[doc] 广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验.doc

广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验中国畜牧兽医2008年第35卷第1o期疾病防治?93?广西罗非鱼链球菌病病原的生化鉴定及药敏试验李波,陈明,李莉萍,陈汉忠,徐增辉.,李超,黄维义.,梁万文(1.广西水产研究所,南宁530021;2.广西大学动物科学技术学院,南宁530005)摘要:从来自南宁,北海等地的十几个暴发疾病的罗非鱼养殖场发病罗非鱼中,分离得到了8株链球菌.通过生化鉴定及药敏试验,结果表明,分离到的8株致病性链球菌,有6株为海豚链球菌(streptococcusiniae),2株为无乳链球菌(streptococcusagalactiae).关键词:罗非鱼;链球菌;生化鉴定;药敏试验中图分类号:$852.611文献标识码:b文章编号:l6717236(2008)10009303罗非鱼链球菌病是一种暴发性流行病,主要病理特征为眼球突出或混浊发白,眼眶充血,腹部膨大,肛门红肿,采食减少或绝食,游姿平衡失调,翻滚,转圈,解剖病鱼可见胆囊肿大,胆汁稀薄,色浅,肠腔充满淡黄色液体,肝脏增大(柴家前,2002).近年来,链球菌病在广西罗非鱼养殖场中频频暴发,给广西主要出口型养殖品种罗非鱼养殖带来了巨大的经济损失.由于药物滥用和水质恶化等造成菌株变异和毒力增强,致使该病一直未能得到很好治疗和预防(张生等,2007).为了对该病病原链球菌有更好的了解和研究,进一步明确广西罗非鱼链球菌病的流行菌株,笔者对广西南宁市等十几个地方的疑似链球菌病病料进行病原分析,生化鉴定及药敏试验,现报告如下.1材料与方法1.1病料病料来自广西南宁,北海等十几个暴发链球菌病的罗非鱼养殖场.1.2试验材料细菌分离用tsa培养基成分为北京奥博星生物技术有限公司产品;羧苄青霉素,先锋v,环丙沙星,林可霉素,多黏菌素,先锋,新生霉素,复方新诺明,氟哌酸,利福平,阿莫西林,头孢噻吩,先锋必等13种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司;人工感染试验用健康罗非鱼来源于广西水产研究所国家级罗非鱼良种场和广西水产研究所淡水基地,体重4o60g;细菌生化鉴定仪为bblcrystal细菌鉴定系统;siniae标准菌株(atcc29178)由中山大学赠送.收稿日期:20080304作者简介:李波(1979一),男,广西人,硕士生,主要从事动物寄生虫免疫及分子生物学研究.通讯作者:梁万文.基金项目:广西科学研究与技术开发计划项目(科技基0639036,科技基0731036).1.3病原分离和形态观察无菌采集病鱼的脑,肝,肾接种于马丁肉汤,37培养24h,革兰氏染色镜检.将镜检有g+双球菌或短链状的马丁肉汤培养物稀释后接种于tsa平板上,37培养24h后,挑选平板单个可疑菌落镜检,确定为链球菌后接种于马丁肉汤培养,无菌检验后编号放4冰箱备用.最后分离得到8株链球菌,具体来源如表1.表1临床分离菌株信息1.4生化试验将上述分离株分别纯化培养,进行系统的生化鉴定.以bblcrystal细菌鉴定系统测定细菌的各项生理生化指标(委托广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心完成).1.5药敏试验采用药敏纸片琼脂平板扩散法.细菌纯化培养后,用生理盐水校正菌液浓度至1.5locfu/ml.将待检菌液各取0.2ml在tsa平板上均匀涂抹,加盖后放置5rain,用镊子将药敏纸片平放在平板上,并轻压使其紧贴在平板表面,两纸片中心相距不少于24mm,纸片与平皿边缘不少于15film.于28培养24h,观察结果.1.6人工回归感染试验试验用健康罗非鱼体重4060g,先在大体积水缸内驯养1周.感染试验在45l水箱中进行,共6组,3o尾/组.用tsb分别扩大培养分离菌株5号,28培养48h,菌液计数.15组分别以110.,110,110,11o.,110cfu/ml腹腔注射攻毒,0.2ml/尾,第6?94?疾病防治中国畜牧兽医2008年第35卷第1o期组为对照组,每尾注射等体积1.2生理盐水.每2d换水2/3,水温在2229,每天按试验鱼体重2%分2次投料.每天观察并记录其进食,发病症状及死亡数,同时利用鸡血培养基对濒临死亡的罗非鱼脑,肝脏,脾脏和肾脏进行细菌分离鉴定.2试验结果2.1病料中链球菌的检出和分离结果从广西南宁,北海等淡水养殖发病罗非鱼肝脏,肾脏和脑均分离得到典型菌株,共8株,编号为18,各菌株信息见表1.在tsa平板上培养14h,菌落为针尖大小,无色.24h后,菌落直径12mm,乳白色,圆形,隆起,边缘整齐.革兰氏染色发现,3株细菌革兰氏染色不稳定,但多数时候为阳性链球菌,各菌株在显微镜下排列分布各异,有的菌株链长,有的菌株链短,有的菌株不呈链状分布,而是单个或团状分布.2.2生化试验结果8株分离菌株均为过氧化氢酶阴性,无运动性,b溶血,10不生长,45生长;接触酶阴性,水解七叶灵,精氨酸;vp试验,脲酶和马脲酸试验阴性,发酵葡萄糖,水杨苷,蔗糖和淀粉,不发酵阿拉伯糖,菊糖,乳糖,蜜二糖,棉子糖和山梨醇.其中2号和8号水解马尿酸盐但不水解淀粉,具有lancefield氏b群特异性抗原群,而其它6株相反.根据伯杰氏细菌鉴定手册(第9版)中对链球菌的描述(weinstein等,1996;sneath等,1986;berridge等,1998;goh等,1998),初步鉴定2号和8号为sagalactiae,其余6株为siniae.2.3药敏试验试验采用先锋类和磺胺类等13种常用抗生素对各分离菌株和siniae标准菌株进行药敏试验,测量其抑菌圈大小,判断标准:直径小于10itiiti不敏感;1015mnl之间为中度敏感;1520itiiti为高度敏感;大于20n1in为极度敏感.