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山东农业大学硕士学位论文 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官 的再生 专业： 指导教师： 发育生物学 张宪省教授 硕士研究生：梁国婷 摘要 植物离体器官的再生是植物发育过程研究的一个重要方面。包括激素 在内的多种因素调控了离体器官的再生。为了研究不同因素对于器官离体 再生的调节作用，本文利用w s 和c o l 生态型拟南芥的莲座叶作外植体， 在不同种类和浓度的细胞分裂素和生长素条件下，探讨了激素对植物器官 离体再生的影响。 无论是固定生长素，还是固定细胞分裂素的浓度，器官再生的频率随 着另一种激素浓度的增加呈现一种先增加后降低的趋势。而这个规律在根 作外植体的情况下，同样适用。 n a a 比2 ，4 d 和i a a 更易于诱导离体苗再生：n a a 最利于诱导 产生根。玉米素比6 - b a 更有利于诱导拟南芥离体器官的再生，所以激素 的种类影响了离体器官的再生。 细胞分裂素浓度与生长素浓度比例低时，利于诱导根的再生，比例高 时利于诱导苗的再生。细胞分裂素浓度与生长素浓度比例对拟南芥离体器 官再生的种类有影响。在相同条件下，w s 生态型的拟南芥比c o l 生态型 的拟南芥更容易诱导器官离体再生，表明外植体的遗传背景影响离体器官 的发生。根比莲座叶更容易再生离体器官，证明了外植体的来源影响离体 器官的发生。 本研究证明激素的组合、激素的浓度以及外植体的生态型调控器官再 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 生的频率和种类，该研究结果为理解激素调节植物离体器官发生的机理提 供了基础资料。 关键词：器官再生；激素种类；激素浓度：外植体；遗传背景 2 山东农业大学硕士学位论文 a u x i na n dc y t o k i n i nr e g u l a t eo r g a n r e g e n e r a t i o no f a r a b i d o p s i si nv i t r o m a j o r ：d e v e l o p m e n t a lb i o l o g y s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rx i a ns h e n gz h a n g m a s t e r ：g u ot i n gl i a n g a b s t r a c t nv i t r oo r g a nr e g e n e r a t i o ni si m p o r t a n ti nt h es t u d yo fp l a n td e v e l o p m e n t m a n y f a c t o r si n c l u d i n gh o r m o n ei sc r u c i a lf o rt h eo r g a nr e g e n e r a t i o n nv i t r o h o w e v e r , l i t t l eh a sb e e nd o n et oa n a l y z es y s t e m a t i c a l l yo nt h e s ef a c t o r sy e t i n t h i sp a p e r , ao n e s t e po r g a nr e g e n e r a t i o ns y s t e mw a sc o n s t r u c t e d ，u s i n gt h e r o s e t t el e a v e so fa r a b i d o p s i sa se x p l a n t s w ea n a l y z e dt h ee f f e c t so fs e v e r a l f a c t o r so nt h eo r g a nr e g e n e r a t i o ni nv i t r o s u c ha st h ec o n c e n t r a t i o na n ds p e c i e s o fh o r m o n e s ，t h ee c o t y p e sa n do r g a nr e s o u r c e so fe x p l a n t s w h e t h e rt h ec o n c e n t r a t i o no fa u x i n ，o rt h ec o n c e n t r a t i o no fc y t o k i n i ni s f i x e d ，t h ef r e q u e n c yo ft h eo r g a nr e g e n e r a t i o ni sc o r r e l a t e d w i t ht h e c o n c e n t r a t i o no ft h eo t h e rh o r m o n e ，t h a ti s ，t h ef r e q u e n c yo ft h eo r g a n r e g e n e r a t i o ni n c r e a s e sa tt h er e l