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溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 摘要 右旋糖酐是一种典型的糖类药物，目前在临床上己有广泛的应用。但 是，传统的乙醇分级沉淀方法难以对右旋糖酐的分子量分布范围进行严格 的控制，右旋糖酐制剂的质量问题及其临床上的副作用极大的影响了右旋 糖酐的研究和应用。 本文在综述了右旋糖酐现有分离纯化技术的基础上，探索研究溶析结 晶辅助膜分离技术( s o l v e n to u tc r y s t a l l i z a t i o na s s i s t e dm e m b r a n e s e p a r a t i o n - - s o c m s ) 纯化药用右旋糖酐的新方法。 主要研究内容及结论如下： 1 确定了h p g p c 测定右旋糖酐分子量及其分布的色谱条件。 2 通过均匀试验设计，采用u 1 6 串( 1 6 1 2 ) 均匀设计表格安排实验，考察 了多个因素对溶析结晶工艺的影响。 3 通过考察不同截留分子量( m w c o ) 超滤膜对右旋糖酐纯化效果 的研究，确定采用m w c o3 0 k d 、m w c o5 k d 伪中空纤维膜组件对右旋 糖酐样品进行分级纯化。 4 通过单因素试验，确定了超滤膜分离工艺的最佳工艺条件。 5 采用多级多段式超滤膜串联工艺与反渗透工艺的有效集成，对膜分 离工艺进行了优化。 此外研究了有机溶剂添加对膜分离纯化右旋糖酐效果的影响，发现乙 醇的添加对纯化效果有明显影响，但是具体规律性和原理有待进一步探讨 6 膜清洗条件的确定 7 用紫外光谱对产物进行了纯度鉴定，结果表明纯化产物不含蛋白质、 l 核酸和小分子色素等杂质；红外光谱对其结构进行了初步分析，表明该多 糖是a d 型糖苷键构型，与文献中所报道的右旋糖酐为同一类物质；采用 差示量热扫描仪( d s c ) 对产物的热力学性质进行了初步研究，证明了经过纯 化后的右旋糖酐样品在分子量组成上更接近一致。 关键词：右旋糖酐溶析结晶超滤反渗透纯化凝胶渗透色谱分子量 d 值 s t u d i e so np u r i f i c a t i o no fc l i n i cd e x t r a nw i t h s o l v e n to u tc r y s 眦l i z a t i o na s s i s t e d m e m b r a n es e p ara t i o nt e c h n o l o g y d e x t r a ni sab a c t e r i a lp o l y s a c c h a r i d ep r o d u c e df r o ms u c r o s ea n d u s u a l l yu s e df o rc l i n i c a lt r e a t m e n ta so n ek i n do fp o l y s a c c h a r i d ed r u g s a t r a d i t i o n a ls e p a r a t i n gm e t h o dw i t he t h a n o lw a sh a r d l yt oc o n t r o ls t r i c t l y f o rt h em o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o no fd e x t r a n s o m eq u a l i 够p r o b l e m s a n dc l i n i c a ls i d ee f f e c t si n d u c e db yt h ed i s p r o p o r t i o no fm o l e c u l a rw e i g h t , h a db e c o m et h eb o t t l e n e c ko fs t u d ya n da p p l i c a t i o no fd e x t r a n i nt h i s s t u d y ，s o l v e n t o u tc r y s t a l l i z a t i o na s s i s t e dm e m b r a n e s e p a r a t i o n ( s o c m s ) i san e ws e p a r a t i o nm e t h o dp r o p o s e df o rt h e p u r i f i c a t i o no fd e x t r a n i t sp u r p o s ei st os e p a r a t ed e x t r a na n dc o n t r o li t s m o l e c u l a rd i s t r i b u t i o n ，a n dp r e p a r ed e x t r a nw i t hh i g hp u r i t ya tt h es a m e t i m e p r i m a r yr e s e