STAT3特异性小干扰RNA表达载体的构建及其对STAT3表达的抑制.pdf

肿瘤2005年1月25日第25卷第1期tumor jan 2005 vol 25 no 1 基础研究 stat3特异性小干扰rna表达载体的构建及其对stat3表 达的抑制 吴 健 王方金 何蕴韶 3 摘要 目的 构建特异性抑制信号转导与转录激活因子3 stat3 的小干扰rna sirna 表达载体并检测其对stat3表达及 pc23细胞增殖的抑制作用 方法 设计 合成stat3特异性的短链寡核苷酸 经退火形成双链dna片段 克隆到psilencert m 2 12u6载体中 构建stat3特异sirna的表达载体 hindiii和bamh i双酶切及测序鉴定重组体 并转染pc23细胞 g418筛 选出稳定表达细胞株 半定量反转录聚合酶链反应 rt 2pcr 方法和免疫印迹法检测stat3mrna和蛋白的表达水平 四甲 基偶氮唑蓝 mtt 检测细胞增殖活性 结果 经双酶切与测序鉴定成功构建stat32sirna表达载体 转染前列腺癌细胞株 pc23可显著抑制细胞中stat3mrna和蛋白的表达水平 抑制率分别为52 4 及50 5 且细胞增殖活性亦较未转染pc2 3细胞显著降低 p 0 05 结论 运用psilencert m2 12u6载体构建的stat32sirna表达载体可有效抑制stat3的表达及前 列腺癌细胞的增殖 关键词 rna 小干扰 转录激活因子3 细胞系 肿瘤 pc23细胞 中图分类号 q784 r737 25 文献标识码 a 文章编号 100027431 2005 0120037204 construction of stat3 specific small rna expressing vector and its effect on inhibition of stat3 expression wu jian wang fangjin he yunshao 3 department of anatomy basalm edical college sun yat2sen university guan2 gzhou 510080 china abstract objective to construct signal transduction and activators of transcription3 stat3 s mall interference rna sirna expression vector and to exam its effect on inhibiting stat3expression m ethod stat3specific oligonucleotideswere designed and synthesized these oligonucleotideswere annealed to form the double strand dna fragments and this fragmentwas cloned into psilen2 cert m2 12u6vector the recombinant stat32sirna expressing constructwas confir med by using hindiii and bamh i double digestion and by sequencing the stat32sirna was transfected into pc23cell and g418was used for selecting stable cell line the inhibitory effect of stat32sirna constructwas examinedwith semi2quantitative reserve transcription pcr andwestern blot cellularproliferation activitieswere assayed by tetrazolium bromide mtt colorimetry result stat32sirna expression vector was successfully con2 structed and it can effectively reduce the mrna 52 4 and protein 50 5 levels of stat3in transfected pc23cell line pc2 3cells transfected with stat32sirna expression vector have lower cellular proliferation compared with no2transfected