a t i v el o w e rc o n c e n t r a t i o n ，h o w e v e r , w h e nt h e c o n c e n t r a t i o nc o n t i n u e dt ob ee n h a n c e d ，t h er e g e n e r a t i o nf r e q u e n c yd e c r e a s e s d r a m a t i d y n a aa r em o r ee f f i c i e n tt or e g e n e r a t eo r g a n st h a n2 ，4 一da n di a a t h er o o t r e g e n e r a t e db yn a a i sb e t t e rt h a nt h eo t h e r s t h ef o r m a t i o no fo r g a n si sm o r e e f f i c i e n to nm e d i u mc o n t a i n i n gz e a t i nt h a n6 - b a i naw o r d ，d i f f e r e n tk i n d so f h o r m o n er e s u l ti nd i f f e r e n to r g a nr e g e n e r a t i o n t h eh i g h e rc y t o k i n i nt oa u x i nr a t i oi se a s yt or e g e n e r a t es h o o t w h e nt h e l o w e rr e g e n e r a t er o o t t h ef r e q u e n c i e so fs h o o tr e g e n e r a t i o nf r o md i f f e r e n t 3 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 e c o t y p e so fa r a b i d o p s i sa r ed i f f e r e m t h es h o o tr e g e n e r a t i o nf r o me x p l a n t so f w s ( w a s s i l e w s k i j a ) e c o t y p ei sm o r ee f f i c i e n tt h a nt h ec o l ( c o l u m b i a ) e c o t y p e d i f f e r e n to r g a nr e s o u r c e si n f l u e n c et h eo r g a nr e g e n e r a t i o n nv i t r o r o o ti se a s i e rf o rt h eo r g a nr e g e n e r a t i o nt h a nr o s e t t l el e a f o u rr e s u l t si n d i c a t et h a tt h eh o r m o n es e r i e s ，h o r m o n ec o n c e n t r a t i o na n d e x p l a n te c o t y p ei n f e c tt h eo r g a nr e g e n e r a t i o nf r e q u e n c y , w h i c hm i g h tb e i n f o r m a t i v ef o rt h er e s e a r c ho f h o r m o n e r e g u l a t e do r g a nr e g e n e r a t i o n nv i t r o k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n a ；h o r m o n e s ；r o o t ；s h o o tr e g e n e r a t i o n ； 4 关于学位论文原创性和使用授权的声明 本人所呈交的学位论文，是在导师指导下，独立进行科学研究所 取得的成果。对在论文研究期间给予指导、帮助和做出重冀贡献的个 人或集体，均在文中明确说明。本声明的法律责任由本人承担。 本人完全了解山东农业大学有关保留和使用学位论文的规定，同 意学校保留和按要求向国家有关部门或机构送交论文纸质本和电子 版，允许论文被查阅和借阅。本人授权山东农业大学可以将本学位论 文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印 或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文，同时授权中国科学技术 信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并向 社会公众提供信息服务。 保密论文在解密后应遵守此规定。 