a r c hs u b j e c t sa n dc o n c l u s i o n sw e r es u m m a r i z e da sf o l l o w ： 1 c h r o m a t o g r a mc o n d i t i o n st o m e a s u r et h em o l e c u l a rw e i g h to f d e x t r a nw e r ed e t e r m i n e d 2 b yu s i n gu n i f o r me x p e r i m e n t sd e s i g n ，s e v e r a lf a c t o r st h a ti n f l u e n c e d t h es o l v e n to u tc r y s t a l l i z a t i o nw e r ei n v e s t i g a t e d 3 t h r o u g ha n a l y z i n gp u r i f i c a t i o ne f f e c t so fu l t r a f i l t r a t i o nm e m b r a n e s w i t hd i f f e r e n tm o l e c u l a rw e i g h tc u t o f f ，i ts h o w e dt h a tm e m b r a n e so f3 0 k d a n d5 k dw e r eh e l p f u lt ot h ep u r i f i c a t i o no fd e x t r a n 4 t h ed e t e r m i n a t i o no fm e m b r a n es e p a r a t i o n p a r a m e t e r s w a s e s t a b l i s h e db ys i n g l ei h c t o re x p e r i m e n t 5 b yc o n n e c t i o no fu l t r a f i l t r a t i o na n dr e v e r s eo s m o s i s ，p u r i f i c a t i o n p r o c e s sw a so p t i m i z e d 6 c l e a n i gc o n d i t i o no f m e m b r a n e sw e r ed e t e r m i n e d 7 t h ep u r i t yo ft h ep u r i f i e ds a m p l es a m p l e sw a si d e n t i f e db yt h e u l t r a v i o l e ts p e c t r u m t h er e s u l ts h o w e dt h a tt h e r ew e r en op r o t e i n ，n u c l e i c a c i d ，p i g m e n ta n dm a n n o s ew i t h i nt h e m p r e l i m i n a r y s t u d i e so nt h e s t r u c t u r eo fp u r i f i e ds a m p l e sb yt h ei n f r a r e ds p e c t r u mi l l u m i n a t e dt h a t p u r i f i e ds a m p l e sw e r et h es a m em a t e r i a lw i t ht h ed e x t r a n a n a l y s i so n t h e r m o d y n a m i cp r o p e r t i e sb yd s cs h o w e dt h a tp u r i f i e ds a m p l e sw e r e m u c hm o r es i m i l a ri nc o m p o s i t i o n k e yw o r d s ：d e x t r a n ；s o l v e n to u tc r y s t a l l i z a t i o n ；u l t r a f i l t r a t i o n ； r e v e r s e o s m o s i s ；p u r i f i c a t i o n ；h i g h p e r f o r m a n c eg e lp e r m e a t i o n c h r o m a t o g r a p h y ；m o l e c u l a rw e i g h t ；d v a l u e i v 广西大学学位论文原创性声明和学位论文使用授权说明 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下完成的，研究工作所取得的成果和相 关知识产权属广西大学所有。除已注明部分外，论文中不包含其他人已经发表过的研究 成果，也不包含本人为获得其它学位而使用过的内容。