pc23cells p 0 05 conclusion the stat32sirna expression vector can effectively inhibit the expression of stat3and the proliferation of pros2 tate cancer cells key words ran s mall interfering stat3 cell line tumor pc23 作者单位 中山大学基础医学院人体解剖教研室 广州 510080 通讯作者 tel 020237617475 e2mail yshe gzsums edu cn stat3为信号转导与转录激活因子 signal transduction and activators of transcription stats 家 族中的重要一员 目前研究表明许多肿瘤细胞系与 人肿瘤组织标本中都存在持续激活的stat3蛋白 而活化的stat3蛋白对肿瘤细胞的形成 生长 凋 亡抑制等过程起重要的调控作用 通过阻止stat3 的信号转导可抑制肿瘤的生长 增殖 因此如何抑制 stat3是目前探索肿瘤治疗的一条新的途径 1 2 本研 究 利 用rna干 扰 rnainterference rnai 这种新的基因阻断技术 以 psilencer t m 2 12 u6载体中的u6为启动子 stat3为靶基因 建立 了stat32sirna体内表达载体及稳定表达细胞株 并进一步了解其对前列腺癌细胞pc23中stat3表 达的抑制效应及其对pc23细胞增殖的抑制效应 为 前列腺癌的基因治疗提供基础 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 pc23细胞购自中国科学院上海生物细胞研 究所 psilencer neo t m 2 12u6购自ambion公司 73 肿瘤2005年1月25日第25卷第1期tumor jan 2005 vol 25 no 1 dh5 为本室 270 保存 1 1 2 质粒dna提取纯化试剂盒购自qiagen公 司 hindiii和bamh i内切酶 t4dna连接酶购自 takara公司 真核转染试剂lipofectamine t m 2000购 自invitrogen公司 rna提取试剂购自上海生工公 司 cdna第一链合成试剂盒购自mb i公司 f12细 胞培养液 胎牛血清 g418购自gibco公司 western blot检测试剂盒购自kpl公司 兔抗人stat3抗体 购自upstate公司 mtt购自sigma公司 dmso购 自上海生工公司 1 2 方法 1 2 1 stat3特异sirna转录模板设计及制备 从genebank上查阅stat3基因的全长序列 根据 目前通用的sirna设计原则 应用http www am2 bion com提供的 sirna target finder and design tool 设计stat3特异的19nt寡核苷酸序列 并连 上hindiii和b amh i酶切位点 用于形成茎环结构 的9bp序列及u6启动子终止序列共66bp 以形成 发夹状sirna转录模板 序列为正义链 5 2gatc2 cgcatctgcctagatcggc tattcaagagatagccgatctaggcagatg2 ttttttggaaa23 反义链5 2agcttttc2 caaaaaacatctgcctagatcggctatctc2tt2 gaatagccgatctaggcagatgcg23 由上海博亚 公司合成 分别稀释至1 g l 各取2 l与退火 缓冲液混匀后90 3min 再降至37 1h使形成 双链 1 2 2 stat3特异的sirna表达载体构建及鉴定 退火后的双链sirna模板与psilencer neo u6以 一定比例混合 在t4dna连接酶的作用下22 反 应1h 同时设立与人类基因组无同源性序列模板作 为对 照 转 化 至dh5 感 受 态 细 胞 接 种 于 100 g ml氨苄青霉素平板上37 培养过夜 次日 挑取单个阳性菌落扩增后 按试剂盒说明提取纯化 质粒dna 限制性内切酶hindiii和bamh i双酶切 鉴定并以m13 5 2gttttcccagtcacgac23 为引 物 进一步测序鉴定 阳性重组质粒命名为stat32 sirna 对照质粒命名为control2sirna 1 2 3 细胞培养及转染 pc23细胞用f12培养基 含10 胎牛血清 于37 5 co2温箱内培养 细 胞生长至80 融合时传代 转染前一天 将对数生 长期的pc23细胞10 6接种于培养瓶 24h以内细胞 融合达40 60 时进行转染 方法参照产品说明 书 5 gstat32sirna及control2sirna质粒分别用 