论文作者签名：魁 导师签名：秀蚴 山东农业大学硕士学位论文 1 引言 1 1 植物器官离体再生研究的历史 1 9 7 3 年，t r a nt h a n hv a n ( 1 9 7 3 ) 通过烟草的薄层培养成功地诱导了 花芽的直接再生，t r a nt h a nv a n 通过调节培养基中碳源和激素浓度的变 化，对烟草花梗进行了纵向薄层细胞培养，成功诱导出无序愈伤组织，或是 直接产生花、芽或根( t r a nt h a n hv a n ，1 9 7 3 ) 。由于此种方法重复性好， 因此在之后的很长一段时期里，花芽的直接再生被作为一种离体的实验系 统，广泛应用于生殖生理的研究( t i b u r c i oe t a l ，1 9 8 8 ；李文安等，1 9 8 9 ；章 美云和韩碧文，1 9 9 2 ) 。 2 0 世纪3 0 5 0 年代，诱导根和营养芽的直接再生，在许多植物中获得 了成功。w h i t e ( 1 9 4 3 ) 培养番茄根尖诱导了大量根尖的直接再生。s k o o g 和t s u i ( 1 9 4 8 ) 也诱导了营养芽的直接再生。而利用拟南芥根为外植体在 高浓度生长素的条件下( c a l l u si n d u c em e d i u m ，c l m ) 进行预培养。四天 后，转移到高浓度细胞分裂素的条件下( s h o o t i n d u c e m e d i u m ，s i m ) 继续 培养直至分化出营养芽( 图1 - 1 ) ( v a l v e k e n se ta l ，1 9 8 8 ) 。 j 巴警! ! ! o ，一蚺， 。p e m r o o n t t s s h m tt t t a r a b l d o p s l 8 ； 圈1 - t 曲步法诱导拟南芥苗离体再生模式图 f i gl - ls h o o tr e g e n e r a t i o np r 仳e s s o f a r a b i d o p s i 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 从2 0 世纪7 0 年代初开始，克隆器官的研究进入了克隆花器官的时代。1 9 7 4 年，h i c k s 和m c h u g h e n 在烟草胎座组织的培养中成功地克隆了柱头和心 皮状结构。19 8 4 年，m a t s u z a k ie ta 1 ( 19 8 4 ) 在烟草( n i c o t i a n at a b a c u ml ) 花柱的培养中克隆了大量的花柱。陆文操通过风信子( h y a c i n t h u so r i e n t a l i s l ) ( l ue ta l 。，1 9 8 8 ) 和水仙( n a r c i s s u st a z e t t al ) ( l u ，1 9 9 0 ) 花被的 培养第1 次成功地克隆了花被片、雄蕊和胚珠。1 9 9 2 年，陆文棵( 1 9 9 2 ) 通过小麦( t r i t i c u ms a t i v u ml ) 稃片和颖片的培养首次克隆了小穗。 2 0 世纪9 0 年代，人们相继成功克隆成功了了花序和果实。花序的克隆 分两种情况：一种是通过对苗端的培养，使顶端分生组织直接分化花序。 这在玉米中获得了成( z h o n ge ta 1 ，1 9 9 2 ；李学红和张举仁，1 9 9 9 ) 。另一 种情况是通过诱导外植体形成愈伤组织，然后再诱导愈伤组织直接分化花 序。这在花叶千年木( d r a c a e n af r a g r a n sc v m a s s a n g e a n ah o r t ) 中获得 了成功( 陆文棵，2 0 0 2 ) 。在克隆花序的同时，花序分枝的克隆也成功了 ( 陆文棵，2 0 0 3 ) 。在人参( p a n a xg i n s e n gc a m e y ) 和番茄( l y c o p e r s i c o n e s c u i e n t u mm i l l ) 中成功的克隆出了果实。陆文棵和梁斌( 1 9 9 4 ) 通过番 茄幼子房和幼果的培养获得了大量番茄无籽果实，它们在培养基上可以发 育成熟。 1 2 植物细胞的全能型 植物器官离体再生的基础是细胞的全能性。人们在各种组织：如叶表 皮、叶肉、花粉、胚乳和微管细胞中都已经确定了细胞全能性( h a l p e r i n ， 1 9 8 6 ) 。然而并不是所有的植物细胞都是具有全能性的。尽管卓越的植物 学家如s t e w a r d 认为：“所有的正常的具有双倍染色体的肉体细胞在本质 上都是具有细胞全能性的，不能把他们培养成为完整植物体是因为没有找 到适合他们发育的外界条件。”( s t e w a r de ta 1 ，1 9 7 0 ) 。为了证明这一观点， s t e w a r d 使用了一种极端分化的细胞类型：韧皮部。但是样本却是从次生 韧皮部的组织开始的，并且在形成愈伤组织之前没有隔开单个细胞 ( s t e w a r de ta 1 ，1 9 5 8 ) ，所以无法确定细胞开始的严格身份。目前可以证 明非合子和至少部分分化的细胞的全能性，但是所有细胞的全能性很难证 实。b i n d i n g 的实验室进行了不同组织单个细胞的再生工作，最终提出了 6 山东农业大学硕士学位论文 如下观点：那些处于一定时期的，分化的细胞中，可以形成整个植株的细 胞可能起源于分生组织( b i n d i n g ，1 9 8 6 ) 。 