对本文的研究工作提供过重要帮 助的个人和集体，均已在论文中明确说明并致谢。 论文作者签名：，7 面净 9 壮6 月， 日 学位论文使用授权说明 本人完全了解广西大学关于收集、保存、使用学位论文的规定，即： 本人保证不以其它单位为第一署名单位发表或使用本论文的研究内容； 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本； 学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并提供目录检索与阅览服务； 学校可以采用影印、缩印、数字化或其它复制手段保存论文； 在不以赢利为目的的前提下，学校可以公布论文的部分或全部内容。 请选择发布时间： 囹即时发布口解密后发布 。一。 ， 。 ， ( 保密论文需注明，并在解密后遵守此规定) 论文作者签名：t f 而译陟导师签名： 州洲年二月毛日 溶析结晶辅助用分离技术纯化药用右旋糖酐的研3 ；巴 第一章绪论 多糖类化合物是自然界含量最多的有机化合物，人们对多糖的认识首先是把它看作 食物中的能量来源和动植物骨架结构的组成成分。随着分子生物学和细胞生物学的发 展，人们发现多糖在生物体中不仅是作为能量来源或结构材料，更重要的是参予了生命 科学中细胞的各种活动，具有多种多样的生物学功能，从而引起分子生物学家的普遍关 注【蚴。 同时，随着分离纯化技术的不断进步和生物高分子研究新手段、新方法在多糖类研 究上应用，国内外对多糖及糖复合物的研究进入了空前迅速的发展阶段，糖生物学i 卅 ( g l y c o b i o l o g y ) 正成为生命科学研究中又一个新的前沿和热点。 “糖生物学”以生物大分 子的组成部分糖链为研究对象，主要包括糖链的结构和功能两个方面的内容。研究对象 包括高等植物、真菌、地衣、细菌、动物等。研究范围涉及多糖的分离纯化、结构分析、 理化性质、免疫学、药理学以及临床应用等，其中对免疫增强作用机理的研究已深入到 了分子和受体水平。糖链结构与功能的阐明将是后基因组时代生命科学研究的核心内容 之一，对人类健康的维护和疾病的防治将产生深远影响。 在多糖类聚合物的研究中由于其结构本身的复杂性【5 1 ，因分离纯化技术限制而导致 的产品纯度低，药理不明确以及生产成本过高等问题日益显著。多糖类化合物分离纯化 技术的相对落后，已经成为制约糖类聚合物药理作用研究和产品研发工作的巨大障碍【6 j 。 因此；无论从糖类聚合物的分析或应用研究，还是从实际生产角度考虑，分离纯化均品 生物医药工程领域值得注意的关键问题1 7 】。 广西作为我国最大的蔗糖生产基地，由蔗糖及副产物经生物或化学途径制备糖类聚 合物已成为广西蔗糖产业链的重要一环，如生产黄原胶，低聚糖等。其中右旋糖酐由于 具备生物活性强，结构稳定，分子量能根据不同用途和需要确定，范围可从1 0 0 0 到上 千万，能与多种物质结合，生成高效、低毒的药物【聃】等多种优越性，成为研究和开发 的热点。 但是，由于右旋糖酐原料液的粘度大、分子量分布广、结构( 链长和支链) 有差异等， 造成制剂生产困难且质量不稳定。因此，有必要研究右旋糖酐分离纯化的新方法和新工 艺，以从根本上解决右旋糖酐制剂生产上的质量问题【1 m 1 羽。 广西大拳硕士掌位论文溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 超滤工艺的应用，是分离纯化技术的革新，在蛋白质的分级纯化领域应用已相当成 熟，但由于右旋糖酐分子的特殊性，即在水溶液中分子链呈现多种形态如链状、无规线 团、缔合态等1 1 3 】，单纯使用膜分离技术远不能满足制备高纯度产品的要求，因此有必要 将膜分离工艺与其他纯化方法进行集成，优化传统的膜分离工艺，强化对多糖进行分子 量分级的效果。 1 1 多糖的生物活性与其结构的关系 多糖是由多个相同或不相同的单糖基以糖苷键相连而形成的高聚物，一级结构常因 单糖基的构型( l 或d ) 、异头物的构型( a 或b ) 、糖基环化方式( 五元环或六元环) 、有无 分支、糖基上多个羟基是否被取代( 如氨基、硫酸基、磷酸等取代) 、相邻单糖基相连糖 苷键的位置( 1 - 2 ，1 - 3 ，1 - 4 ，) 等的不同而不同。多糖的二级结构通常是指多糖骨架 的形状，亦即多糖骨架链内以氢键结合所形成的各种聚合体。例如纤维素分子是锯齿形 带状，直链淀粉是空心螺旋状。二级结构一般只关系到多糖分子的主链构象，不涉及侧 链的空间排布。在二级结构的基础上进一步卷曲或折选，或者是两链以双螺旋排列而形 成的特定构象是多糖的三级结构。多糖的四级结构是相同或不同多糖链的协同结合，也 即亚单位构象【1 4 1 。 晷垂羹 “包含络合物i 伯) 取我藏互成囊麓i o 套遗。 图1 - 1 多糖的高级结构 f i g 1 1a d v a n c e ds t r u c t u r eo fp o l y s a c c h a r i d e 多糖的药理活性与其结构有着密切的关系，与多糖的分子量、溶解度、粘度、初级 结构和高级结构都有关。一般来讲，具有b 螺旋型立体结构的多糖其活性较高。