15 l lipofectamin2000转染24h后 弃培养液 hank s液洗 g418 350 g ml 筛选培养约3周可获 得单个阳性克隆 挑取单个克隆扩大培养即可获得表 达st at32sirna及control2sirna的pc23细胞 1 2 4 逆转录聚合酶链反应 rt 2pcr 分别提取 pc23 stat32sirna及control2sirna表达细胞总 rna 取总rna2 g 以oligo dt为引物逆转录合成 cdna第一链 以此cdna链2 l为模板进行pcr 扩增 引物序列为stat3 上游 5 2cccatacct2 gaagaccaagtttatc23 下游 5 2tggaaataatg2 gtgaaggtgctg23 内参 照gapdh 上游 5 2catcttcttttgcgtcgc ca23 下游 5 2tcgccccacttgattttgg23 pcr反应条 件为95 预变性3min 95 30s 52 45s 72 45s 35个循环后再72 延伸7min 扩增产物2 琼脂糖凝胶电泳 凝胶成像系统灰度扫描stat3 gapdh电泳条带 以特异扩增产物条带与内参照条 带吸光度 d 值之比值做半定量分析 分析stat32 sirna表达组 control2sirna表达组及未转染pc23 细胞stat3基因的表达清况 1 2 5 免疫印迹 分别消化上述三种细胞 hank s 液洗涤1次 并以50 l hank s液悬浮 与等体积2 sds上样缓冲液混合 沸水浴10min 12 000 r min离心10min 取上清15 l上样进行sds2 page 8 积层胶 5 分离胶 电泳 300ma恒流 转移3h 将凝胶中的蛋白质转移至pvdf膜上 应 用免疫印迹 western blot 检测试剂盒参照产品说 明进行封闭 洗膜 一抗4 温育过夜 碱性磷酸酶 标记二抗室温育2h 洗膜 bcip nbt显色 兔抗 人stat3一抗工作浓度为3 g ml 鼠抗人gapdh 单克隆抗体工作浓度为1 300 抗兔igg二抗工作 浓度为1 400 抗鼠igg二抗工作浓度为1 400 1 2 6 mtt法检测细胞增殖 取对数生长期的 pc23细胞 stat32sirna及control2sirna表达pc2 3细胞 2 10 4个 ml分别接种至96孔板 每孔 100 l 平行四孔 细胞贴壁后更换无血清f12培 养液37 5 co2培养6h使细胞同步化 再次换 回含10 fbs的f12培养液100 l培养 每孔加 入mtt 5mg ml 10 l 培养4h 弃培养液 加入 二甲亚砜 dmso 150 l 振荡摇匀 使结晶完全溶 解 490nm波长酶标仪测各孔吸光度 a 值 同一 时间点连续检测5d 以时间为横坐标 吸光度值为 纵坐标绘制生长曲线 1 2 7 统计学处理以spss统计软件进行方 差分析 83 肿瘤2005年1月25日第25卷第1期tumor jan 2005 vol 25 no 1 2 结 果 2 1 stat32sirna表达载体的鉴定 stat3特异 性sirna寡核苷酸经退火形成的双链与psilencer neo t m 2 12u6载体连接后转化dh5 感受态细胞 37 培养16h后阴性对照平板无菌落生长 stat32 sirna及control2sirna平板有较多菌落生长 从二 个平板各随机挑取4个菌落 扩大培养抽提质粒 hindiii和bamh i进行双酶切 酶切产物凝胶电泳在 502100bp之间出现一片段 此片段长度与插入 stat32sirna片段 66 bp 大致相符 进一步对质粒 进行测序 表明其序列与插入的stat32sirna序列 完全一致 2 2 stat32sirna抑制stat3 mrna的表达 stat3基因pcr扩增片段长度为125bp gapdh基因pcr扩增片段长310bp pcr产物电泳 条带位置与大小相符 stat32sirna表达的pc23细 胞与control2sirna表 达 的pc23细 胞 相 比 其 stat3mrna表达量下降47 8 较未转染的pc23 细胞下降52 4 control2sirna表达的pc23细胞 stat3表达量与未转染pc23细胞相比无明显变化 见图1 m dna marker 1 control2sirna表达pc23细胞 2 stat32sirna表达pc23细胞 3 pc23细胞 图1 半定量rt2pcr检测stat3mrna的表达 2 3 stat32sirna抑制stat3蛋白的表达 凝 胶成像系统灰度扫描stat3与gapdh显色条带 结果表明与未转染的pc23细胞相比较 stat32sir2 na表达pc23细胞stat3蛋白表达量降低50 5 见图2 1 未转染pc23细胞 2 