细胞和组织发育年龄对植物细胞全能性有重要作用。例如，早期的细 胞比完全分化的组织细胞的原生质体再生植物体的频率更高( b i n d i n g ， 1 9 7 4 ，1 9 7 5 ) 。在胡萝b 中，s t e w a r d 的韧皮部细胞起源处的微管系统的细 胞容易形成细胞系和体细胞胚，而在相同条件下，外层细胞不能有此表现 ( g u z z o ，e ta 1 ，1 9 9 4 ) 。胡萝b 的子叶有异常的再生能力，即使在没有生长 素的培养基上也可胚胎发生( s m i t ha n dk r i k o r i a n ，1 9 8 9 ) 。因此，不能说 所有的植物细胞都具有全能性，只能讲不同的细胞经历再生的能力不同。 在干细胞池之外存在一定数量的细胞，这些细胞虽然现在处于分化的 状态却很容易进入到多能性阶段。例如：在干细胞不对称分裂之后只经历 几次分裂的细胞在根尖处的干细胞池被破坏后，可迅速恢复干细胞池 ( p r a n t l ，l8 7 4 ) 早期的实验证明：植物界存在多种机制活化或重建干细胞 潜能。然后，这些细胞参与类似形态建成的发育过程。 1 3 植物离体再生的模式 目前对植物离体再生的模式的研究利用了s k o o g 和m i l l e r 的高细胞分 裂素和生长素浓度比的培养基诱导愈伤再生苗的系统。芯片和成像分析表 明，分生组织的特征基因w u s c h e l 和s h o o tm e 砒s t e m l e s s 在诱导的 早期表达( c a r ye ta 1 ，2 0 0 2 ；g o r d o ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。c u c l 和c u c 2 在苗端分 生组织的形成过程中冗余，这个过程出现在形成苗之前( c a r ye ta 1 ，2 0 0 2 ； g o r d o ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。这与c u c 是启动早期的苗端分生组织形成过程中的 上游基因相一致( d a i m o ne ta 1 ，2 0 0 3 ；h i b a r ae ta 1 ，2 0 0 3 ) 。因此，基因在 植物离体再生过程中的表达模式与基因在正常的苗端分生组织形成过程 中的表达模式相同。 c h ee ta 1 ( 2 0 0 7 ) 和g o r d o ne ta 1 ( 2 0 0 7 ) 的研究表明，愈伤组织趋 向于从分生组织细胞和中柱鞘建成细胞发育而来。中柱鞘细胞的分裂在细 胞周期的g 2 期停滞( d u b r o v s k ye ta 1 ，2 0 0 0 ) ，这表明中柱鞘细胞可能表现 出一种半干细胞的特性。这就获得了两个结论：植物分生组织细胞是部分 分化的，但仍处于一个初期的发育阶段；植物的年幼细胞容易恢复到干细 胞阶段。 7 生长豢和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 圈1 - 2 植物的分生组耋 l ( k e n n e t he ta 1 2 0 0 8 ) f i gi - 2p l a n t m c n s t c m s ( k c he ta l ，2 0 0 8 ) 1 4 在离体再生过程中，植物激素的作用 在正常的苗端分生组织的发育过程中，w u s 和c u c 2 在苗端分生组织 中央和外围的区域有很大的非重台区域( 图1 - 2 ) ( s h a n ic ta l 。2 0 0 6 ) 。用 共聚焦显微技术和g f p 标记相结合的实验方法g o r d o ne t a l ( 2 0 0 7 ) 观察到 在从紊乱的愈伤组织形成苗端分生组织的过程中，w u s 和c u c 2 的表达区 域逐渐隔离开来。w u s 和c u c 2 也响应对细胞分裂素和生长素的诱导。在 高细胞分裂素的培养基上可以诱导w u s 的表达，c u c 2 可以响应生长素信 号，高浓度的细胞分裂素处理条件下，c u c 2 和w u s 的表达区域随着激素 空间分布的变化而改变。生长素运输因子p i n l 在苗端分生组织形成的早期 表达，p i n l 能够帮助建立细胞分裂素梯度，这为苗端分生组织再生的早期 需要建立激素区域提供了证据。 x ue ta i ( 2 0 0 6 ) 切除根端分生组织，然后，用分子标记来动态记录 干细胞群的重新形成。在这个实验中，高的生长素浓度与位于干细胞生境 的转录因子s h r 和s c r 的蛋白区域相交叠( s 曲a n n ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。值得注 意的是报告蛋白d r s r e v ：g f p 的移动，它标志了高生长素浓度范围移向 了未来的静止中心。这表明，重建的早期步骤通过重新配置生长素浓度梯 山东农业大学硕士学位论文 度表现出来，与植物体的发育过程相同( s a b a t i n ie ta 1 ，2 0 0 3 ) 。