例如， b ( 1 3 ) d 葡聚糖的活性比a ( 1 3 ) d 葡聚糖的活性要高得多；多糖的水溶性提高，其药理 活性亦相应提高，如不溶于水的b ( 1 3 ) d 葡聚糖经过部分羧甲基化后，水溶性提高，其 抗肿瘤的能力也相应提高；分子量过大或过小，多糖活性都不高，一般中等分子量的多 糖活性最高；此外，多糖中乙酰基的数量和位置对多糖的活性影响也很大；有毒性的多 2 篓似 广西大掣巧甄士掌位论文 溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 糖经过结构修饰后，毒性会降低或消失，如从酵母中得到的甘露聚糖，具有活性，但毒 性很大，若经o 羧甲基化后，毒性降低，而其活性仍然保斟1 5 6 1 。 1 2 分离纯化技术的进步与糖生物学的发展 1 2 1 多糖类物质纯化的技术难点 近年来，多糖类物质因其独特的功能和很低的毒性，已在抗肿瘤药、抗病毒药、抗 衰老药等多个方面得到开发和应用【n 1 8 1 。但是由于多糖结构的复杂性，结构与功能关系 的机理研究尚未形成深入而完整的理论体系。与蛋白质和核酸相比，多糖的结构测定包 括化学结构和立体结构的分析被认为是最难解决的，主要是高纯度多糖样品的制备是十 分困难的。因此研究和开发先进的分离技术对推动多糖生物活性的深入研究与实际应用 有重要意义【1 9 。2 1 1 。 多糖分离纯化较为困难，因而绝大多数工艺技术水平较其它工业结晶方法( 如冷却结 晶、蒸发结晶等) 落后，基本上是凭经验操作。此外，该方法由于要多次使用大量的化 学试剂所造成的运行成本过高也制约了该技术的广泛应用。溶析结晶的缺点是溶剂耗用 量大，所得晶体粒度小，杂质含量仍较高，难以达到纯度及晶形要求。 有学者根据在水和乙醇中溶解度的不同，将糖类物质分为6 类【捌： ( 1 ) 易溶于冷水和温乙醇类：包括各种单糖、双糖、三糖和多元醇类； ( 2 ) 易溶于冷水而不溶于乙醇类：包括果胶和树胶类物质，因为它们一般以钙、镁、盐 形式存在； ( 3 ) 易溶于温水、难溶于冷水、不溶于乙醇类；主要是粘液质的糖类，如木聚糖、葡 聚糖、糖淀粉、糖原等； ( 4 ) 难溶于冷水和热水，可溶于稀碱类：包括水不溶胶类、半纤维素、半乳聚糖、甘 露糖等； ( 5 ) 不溶于水和乙醇、部分溶于碱液类：主要包括氧化纤维素类物质，可溶于c u ( o h ) 2 溶液； ( 6 ) 以上溶剂均不溶类：如纤维素等。 通过以上的分类就知道目前多糖分离纯化中常用“水溶醇提”法的内在原因。但是， 经水溶醇提法处理所获得的产物纯度偏低，仍无法满足实际应用的要求，必须进一步精 制。以现有的技术手段可以得到纯度较高的多糖类物质，但想较大规模的生产出高品质 3 溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋囊瞪f 的研究 的多糖类物质，即实现工业化难度仍然很大【2 3 1 。主要原因是：原料体内的多糖含量较低， 提取需要耗用大量化学试剂；多糖粗品中的成分复杂且其所含的杂质与多糖的理化性质 相近，即使是同一种组成的多糖，也会因为组成糖链的单糖数目差异，造成分子量不均 一；多糖本身化学性质不够稳定，遇热易变性、遇酸易降解，使得分离与浓缩条件较为 苛刻；传统分离提纯过程的连续性较差，整个处理流程过长，有可能因此而增大活性物 质的损耗。 1 2 2 多糖类物质分离纯化的一般方法 目前多糖的提取，大多采用不同温度的水、稀碱溶液提取。但是水提取时间长且效 率低，酸碱提取易破坏多糖的立体结构及活性，现在有时采用酶法提取多糖，即采用复 合酶热水浸提相结合的方法，此法具有条件温和、杂质易除和提取率高等优点。 多糖提取之后，其中还有许多杂质要除去，一般首先利用多糖难溶于有机溶剂的特 性，用乙醇或丙酮进行反复沉淀洗涤，除去一部分醇溶性杂质，然后用s e v a g e 法，或 三氟三氯乙烷法( 微生物多糖) ，或三氯醋酸法( 植物多糖) ，脱游离蛋白质。小分子杂质 的去除可以用透析法【2 4 1 。 采用这些方法得到的多糖产品，分子量分布范围很广，并且多糖分子的多级结构与 其分子量又有着直接的关系，为了从复合多糖中得到不同活性部分，将多糖进行分子量 分级就显得至关重要，对多糖进行分子量分级已成为多糖类纯化的重要研究方向。 1 2 3 多糖分子量控制的方法 多糖是典型的高聚物，其分子量及其分布是多糖纯度的重要表征指标。由于高聚物 的分子量具有多分散性的特点，即分子量大小不一、参差不齐，因此采用现有方法测得 的高聚物的分子量，一般为平均分子量。 常用的平均分子量的表示方法有数均分子量( n u m b e r - a v e r a g em o l e c u l a r w e i g h t - m n ) ，_。_一 和重均分子量( w e i g h t a v e r a g em o l e c u l a rw e i g h t m w ) 。 m n 是按聚合物中含有的分子数目统计平均的分子量，等于高分子样品中所有分子 的总重量除以其分子( 摩尔) 总数；m w 是按照聚合物的重量进行统计平均的分子量，其 值等于每种分子的分子量乘以其重量分数的总和1 2 5 伽。 4 广西大曹臼炙士掌位恢譬溶析结晶辅助膜分离技术蚓洱 ：药用右菔秘瞪于的研究 一e n 小4 i m 一 - 。 