p h 值，在酸性环境中通过消耗酸也可调节p h 值。 环境p h 值过高或过低都会对微生物的生长造成不利影响。这是因为： 可能使微生物细胞表面的电荷发生改变，从而影响营养的吸收。 影响酶的活性。因为酶的作用有其合适的p h 值范围，过高或过低都会降 低酶的活性，影响微生物的各种生化过程，从而影响其生长和繁殖。 会使环境中营养物质的存在状态发生改变，从而影响微生物的新陈代谢。 ( 3 ) 氧 氧对微生物的生命活动有着极其重要的影响。根据微生物与氧的关系，可将 微生物分为三类( 表2 _ 3 ) ： 表2 3 微生物与氧的关系 类型与氧的关系 好氧微生物必须在有氧条件下才能生长 厌氧微生物在无氧条件下生长 既能在有氧条件下生长， 兼性厌氧微生物 又能在无氧条件下生长 氧与微生物的关系较复杂，对微生物的生存具有至关重要的作用，就严格 厌氧微生物而言，氧将使微生物立即死亡，而对好氧微生物而言，缺氧也将导 致死亡。氧在环境中的存在又可用氧化还原电位来表示，有氧的环境中氧化还 原电位为正，而缺氧的还原性环境中的氧化还原电位为负。环境中氧化还原电 位的变化为4 0 0 - - + 8 2 0 m v 。环境中氧的分压决定了氧化还原电位的高低。 好氧微生物是利用氧作为生理代谢的最终电子受体，同时氧也可参与物质合 成。对于生活于水体中的好氧微生物，可以被利用的氧是溶解于水中的氧，氧 在水中的溶解度与水温、大气压等有关。 厌氧微生物在生长代谢过程中不需要氧，或者是不直接需要氧，如产甲烷菌 等。专一性厌氧菌不仅不能利用氧，反而遇氧就会中毒死亡。另一些厌氧菌的 专一性稍低，不能利用环境中的氧，但环境中的氧的存在不会使其出现中毒现 象。兼性厌氧微生物则是兼具厌氧和好氧微生物的两重特性，既具有脱氢酶， 又具有氧化酶，既能在无氧条件下生存，也能在有氧条件下利用环境中的氧进 天津工业大学硕士研究生学位论文 行有氧代谢。但是，在有氧和无氧条件下，微生物的代谢途径以及代谢的产物 会有所区别。 生物体内代谢过程中一个很重要的过程是生物氧化，体内能量的来源基本上 是代谢物质( 如蛋白质、糖、脂肪等) 的不断被氧化。虽然生物体内还有其他 方式可以产生能量，如水解、发酵等反应，但生物氧化是最主要、最基本的能 量供应方式。生物体通过吸收0 2 为体内的生物氧化过程提供电子受体，经过一 系列的电子传递过程将有机物氧化形成c 0 2 。生物体再将c 0 2 排出体外。一个 代谢过程包括以氧作为电子受体的生物氧化过程，则这种代谢便是好氧代谢。 好氧代谢不是每一个过程都需要氧的参与，而只是电子传递的最终受体是氧。 就微生物而言，也存在着无氧氧化的现象，这种无氧氧化只是不利用分子氧， 而是利用其他形式的氧，如s 0 4 卜，n 0 3 - 和h 2 0 等。在生物体内好氧代谢与无 氧代谢常常是联合进行的，如淀粉被降解为葡萄糖的过程与葡萄糖被氧化的过 程。 2 3 酶【2 3 以4 。2 7 】 2 3 1 酶的本质与组成 酶的化学本质除具催化活性的r n a 外几乎都是蛋白质。酶的催化活性依赖 于它们的天然蛋白质构象的完整性，这一完整性被破坏后，酶就会失活。 从化学组成来看，酶可分为单纯蛋白质和缀合蛋白质两类。属单纯蛋白质 的酶类，除蛋白质外，不含其他物质。属于缀合蛋白质的酶类，除蛋白质外， 还结合一些非蛋白质小分子物质或金属离子，蛋白质部分被称为脱辅酶，非蛋 白质部分称为辅因子。根据酶蛋白质分子的特点，又可将酶分为3 类：单体酶、 寡聚酶和多酶复合体。 2 3 2 酶催化作用的特点 酶催化的作用特点主要有以下几个方面： ( 1 ) 高效性：酶是自然界中催化活性最高的一类催化剂，酶的催化效率比一 般无机催化剂高1 0 5 1 0 1 3 倍，远远高于普通化学催化剂效能。 ( 2 ) 专一性：具备反应专一性和底物专一性，即酶一般只能选择性地催化一 种或一类相似类型的化学反应，几乎不产生副反应，同时一种酶只能作用于某 一种或某一+ 类结构和性质相似的物质。 天津工业大学硕士研究生学位论文 ( 3 ) 反应条件温和：酶能使许多生物化学反应可以在温和的条件下( 如室温、 常压和水溶液中) 以很高的速率和效率进行。 ( 4 ) 酶的活性受到调节和控制：酶可以在反应中自动调节活性，这是酶区别于 一般催化剂的重要特征。 2 3 3 影响酶活力的因素 ( 1 ) 底物浓度 当底物浓度较底时，反应速率与底物浓度的关系成正比关系，表现为一级 反应。随底物浓度的增加，反应速率不再按正比升高，反应表现为混合级反应。 如果底物浓度达到相当高时，底物浓度对反应速率的影响将变小，最后反应速 率与底物浓度几乎无关，反应达到最大速率，表现为零级反应。 根据酶底物中间络合物学说，即：在底物浓度很小时，酶不能被底物