这个研究 表明，生长素运输本身可以解释生长素的高浓度范围和新干细胞池的位置 ( g r i e n e i s e ne ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 1 5 细胞分裂素 1 5 1 细胞分裂素的生物合成 细胞分裂素是一类参与植物生长发育多种过程的激素，例如延缓植物 早衰( g a na n da m a s i n o ，1 9 9 5 ；k i me ta 1 ，2 0 0 6 ) ，根的增殖( w e m e re ta 1 ， 2 0 0 3 ，2 0 0 1 ) ，顶端优势( w e m e re ta 1 ，2 0 0 3 ，2 0 0 1 ) ，营养信号，并且与苗 端分生组织有关( h i g u c h ie ta 1 ，2 0 0 4 ；n i s h i m u r ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 自然条件下存在的细胞分裂素有两种，分别称为类异戊二烯基细胞分 裂素或芳香烃细胞分裂素( m o ka n dm o k ，2 0 0 1 ) 。因为类异戊二烯基细胞 分裂素在高等植物中十分普遍，并且比芳香烃细胞分裂素含量更高一些， 所以对类异戊二烯基细胞分裂素的代谢途径研究更深入一些，而芳香烃细 胞分裂素的生物代谢途径还没有被阐明，尽管这些形式的细胞分裂素在某 些高等植物中也有被发现，例如苔藓和单细胞藻类。 尽管有许多对植物细胞分裂素生物合成酶的研究，可能是由于酶的不 稳定性或者在植物细胞中的含量太少，目前仅有几个被报道( m o ka n d m o k ，2 0 0 1 ) 。然而，对各种生物体中遗传学方面信息的积累和在植物激素 分析方面技术的进步，使研究细胞分裂素新陈代谢和信号传导取得了突破 性进展，并且发现了一种合成有活性的细胞分裂素的经典途径。 9 生长荣和细胞分裂寨调节拟南芥离体器官的再生 圈1 - 3 类异戊二烯基细胞分裂紊生物合成的模型( t o m o ee t a l2 0 0 9 ) f * i - 3 c m m o d e lo f i s o p r e n o i d c kb i o s y n t h e t i cp a t h w a y s ( t o m o ec t m ，2 0 0 9 ) 自然状态下类异戊二烯基细胞分裂素被归类成了四种基本分子类型 中的一种：异戊烯基腺嘌呤( i p ) 、反式玉米素( t z ) 、顺式玉米素( t z ) 、 和二氢玉米素( d z ) ( 图l - 3 ) 。每个细胞分裂素分子通过侧链的差异被区 分开来，也就是在异戊二烯基的侧链和立体异构位置上是否有羟基。尽管 目前还没有关于这些变量的合理解释，在体外实验中，已经发现了它们括 性和稳定性上的不同。通过测量配合基对细胞分裂素受体的吸引力测量了 相关的细胞分裂素的生物活性。对拟南芥细胞分裂素受体( a h k 3a n d a h k 4 w o l c r e l ) 体外和体内的研究表明i p 和t z 比c z 和d z 有更高的吸引 力( i n o u ee ta l ，2 0 0 l ；s u z u k ie ta l ，2 0 0 1 ；y a m a d ae ta l 。2 0 0 1 ) 。在j p 、t z 、 c z 这三种不同结构的细胞分裂素中，t z 是活性最高的，c z 是活性最低的。 另一方面在玉米中发现的一种细胞分裂素受体对c z 和t z 的响应相似。推断 细胞分裂素的相关的活性可能随着物种的不同而不同。针对不同细胞分裂 素的细胞分裂素氧化酶( c k x ) 也不同( b i l y e u e t a l 2 0 0 1 ) 。通常i p 比t z 和c z 易受c k x 的影响，d z 对c k x 有耐受力。 山东农业大学硕士学位论文 异戊二烯基细胞分裂素生物合成的第一步是通过腺苷磷酸盐异戊烯 基转移酶催化含有n 异戊二烯基的腺苷5 磷酸盐( a m p ，a d p0 1 a t p ) 在 二甲( 基) 丙烯二磷酸( d m a p p ) 或1 羟基。2 甲基2 丁烯4 二磷酸 ( h m b d p ) ( f i g 1 ) 。i p t s 已经在高等植物中被鉴定了( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ； s a k a m o t oe ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 在拟南芥和水稻中，已经证明七个i p t 基因( a t i p t l ，a t i p t 3 a t i p t 8 ) ( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ) 和八个i p t 基因( o s l p t l 一o s l p t 8 ) ( s a k a m o t oc ta 1 ， 2 0 0 6 ) 参与到了细胞分裂素生物合成的异戊二烯基转移的过程中。然而， 尽管有一些序列( a t i p t 6a n do s l p t 6 ) 在一些培育植物中看起来像是假基 因。a f l p t s 和o s i p t s 与a m p 相比，更容易将a d p 和a t p 作为异戊二烯基 的受体，利用d m a p p 作为异戊二烯基的前体( k a k i m o t o ，2 0 0 1 ；s a k a m o t oe t a 1 ，2 0 0 6 ) ( 图1 3 ) 。产生异戊烯基腺嘌呤核苷，尤其是利用a t p 和a d p 分 别产生i p r t p 和i p r d p 。 