m n 一- - 一- 豫 言； 一讹2 心鸩 心m ( 注：式中，w i ，n i ，m i 分别为i 一聚合物的重量、分子数、分子量，i - - 1 - 8 ) 单独一种平均分子量不足以表征聚合物的性能，还需要了解分子量多分散性的程 度，以分子量分布指数d 来表示，即重均分子量与数均分子量的比值而一m n 【2 7 1 。 表1 - 1d 值与分子量分布情况的关系 t a b l e1 - 1t h er e l a t i o n s h i pb e t w e e ndv a l u ea n dm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t i o n d 分子量分布情况 1 接近1 ( 1 5 - 2 ) 远离1 ( 2 0 - 5 0 ) 均一分布 分布较窄 分布较宽 为了得到具有较高分散度的多糖产品，需要进一步对多糖的分子量进行分级，以制 备出符合分子量分布要求的多糖类产品1 2 8 1 。 有机溶剂分级沉淀是对分子量进行分级的常规方法，但是存在有机溶剂用量大，产 品分子量分布宽等缺点。为了获得纯度更高的多糖产品，还需经过区域电泳等进行纯化， 或采用d e a e 纤维素、d e a 蝴胶及其他凝胶柱层析法进行纯化，国外已有采用l k b 柱层析系统对多糖的分子量分布进行控制。这些纯化方法得到的多糖纯度较高，但过程 较为繁琐，且都存在着上样量小，设备昂贵的局限性，因此难于工业化应用。目前，主 要集中在实验室分离纯化多糖的研究中。此外，利用专一性的酶对多糖产物进行降解， 或利用物理场处理多糖化合物，使糖苷键按照一定的规律进行断裂，也是近年来研究的 热点【2 冽。 膜分离技术作为新的分离净化和浓缩技术不仅具有常温操作、无相态变化，可以防 止杂菌污染和热敏性物质失活等特点，而且有多种规格和材质的膜组件可供选择，可以 5 溶析结晶辅助膜分离参旧纯化药用右旋糖酐的研究 获得不同分子量段的分级产物，比上述方法更适于工业化生产。 1 3 右旋糖酐的特性及其分离纯化 1 3 1 右旋糖酐的结构和性质 右旋糖酐又称葡聚糖，是蔗糖经肠膜状明串珠菌( l e u c o n o s t o cm e s e n t e r o i d e s ) 产生的 右旋糖酐蔗糖酶( d e x t r a n s u c r a s ee c2 4 1 5 ) 催化后生成的高分子葡萄糖聚合物。最 早是p a s t e u r ( 1 8 6 1 ) 发现了在葡萄酒的制造过程中产生该类粘稠物质，s c h e i b l e r l 3 0 l ( 1 8 6 9 ) 认为它类似于淀粉和糊精类的物质，故命名为多缩葡萄糖即右旋糖酐。详细研究右旋糖酐 是从1 9 3 0 年开始的，并作为代血浆而确立了它的应用地位。 自然界中右旋糖酐广泛存在于微生物及微生物所分泌的粘液中，是构成细胞壁的重 要组成部分，是典型的多糖类物质之一，分子式为( c z o h x 0 0 5 _ ) n 。右旋糖酐主要由d - 吡喃 式葡聚糖以a 1 ，6 键相连接，成一线形长分子链，也有支链点以a 1 ，2 、a - 1 ，3 及a 一1 ，4 键 相连接。随着微生物种类及生长条件的不同，右旋糖酐的分子结构有差异【3 2 1 。 1 3 2 右旋糖酐的功能及应用 图1 2 右旋糖酐a 1 , 3 分支结构式 f i g 1 - 2 d e x t r a no fa - 1 ，3b r a n c hs t r u c t u r e 由于右旋糖酐具有高亲水、无抗原、无凝血效应，粘度和渗透压与血液相近，能在 体内被降解但又可以维持一定的时间，因而是世界上公认的一种优良的血浆代用品【1 2 1 。 此外，不同分子量的右旋糖酐具有不同的临床应用和疗效【3 3 。3 7 】。例如在临床中右旋 6 f - 西大掌硕士学位美 二溶析结晶辅助7 m l t - ：分 离参p k 纯化药用右旋糖酐的研究 糖酐7 0 常用作弹性蛋白酶、尿激酶、s o d ，胰岛素等的稳定剂或用作滴眼液和肠道疾病 用药，美国和瑞典等国己在这方面进行了大量的临床应用；在肝脏移殖手术中右旋糖酐 是肝脏运输途中的良好保护液。在食品工业、石油化工等领域中，右旋糖酐也有广泛的 应用：右旋糖酐可阻碍蔗糖的结晶、促进乳化、提高脱水蔬菜的再水化效果等；在石油 工业中，高分子右旋糖酐则是油气钻孔过程中良好的稳定剂；摄影工业中，在银的感光 乳剂中添加低浓度的右旋糖酐可显著的提高成像质量。 同时右旋糖酐作为一种水溶性大分子载体，具有结构稳定，分子量能根据不同用途 和需要确定的优点，因此常与多种物质结合，生成高效、低毒的药物【3 剐。例如右旋糖酐 分子结构中含有大量的羟基，能与多种药物或蛋白的化学基团以共价键结合，连接方法 有直接酯化法、过碘酸盐活化法、氰卤化物活化法等。可载运多种药物，如抗肿瘤药物 包括多柔比星、阿糖胞酐、苯乙酸钠和紫杉醇等。将合适的药物与右旋糖酐形成大分子 结合物后，能起到延长药效、减少毒性、增强靶向性及降低免疫原性等作用。 1 3 , 3 右旋糖酐分子量控制方法 1 3 3 1 传统的乙醇分级沉淀法 在生产上，一般是以蔗糖为原料，利用蔗糖分子中的葡萄糖单元，经微生物发酵作 用，生成葡萄糖高分子聚合物，再将高分子聚合物水解，生成不同分子量的产物，处理 后可得右旋糖酐成品。整个制备过程分为菌种选育、种子培育、发酵、沉淀、水解、中 和、纯化、划分、离心及干燥等步剩3 2 l 。 