stat32sirna表达pc23细胞 图2 westen blot检测pc23细胞中stat32sirna蛋白表达 2 4 stat32sirna抑制pc23细胞增殖 图3表 明stat32sirna表达pc23细胞增殖活性明显减 弱 与对照组pc23细胞相比具有显著差异 p 0 05 图3 mtt法检测三种不同细胞生长曲线 3 讨 论 sirnas 即小干扰rna片段 是两端各有两个 碱基突出的小于25个碱基对的双链rna 2001年 tuschl 4 5 的实验室首次报道 21bp的小rna片段 在哺乳动物细胞中能特异性地抑制基因表达 同时 又不激活宿主细胞的抗病毒反应 由此引起rnai 在哺乳动物中的研究热潮 制备sirna的方法主 要有 化 学 合 成 体 外 转 录 长 片 断dsrnas经 rnaseiii类降解 质粒 病毒载体介异的sirna体内 93 肿瘤2005年1月25日第25卷第1期tumor jan 2005 vol 25 no 1 表达 sirna表达框介导的sirna体内表达等方式 其中质粒 病毒介导的sirna表达载体具有可用于 维持较长时间的基因沉默研究 且可用抗生素筛选 阳性克隆等优点 本研究利用rna聚合酶 启动子 人的u6 启动子 其终止信号为3 端3 6个连续t 可指导 转录出3 端突出包括一茎环的发夹结构 此发夹状 rnas将被dicer酶处理为sirnas 构建的质粒转染 细胞后 sirna将持续产生 并通过识别 降解具有 同源序列的mrna最终干扰目的基因的表达 6 同 时载体上引入新霉素 neo 抗性标记利于筛选含有 sirna的克隆以达到富集的作用 进一步对阳性细 胞扩大培养可获得稳定表达的细胞株 目前研究表明stat3在头颈部鳞状细胞癌 7 多发性骨髓瘤 8 乳腺癌 宫颈癌 前列腺癌 9 等多 种肿瘤组织与细胞系中异常表达或活性增强 提示 stat3调控异常与肿瘤发生 发展密切相关 进一步 研究表明在肿瘤细胞中对stat3信号通路进行抑 制可导致肿瘤细胞增殖减少及促进凋亡 mora 等 10 报导使用反义寡核苷酸抑制 stat3可抑制前 列腺癌细胞株du145的生长并可诱导其发生凋亡 ni等 11 报道使用 stat3显性负向突变体可在体外 抑制前列腺癌细胞生长 在体内则可抑制其致瘤性 因此通过特异性抑制stat3在肿瘤细胞中的表达 以抑制肿瘤细胞增殖可能成为肿瘤治疗的新途径 本研究利用rna干扰技术对stat3表达进行 特异性抑制 所采用的u6介导的stat32sirna表 达载体转染入前列腺癌细胞所形成的stat32sirna 稳定表达pc23细胞中stat3mrna表达下降52 4 stat3蛋白表达下降50 5 而且此类细胞的 增殖活性明显减弱 而无关序列的sirna表达载体 对stat3表达无影响 对于细胞增殖活性亦无明显 影响 表明干扰作用具有序列特异性 本实验已建 立了stat32sirna稳定表达的细胞株 利于进一步 进行动物体内实验观察其抑制效率 为肿瘤的基因 治疗用于动物体内实验提供基础 附 作者现工作单位为贵阳医学院附属医院 参考文献 1 calo v migliavacca m bazan v et al stat proteins from normal control of cellular events to tumorgenesis j j cell physiol 2003 197 2 1572168 2 bowman t garcia r turkson j et al stats in oncogenesis j oncogene 2000 19 21 247422488 3 fire a xu s montgomerymk et al potent and specific genet2 ic interference by double2strand rna in caenorhabditis elegans j nature 1998 391 6669 8062811 4 elbashir s m harborth j tuschl t et al duplexesof212nucle2 otide rnas mediate rna interference in cultured mammalian cells j nature 2001 411 6836 4942498 5 elbashir s m lendeckelw tuschl t rna interference is me2 diated by212and222nucleotide rnas j genesdev 2001 15 2 1882200 6 sui gc soohoo c shi y et al a dna vector2based rnai technology to suppre