植物中，通过i p t 催化产生的i p 核苷经过羟基化产生t z 核苷。在拟南 芥中，两个细胞色素p 4 5 0 单加氧酶，c y p 7 3 5 a 1 和c y p 7 3 5 a 2 ，催化了这 个反应。c y p 7 3 5 a 1 和c y p 7 3 5 a 2 优先催化i p r m p 和i p r d p 。 通过i p t s 和c y p 7 3 5 a s 催化产生的细胞分裂素核菅并不具有生物活 性，必须将其转变为自由基形式。在水稻中分离出了一种称为l o g 的细胞 分裂素激活酶( k u r a k a w ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。它具有磷酸核糖水解酶 ( p h o s p h o r i b o h y d r o l a s e ) 的活性，可直接将i p r m p 和t z r m p 转变为自由碱 基形式的细胞分裂素i p 和t z ( k u r a k a w ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。但是二磷酸盐和三磷 酸盐不能作为底物( k u r a k a w ae ta 1 ，2 0 0 7 ) 。i p 王泓p 和t z r m p 的k m 分别为 1 1 7 和2 2 0i m ( k u r a k a w ae ta 1 2 0 0 7 ) 。 1 5 2 细胞分裂素的信号传导 在拟南芥中，目前发现有3 个组氨酸激酶是细胞分裂素的受体，分别为 a h k 2 、a h k 3 和c y t o k i n i nr e s p o n s e1 ( c r e l ) ( 又名a h k 4 和 w o o d e nl e g ；w o l ) 。( i n o u ee ta 1 ，2 0 0 1 ；m i i h 6 n e ne ta 1 ，2 0 0 0 ；s u z u k i e ta 1 ，2 0 0 1 ；u e g u c h ie ta 1 ，2 0 0 1 ；y a m a d ae ta 1 ，2 0 0 1 ) 。3 个受体的胞外区均 具有保守的c h a s e 结构域，被认为是细胞分裂素的结合区( a n a n t h a r a m a n 1 l 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 a n da r a v i n d ，2 0 0 1 ) 。功能冗余的a h k 2 、a h k 3 和c r e l 在细胞分裂素信 号转导途径上起正调控的作用( h i g u c h ie ta 1 ，2 0 0 4 ；n i s h i m u r ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 在拟南芥中存在着5 们御基因( 彳御j 到彳月：阿) ，它们编码了一类约 1 5 0 个氨基酸的蛋白，并含有保守的组氨酸磷酸转移结构域。a h p s 被确定为 有功能的组氨酸磷酸转运蛋白。a h p s 本身的表达不受细胞分裂素诱导 ( i m a m u r ae ta 1 ，1 9 9 9 ；m a h o n e ne ta 1 ，2 0 0 6 a ) 。在原生质体瞬时表达系统 中，细胞分裂素处理导致a h p s 由胞质转移至细胞核内，推测a h p s 将磷酸 基团由膜上的受体最终转移至细胞核内的a r r s 上( h w a n ga n ds h e e n ， 2 0 0 1 ) 。 拟南芥基因组中共发现了二十多个反应调节因子，其共同的特点是含 有一个可接收磷酸基团的保守的信号接收区。根据它们的同源性、结构及 自身表达是否受细胞分裂素诱导，反应调节因子可以大致分为4 类：a 型 a r r 、b 型a r r 以及c 型a r r s 和a r a b i d o p s i sp s e u d o r e s p o n s er e g u l a t o r s ( a p r r s ) ( d a g o s t i n o e ta 1 ，2 0 0 0 ；m a s o ne ta 1 ，2 0 0 4s c h a l l e re ta 1 ，2 0 0 7 ) 。 a 型a r r 包括1 0 个成员，是由一个信号接收区和各一小段的n 末端和c 末 端构成的。它们的表达受外源细胞分裂素的诱导迅速升高，被认为是细胞 分裂素的初级反应基因( p r i m a r y r e s p o n s i v eg e n e ) ，并常被作为细胞分裂素 信号途径上特异的标记基因使用。在体外实验中，a 型a r r 可以从a h p s 获 得磷酸基团，因而被确认参与了双元组分信号转导过程( 图1 4 ) 。b 型a r r 包括1 1 个成员，它们除了具有一个保守的信号接收区外，在c 末端还含有 一个d n a 结合区和一个转录激活区。其d n a 结构域为典型的m y b 类转 录因子结构。与a j 型a r r 不同，b 型么尺r 的转录不受细胞分裂素的诱导。b 型a r r 作为转录因子，其活性受细胞分裂素激活后，直接调控a 幽r r 基 因的表达。c 型a r r 的结构类似于a j 型4 r r ，含有一个信号接收区，但其序 列与a 型a r r 同源性很低，且它们的表达不受细胞分裂素诱导。