n f h 矗o h 婶一一 nl h 茫卜。癌棚f 一 【c 蔗麓) i t 右麓籍爵 - + 【孳一 在目前的生产工艺中，一般是先采用盐酸对右旋糖酐发酵液进行初步水解，再根据 不同分子量的右旋糖酐在不同浓度的乙醇一水溶液中的溶解度不同( 分子量越大，在乙 醇水溶液中的溶懈度越小) 的特点，从而可沉淀分离中、低、小等不同分子量的右旋 糖酐产品，但是该工序存在着生产周期长、产品得率低、且产物的分子量分布过宽等问 题 3 9 - 4 2 。 7 溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 1 3 3 2 酶法制备右旋糖酐 国内外均有学者利用酶法控制右旋糖酐的分子量分布，如合肥工业大学姚日生等【4 3 j 利用海藻酸盐固定的肠膜状明串珠菌所产右旋糖酐蔗糖酶合成右旋糖酐，在合成过程中 加入右旋糖酐酶，使超高分子量的右旋糖酐裂解，以调节产物的相对分子质量，使产物 的分子量分布更加均一。也有利用专一性较强的右旋糖酐合成酶合成分子量分布较为集 中的右旋糖酐产品的实例。例如深圳汉邦多糖生物科技有限公司利用酶法合成右旋糖 酐，已经生产出了3 0 0 0 分子量的右旋糖酐，这是世界上第一次在工业生产中生产出分 子量最低而且纯净度最高的产品。然而利用酶制剂对右旋糖酐进行分子量控制，酶的成 本高，专一性的酶不易得到，很难获得不同分子量段的右旋糖酐产品。 1 3 3 3 超声降解右旋糖酐 超声波与声波一样，是物质介质中的一种弹性机械波，其频率范围为 2 x 1 0 4 h z 一1 0 9 h z 。目前研究认为，超声波降解大分子物质的主要机理是机械性断键作 用以及自由基的氧化还原反应畔l 。国外已有学者【4 5 l 对超声波降解右旋糖酐进行了初步的 研究，证明了超声波对右旋糖酐具有降解作用，其降解过程符合一级动力学模型，并且 随着超声时间的增加，平均分子量趋于稳定。但目前还没有建立超声控制右旋糖酐分子 量的具体方法，超声降解的可控性研究是亟待解决的问题。 1 3 3 4 膜分离技术 膜分离技术在右旋糖酐分子量分级领域已有广泛的应用。陈山1 1 2 1 利用电超滤溶析 结晶法分离纯化药用右旋糖酐，以膜过程与结晶纯化方法的耦合为技术突破口，提出了电 超滤溶析结晶法( e u s o c ) 新技术( 专利号c n 0 2 1 5 2 0 7 0 4 ) 并成功用于药用右旋糖酐的 分离纯化。此外，中国专利( 专利号c n 0 1 1 3 2 0 4 5 1 ) 提供了一种在水溶液中用超滤膜、 纳滤膜提取、纯化不同分子量组分，分级制备右旋糖酐的方法。 国外很早就开始利用膜分离技术对右旋糖酐进行分离纯化，取得了一定的成果，但 是在实际应用中也存在着诸如截留效果不理想等情况。这主要是由于右旋糖酐分子的变 形性很强，对膜孔显示出较低的选择性造成洲矧。 r 广西大掌司士尊啦论文溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 虽然在右旋糖酐的膜分离领域取得了很大的成就，但在实际生产过程，单纯的利用 膜分离技术对右旋糖酐进行分级纯化，得到纯度较高的产品仍然相当困难。这主要是因 为： ( 1 ) 料液的初始浓度受限制，若料液浓度过高，在膜分离过程的前期，浓差极化现 象的加剧，导致膜通量急剧降低，大大影响了生产效率，并对膜组件造成严重污染，不 利于膜通量的恢复。 ( 2 ) 由于膜组件自身的缺陷，及右旋糖酐分子的特殊性，不可能对右旋糖酐分子实 现精确的截留。 1 4 本课题的研究目标及研究内容 1 4 1 研究目标 本课题主要是针对传统乙醇沉淀法分离纯化右旋糖酐过程中存在问题，将溶析结 晶、超滤膜分离等技术进行有效集成，并筛选优化其工艺参数，批量制备出质量接近或 达到色谱纯、优于国家药典的高纯度右旋糖酐系列产品，并开发出具有自主知识产权的 新方法。 本课题创新主要体现在溶析过程数学模型的建立、膜分离过程的优化、及溶析结晶、 膜分离等技术手段的有效集成。 1 4 2 研究内容 一、利用溶析结晶法对右旋糖酐粗品进行粗分离，利用均匀实验设计方法及相应数 据分析软件，找出溶析结晶条件与大分子量右旋糖酐去除效果关系的数学模型。 二、采用膜分离技术对乙醇分级沉淀产物进行分子量分级，优化超滤工艺，得到较 纯的右旋糖酐产品。 三、通过紫外光谱，差示量热扫描仪等研究所制备的右旋糖酐产品纯度( 是否含有 蛋白、盐类、色素小分子等) 分析；通过h p g p c 测定右旋糖酐产品的分子量和分子量 分布，利用红外光谱等分析仪器对右旋糖酐进行结构鉴定，与文献及国家药典相比较， 评价分离纯化方法的效果。 9 广西大掌硕士掌位论文 溶析结晶辅助用1 分离鲞澍纯化药用乏内息糖酐的研究 第二章溶析结晶辅助膜分离技术的原理及特点 近年来，随着对多糖等生物大分子物质研究和应用的不断深入，糖类作为组织支持 物和能量来源的传统观念已被突破，糖类药物尤其是中药多糖，微生物多糖引起人们关 注而研究者众多，但由于生物大分子分离纯化技术条件的限制，多糖的构效研究尚处于 初级阶段。因此，关于以多糖为代表的生物大分子分离纯化的新工艺新方法的研究和开 发具有极强的现实意义和应用价值。 2 1 溶析结晶技术的研究和应用 2 1 1 溶析结晶技术的特点 溶析结晶是利用被分离物质与溶剂分子间相互作用力的差异，通过改变溶剂的性质 来选择溶解杂质，从而使目标组分最大限度地从溶剂中析出的过型4 7 j 。 应用溶析结晶分离生化产物的典型例子是蛋白质( 酶) 以及多糖的分离提取，无论是 实验室规模还是工业化生产，溶析结晶法都得到了普遍的应用l 4 8 j 。早在二战期间，e d w i n 及其合作者就用乙醇进行了蛋白质沉淀的经典实验，从人血浆中提取了白蛋白溶液，所 得产品成功的救治了1 9 4 1 年珍珠港空袭后的幸存者。 有机溶剂是影响生物大分子溶解性的重要因素。在一定范围内，有机溶剂通过争夺 生物大分子表面的水分子，减小介质的有效静电屏蔽，增加生物大分子间的静电相互作 用，从而降低生物大分子的溶解性并沉淀析出。在使用有机溶剂时，要尽可能在低温条 件下操作，以免造成生物大分子的变性【4 9 l 。 结晶是固体物质以晶体状态从蒸汽和溶液中析出的过程，而沉淀是固体物质以无定 形状态从蒸汽和溶液中析出的过程。结晶和沉淀在本质上是一致的，都是新相形成的过 程。不同的是，结晶过程具有高度的选择性，析出的晶体纯度高。要提高沉淀物的纯度， 除了严格控制沉淀( 结晶) 的速度外，还要尽可能提高底物的纯度。与传统的蒸发结晶方 法不同，溶析结晶法是利用某些有机溶剂或盐对溶液中的溶质进行“脱水”【则，使溶质达 到或超过其饱和浓度而结晶沉淀析出，从而替代蒸发过程。 1 0 广西大掣铂炙士掌位论文溶析结晶辅助膜分离参p k 多邑化药用右旋糖酐的研究 2 1 2 溶析结晶技术的应用 溶析结晶法的由于具有能耗低，可以提高溶质从母液中的回收率，可在低温下操作 等特点，适合那些热敏性物质( 生物制品及医药产品等) 的结晶，常用于蛋白质、酶制剂、 抗生素、多糖制剂等高价产品的分离提纯【5 1 1 ，但由于缺乏较为完善的理论指导，工艺技 术水平较其它工业结晶方法( 如冷却结晶、蒸发结晶等) 落后，基本上是凭经验操作。此 外，该方法溶析结晶所得晶体粒度小，杂质含量较高难以达到纯度及晶形要求，由于要 多次使用大量的化学试剂所造成的运行成本过高也制约了该技术的广泛应用。 目前，对于溶析结晶过程的研究仍有待深入。有学者认为，溶析结晶的机理是由于 加入的有机溶剂使水溶液的介电常数降低，并使溶质分子问的静电引力( 库仑力) 增大， 导致凝集和沉淀；而另一种说法是由于溶质分子的溶剂化，使原来和大分子结合的水被 溶剂所取代，从而降低了大分子的溶解度。但不管何种理论，仍无法准确的描述溶析结 晶过程。 通过对蛋白质溶析结晶的研究，有学者提出，蛋白质溶解度与其溶液体系介电常数 之间的关系可用下式描述1 5 2 l 。 l g s = ( k a 2 ) + l g s o( 2 1 ) 式中，s o 为当( k a 2 ) 刮时s 的外推值；a 为水有机溶剂混合物的介电常数； k 为常数。 而m o s s e d 等人【5 3 】则认为，加入某种有机溶剂后，若溶剂对溶质有沉淀作用，则沉 淀物与有机溶剂添加量之间的关系可用式( 2 2 ) 描述： f - k i n 川v c ) ( 2 2 ) 式中，f 为加溶剂后溶质的沉淀分数；v e 为刚开始沉淀所需加入的溶剂量( 最小溶剂 加入量) ；v 为实际已加入的溶剂量：k 为溶剂常数。 式( 2 2 ) 将有机溶剂的添加量与沉淀分数直接关联起来，与式( c 2 1 ) 相比，在应用上更 为方便。 由式( 2 2 ) 可知，沉淀分数f 直接受到参数k 、k 的影响，而k 、k 的大小取决于 溶剂的种类和溶质的种类。因此，对于特定的目标产物而言，有机溶剂的选择是关键， 要求溶剂具有较强的选择沉淀性，否则需要进行多步分离，从而导致工艺路线冗长、回 收率低，且无法得到高纯度的产品，工业生产难以接受【5 4 1 。 广西大掌司配b 掌位锻譬溶析结晶辅助膜分离多p k 纯化药用右旋翱陌f 的研究 2 2 膜分离技术的研究和应用 膜分离技术是利用天然或人工合成的、具有选择性的薄膜，以外界能量或化学位差 为推动力，对双组分或多组分体系进行分离、分级、提纯或富集的技术1 5 5 1 。利用膜对分 离组分的尺寸选择性，将大于膜孔尺寸的微粒和溶质截留，而使小于膜孔尺寸的微粒、 溶质或溶剂透过滤膜。 通常根据滤膜孔径或被截留微粒的最小粒径的大小，可将膜分离分为以下四类：微 滤、超滤、纳滤和反渗透。各种膜过程具有不同的机理，适用于不同的对象和要求。相 比其它分离技术，如蒸馏、吸附、吸收、萃取等，膜分离具有以下特点i 嗣： 第一、膜分离是一个高效的分离过程，分离系数大，能将相对分子量为几千万甚至 几百的物质进行分离。例如，按物质颗粒大小分离的领域，以重力为基础的分离技术最 小处理极限是微米级的悬浮颗粒，而超滤膜分离却可以做的将相对分子质量为几千万甚 至几百的物质进行分离，相应的颗粒大小为纳米级。蒸发过程中物质的相对挥发度的比 值( 选择系数) 大都是个位数，与之相比，膜分离中的选择系数要大得多，用聚砜膜分离 氮、氢，分离系数为8 0 左右，聚酞亚胺膜则超过1 2 0 。 第二、膜分离过程不发生相变，能耗较低。大多数膜分离过程都不发生“相”的变化。 对比之下，蒸发、蒸馏、萃取、吸收等分离过程，都伴随着从液相或吸附相至气相的变 化，而相变化的潜热是很大的。很多膜分离过程通常是在室温附近的温度下进行的，被 分离物料加热或冷却的消耗很小。 