c 型a r r 可能作为负调控因子参与到细胞分裂素的信号转导途径中a p r r s 缺乏 a s p 磷酸化位点，它们的某些成员在调控昼夜节律方面具有一定作用 ( m c c l u n g ，2 0 0 6 ) 。 1 2 山东农业大学硕士学位论文 1 懿、 4 宠、网 甲l 星j 。! 穗破9 剧 姿娑i 迭 辫黧| 童”一一 图1 0 细胞分裂紊信号转导模式( j e n n i f e re ta 1 2 0 0 8 ) f i g1 4 m o d e lo f c y t o k i n i ns i g n a l i n g ( j e n n i f e rc ta l ，2 0 0 8 ) 1 5 3 细胞分裂素的运输 根部分生组织( 根尖) 合成细胞分裂素最活跃，通过木质部的长距离 运输从根到茎。目前已知有两类转运蛋白具各主动运输细胞分裂素的能 力，分别是嘌呤透过酶和核苷转运蛋白。 拟南芥的嘌呤透过酶a t p u p l 和a t p u p 2 定位在细胞质膜上，介导细胞 分裂素向胞内的主动运输( b u r l d ee ta l ，2 0 0 3 ) 。它们选择性地吸收反式玉 米素、顺式玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素和6 b a 等自由碱基形式的 细胞分裂素以及核苷形式的细胞分裂素。这两个基因具有从根部( 通常认 为是细胞分裂素的主要合成部位) 吸收细胞分裂素的能力。 人们认为在植物体内细胞分裂素主要以核苷形式进行运输。高等植物 中，核苷转运蛋白( e n t ) 家族的部分成员能够选择性运输细胞分裂素核 苷。水稻基因组含有4 个核苷转运蛋白基因( o s e n t l o s e n t 4 ) 。其中 o s e n t 2 在水稻萌发着的种子的盾片和幼苗的维管组织中表达。在维管组 织中o s e n t 2 部分地参与对细胞分裂素核苷的选择性运输( h i r o s ee ta 1 ， 2 0 0 5 ) 。分子生物学和遗传学的研究表明s 0 1 3 3 编码核苷转运蛋白a t e n t 8 。 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 研究结果提示s o l 3 3 a t e n t 8 和a t e n t 3 参与细胞分裂素核苷的转运。 1 6 生长素 1 6 1 生长素的生物合成 生长素在组织中的分布反映出生长素浓度在单个细胞和相邻细胞之 间的不同。可以在多种水平上控制细胞中生长素的浓度，例如，生物合成、 结合、分解和细胞间的运输。明显的，多种途径对生长素在不同范围、不 同植物物种、不同发育阶段的生长素产生是冗余的。 目前对这些过程的研究还十分薄弱，但是，生长素的生物合成途径已 经建立起来了。迄今为止，合成m a 的一个不依赖于色氨酸的途径和四个 依赖于色氨酸的途径已经建立起来了。它们的共同点是有一个中间体。它 们是吲哚3 乙酰胺途径( i a m ) 、吲哚3 乙醛肟途径( i a o x ) 、色胺途径 ( 砌) 和吲哚3 丙酮酸途径( i p a ) ( w o o d w a r da n db a r t e l 2 0 0 5 ) 。由 于一些主要的酶的身份不明，并且存在一种广泛的冗余现象，这些途径的 重要性很难评估。迄今为止，只认识到t a m 和i p a 途径对植物发育是重要 的。 t a m 途径的限制因素是类黄素单加氧酶和y u c c a 家族( z h a oe ta 1 ， 2 0 0 1 ) 。它们将色氨酸派生物和t a m 转换成为n 羟基色胺( z h a oe ta 1 ， 2 0 0 1 ) ，i a o x 的一个前体可以在后来被应用于i a a 的生物合成。y u c c a 多基因的突变引起了生长素局部的积累在某一部位，这引起了植物体发育 上的缺陷( c h e n ge ta 1 ，2 0 0 6 ，2 0 0 7 ) 。y u c c a 调节局部的生长素的生物合 成在植物的多个发育阶段帮助了生长素梯度的建立。 关于i p a 途径在植物中的作用，已经鉴定了一个编码转氨酶的基因家 族，它刺激t r p 的转氨基作用形成i p a ( 拟南芥的色氨酸转氨酶，t a a ) 。 在n 诅基因的突变体中，i a a 的水平是下降的。 ( t a oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 。尤为 重要的是，这些突变体削弱了生长素的分布，这与重力、胚胎发生、微管 组织的分化有关( s t e p a n o v ae ta 1 ，2 0 0 8 ) 。在y u c c a 和n 执依赖途径中一 些突变体的的表型相似，这使得检查t a m 和i p a 途径在生长素合成的过程 中是独立的还是部分的重叠显得尤为重要。而不同的信号，例如光的质量 1 4 山东农业大学硕士学位论文 ( t a oe ta 1 ，2 0 0 8 ) 、植物激素乙烯( s t e p a n o v ae ta 1 ，2 0 0 8 ) 调节t a a 的转 录，与生长素的分布和相关的发育有关。 总之，局部生长素生物合成在对生长素分布方面具有重要作用。然而， 这不能说明生长素是细胞间的调整信号。在这种情况下，可能需要另一种 细胞间的信号来规定生长素生物合成的时间。