第三、多数膜分离过程的工作温度在室温附近，特别适用于对热过敏物质的处理。 第四、膜分离设备本身没有运动的部件，工作温度在室温附近，很少需要维护，可 靠度高，操作十分简便，很少需要维护，可靠度高，可以在频繁的启、停下工作。 第五、膜分离过程的规模和处理能力可以在很大范围内进行变化，而它的效率、设 备单价、运行费用变化不大。 第六、膜分离设备体积比较小，占地较少，通常可以直接插入到已有的生产工艺流 程，不需要对生产线进行大的改变。因此，以超滤为代表的膜分离技术被认为是二十世 纪在分离科学中最引起轰动的成就之一网。 2 2 1 膜分离技术理论基础 膜分离的介质为均质多孔的滤膜，它类似多层叠置的筛网，其截留微粒的作用局限 溶析结晶辅助膜分离麴嘲纯化药用右旋糖酐的研究 于膜的表面，将处理液中大于膜孔径的微粒全部截留。一般情况下，膜过滤对于大分子 溶质的截留分离包含三种方式1 5 8 1 ：( 1 ) 膜表面的机械截留( 筛分) ：( 2 ) 在膜孔中停留 而被除去( 阻塞) ；( 3 ) 在膜表面及膜孔内的吸附( 一次吸附) 。筛分是由溶质粒子的大 小、形状与膜孔径的大小、形状之间的关系决定的。吸附和阻塞过程则是膜与溶质粒子 物化性质之间的相互作用结果。这三个过程相结合的统一效应构成了膜技术的分离机 理。 微滤、超滤、纳滤、反渗透均属于压力驱动型膜分离技术。微滤膜具有比较整齐、 均匀的多孔结构，在静压差的作用下，小于膜孔的粒子通过滤膜，比膜孔大的粒子则被 阻拦在滤膜面上，其分离机理包括筛分截留，同时膜表面和膜孔内的吸附对大分子的截 留也有影响【5 舛。 微滤主要从气相和液相物质截留微米及亚微米级的细小悬浮物、微生物、微粒、细 菌、酵母、红血球、污染物等以达到净化，分离和浓缩的目的。超滤所用的膜为非对称 膜，主要用于从液相物质中分离大分子化合物( 如蛋白质、核酸聚合物、淀粉、天然胶、 酶等) 、胶体分散液( 粘土、颜料、矿物料、乳液粒子、微生物等) 、乳液( 润滑脂洗 涤剂以及油水乳液等) 。超滤对去除水中的微粒、胶体、细菌、热源和各种有机物有 很好的效果，但几乎不能除去无机离子。反渗透膜和纳滤膜均为无孔膜，其传质机理为 溶解扩散方式。反渗透膜具有能透过溶剂( 一般是水) 而截留离子物质的性质。而纳 滤膜大多为荷电膜，对于水中分子量为数百的有机小分子成分具有分离能力，对于不同 价态的阴离子存在d o n n a n 效应。因此，处理液的荷电性，离子的价数和浓度对纳滤膜的 分离效果有很大的影响。 2 2 2 膜分离的特性参数 2 2 2 1 膜通量 生产实际中最受关注的是膜的生产能力，用膜通量l 来表征。膜通量定义为单位时 间、单位膜面积上透过的液体体积量。膜过滤符合达西的过滤基本方程，即： i v 仪p p r ， ( 2 3 ) 式中：a p 膜两侧的流体压力差，p a ； 滤液粘度，p a s ； 溶析结矗辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 尺，膜滤的总阻力，1 m 该式的膜过滤的总阻力应包括膜结构决定的自身固有阻力，以及过滤过程中的由于 吸附及堵塞引起的膜阻力的变化量，还应包括膜面上截留累积的物质所引起的各种阻 力。 在实验过程中，常采用以下公式计算膜通量： lil(2-4) f s 式中：y - i 菱过液体积； r 处理时间； s 处理膜面积。 2 2 2 2 截留率 为了描述和表征膜的截流能力，常使用截流率及截留分子量两个参数。截留率s 是 用处理液中的物质浓度在膜处理前后的变化定义的： s=1-拿(2-5) g 式中：q _ 滤液中的物质浓度，k g m 3 ： c 原料中的微粒浓度，k g m 3 。 2 2 3 膜分离的传质理论及常用模型 利用膜技术分离物料，膜通量会随处理的进行而逐渐下降。通量下降的原因为浓差 极化、形成凝胶层、孔堵塞、吸附等。在平衡状态下，随渗透物一起带到膜上并被膜截 留的组分又会反向的传递到流体相。反向传递一方面可以建立在扩散效应的基础上；另 一方面也可以建立在流体动力学效应的基础上。扩散效应是由膜上被截留组分浓度的升 高而引起的，流体动力学效应则是由膜上的速度梯度造成的剪应力引起的。原则上讲， 脱离膜的反向传递两种效应都起作用，但影响程度不同，而且与粒子或分子的大小密切 相关。当微粒尺寸小于l o o n m 时，主要受扩散效应的支配：当微粒尺寸大于1 0 0 n m 时， 主要受流体动力学效应支配。由于各种影响因素的复杂性和物料体系的多样性，目前还 没有通用的可描述膜过滤过程的数学模型，常用来描述传质过程的模型有细孔模型、浓差 1 4 广西大学硕士掌位嵌吁 溶析结晶辅助膜分离技术纯化药用右旋糖酐的研究 极化与凝胶极化模型等。 2 2 3 1 细孔模型 细孔模型认为通过膜的微孔的溶质传递包括扩散流动和对流流动两种类型，基于著 名的s t o k e s m a x w e l l 摩擦模型建立了经典统计力学方程并在表征膜内溶质扩散方程中引 入立体阻碍因子，考虑了溶质的空间位阻效应和溶质与孔壁之间的相互作用。 细孔模型假定多孔膜具有均一的细孔结构，细孔半径为，膜的开孔率与膜厚之比 为a 缸。而溶质为具有一定大小的刚性球，其半径( ) 可以通过s t o k e s - e i n s t i e n 方 程进行估算。 r i 。l (