另一方面，细胞间的运输在 理论上可以调节组织的发育，生长素的局部的积累也依赖于生长素在相邻 细胞间的运输活性。 1 6 2 生长素的运输 生长素不同于其它植物信号分子的一个重要方面是它沿着一个方向 在细胞间的运输。用药剂抑制生长素转运的早期实验证明这个过程对生长 素调节植物生理和植物发育是至关重要的。尽管药剂抑制生长素转运的机 制还是不清楚的( d h o n u k s h ee ta 1 ，2 0 0 8 a ) ，这些混合物对生长素转运和 其机制的研究是十分重要的。 在植物中，改变生长素位置的两个明显的途径：一个是从植株上生长 素生物合成活性高的幼嫩的组织到目的组织。这种无极性生长素的分布是 生长素通过成熟的韧皮部在植株中分布，并且运输到目的组织。另一种主 要是通过生长素的短途运输完成生长素的分布。生长素在细胞间的运输依 赖于特殊的输入和输出蛋白。这种类型生长素运输的一个主要特征是在特 定组织中的方向性是固定的。人们利用生物化学和生理学上的一些数据建 立了化学渗透假说( 图1 5 ) ( r u b e r ya n ds h e l d r a k e ，1 9 7 4 ；r a v e n1 9 7 5 ) 。它 提出生长素对细胞非原生质体和细胞质亲脂性的不同是生长素在细胞质 中积累的基础。因为生长素是弱酸性的( p k a ：4 7 5 ) ，一部分( 1 5 ) 生 长素在非原生质体( p h5 5 ) 的弱酸性环境中质子化了。因此，生长素能 在膜上分布。一旦在细胞质中的生长素去质子化，那么生长素就很难渗透 进质膜中，这时，生长素就被“囚禁”在细胞中了。这种扩散机制需要特异 的运输载体。化学渗透假说预示：运输载体局部化的固定在细胞的一端， 所以，生长素在细胞间向着一个方向运输。 最近的遗传学的研究证明了非原生质体和细胞质的p h 值在生长素运 输中的作用。在缺乏h + 焦磷酸脂a v p l 的拟南芥突变体中，非原生质体的 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 酸度下降了，这与生长素极性运输的减弱有关( l ie ta 1 ，2 0 0 5 ) 。在另一方 面，a v p i 的过量表达使得非原生质体酸性加强，并且导致了生长素极性 运输的增加。 生长素流入的载体也通过分子生物学的手段被鉴定了出来了。突变体 a u x i n l ( a u x l ) 最初在根中被发现( p i c k e t te ta 1 ，1 9 9 0 ) 。a u x i n l 突变体对 膜不渗透性生长素有很强的抵抗力。表明a u x i n l 突变体干涉了生长素的运 输。a u x l 编码了一个类氨基酸透过性蛋白( b e n n e t te ta 1 ，1 9 9 6 ) ，它是一 个h + i a a _ 同向转移因子( y a n ge ta 1 ，2 0 0 6 ) 。总之，拟南芥的基因组编码 四个高度结合生长素的流入运输因子( a u x i l a x ) ( s w a m pe ta 1 ，2 0 0 8 ) ， 并且它们在重力、向光性、侧根间距、叶序模式、侧根发生、根毛发育方 面有作用( b e n n e t te ta 1 ，19 9 6 ；s t o n ee ta 1 ，2 0 0 8 ；b a i n b r i d g ee ta 1 ，2 0 0 8 ； s w a m p e ta 1 ，2 0 0 8 ；j o n e se ta 1 ，2 0 0 9 ) 。 1 6 山东农业大学硕士学位论文 囤1 - 5 生长豪极性运输的化学淳透假说( s t e f l l c ne ta l2 0 0 9 ) f i gi 。5 c h c m i o s m o t i c h y p o t h e s i s f o r p o i a u x i n t r a n s p o r t ( s t e f f e ne ta 1 2 0 0 9 ) 另一种生长素运输的重要组分是a b c b 转运家族的p 糖蛋白 ( a b c b p g p ) 。这一类a t p 结合类转运因子被鉴定出与生长素运输抑制 因子n p a 有相互作用( m u r p h y e ta 1 2 0 0 2 ) 。a b c b i p g p i a b c b 4 p g p 4 和a b c b l 9 p g p l 9 调节生长素的流出( c h oe t a l ，2 0 0 7 ) 。生长素运输抑制 子n p a 和类黄酮，通过破坏与t w d l 的相互作用，直接对a b c b 的活性起 作用( b a i l l ye ta l ，2 0 0 8 ) 。在生长素的流出过程中，a b c b s 的活动与生长 素流出的运输蛋白p i n 的活动一致( b l a k e s l e ee ta 1 2 0 0 7 ；m r a v e ce ta 1 生长素和细胞分裂素调节拟南芥离体器官的再生 2 0 0 8 ) 。p i n l 是p i n 蛋白家族的中的重要基因，它失去作用后，将导致针 状花序的产生，它是生长素缺陷运输的标记。其它的p i n 突变体也在生长 素相关的过程中表现出典型的缺陷，例如，向性、胚胎发育、根端分生组 织的模式、器官发生和脉管组织的分化( f f i m le ta 1 ，2 0 0 3 ；b e n