试验结果见表2.表2抗菌药物对8株细菌的抑菌圈直径(mm)注:18为分离菌株,9为siniae标准菌株.2.4人工感染试验采用分离菌株5号进行人工感染试验,结果表明,高浓度感染组(110.,1lo,110和1x10cfu/m1)试验罗非鱼死亡主要发生在注射后前2d,第6d停止死亡,死亡率达90,未出现典型临床症状.低浓度感染组(11ocfu/m1)罗非鱼发病较慢,症状与自然发病一致,死亡率为50,表明分离得到的病原菌致病性较强.同时利用鸡血平板对濒临死亡罗非鱼脑,肝脏,脾脏和肾脏进行细菌分离培养,经鉴定分离到的细菌均为5号株.3结论与分析近两年来对广西罗非鱼暴发链球菌病的情况调查表明:该病311月均可暴发,发病水温范围在2634.传播速度较快,7d左右可波及全场.急性和慢性发病结合,发病率在19/63,日死亡率为0.10.2.急性型死亡前未表现明显的症状及病变.慢性型部分发病鱼可出现典型症状及病变,主要表现为浮头,转圈,狂游及发病后期单侧眼睛浑浊,突出及全身大面积弥漫性出血.解剖发现,肠道广泛出血.腹腔充满腹水,肾脏严重肿大,肝脏苍白并伴有全身弥散性出血点.通过生化鉴定试验,结果表明8株都属化脓性溶血链球菌群.其中6株为siniae,2株为无乳链球菌(sagalactiag).调查的两起罗非鱼sagalactiae病发生在7月,均表现为慢性型,除具有siniae引起的症状及病变,sagalactiae感染发病罗非鱼均出现腹腔严重肿大,剖开流出大量黄色透明液体,siniae感染发病罗非鱼均未出现这一症状.通过临床表现发现,siniae的致病性显着比sagalactiae强,是引发广西罗非鱼链球菌病暴发最主要的菌株.链球菌易产生耐药性.体外药敏试验结果表明各分离菌株对不同药物的敏感度有较大差异,与siniae标准菌株(atcc29178)对比差异很大.但多数菌株对先锋类药物和林可霉素较敏感,为临床用药提供了科学依据.目前链球菌已成为全球性主要鱼类致病菌之一,许多国家和地区水产养殖均遭受链球菌病危害.链球菌可感染多种海淡水养殖鱼类(如日本鲆,鳗,虹鳟及罗非鱼等),同时可在不同种鱼类之间交叉传播(shoemaker等,2001;colomi等,2002;zlotkin等,1998),还可因操作不慎随伤口感染人类(lau等,2003;lehane等,2o0o).因此,链球菌引起的鱼类疾病,不仅对渔业生产造成危害,而且对食品安全和人类健康也构成威胁,应引起足够重视.中国畜牧兽医2008年第35卷第1o期疾病防治?95?参考文献1张生,曾中良,王凡,等.暖水鱼类链球菌病研究概况j.水产科技,2007,2:16.2柴家前,丁巧玲,王振龙.罗非鱼链球菌的分离鉴定il1.中国预防兽医,2002,24(1):1820.3berridgebr,fullerjd,azavedoj,eta1.developmentofspecificnestedoligonucle0tidepcrprimersforthestreptococcusiniae16s一23sribosomaldnaintergenicspacerem.journalofclinicalmicrobiology,1998,36(9):27782781.4colornia,diamanta,eldara,eta1.streptococcusiniaeinfectionsinredseacage-culturedandwildfishesj.disaquatorg,2002,49:165170.5gohsh,driedgerd,gilletts,eta1.streptococcusiniae,ahumanandanimalpathogen:specificidentificationbythechaperonin6ogeneidentificationmethodj.jcm,1998,36(3):21642166.6lauskp,woopcy,tseh,eta1.invasive&reptococcusiniaeinfectionsoutsidenorthamericaj.jclinmicrobiol2003,41:10041009.7lehanel,rawlingt.topicallyacquiredbacterialzoonosesfromfish:areviewj.medjaust,2000,173:256259.8shoemakerca,klesiusph,evansjj,eta1.prevalenceofstreptococcusiniaeintilapia,hybridstripedbass,andchannelcatfishoncommercialfishfarmsintheunitedstatesej.ajvr,2001,62:174177.9sneathpha,mairna.sharpme,eta1.bergeysmanuaiofsystematicbacteriologym.baltimore:thewilliams&wikinsco,1986,2:9991002.10weinsteinmr,lowde,mcgeera,eta1.preliminaryreport.invasiveinfectionduetostreptococcusiniae:aneworpreviouslyunrecognizeddiseasej.ontarioccdr,1996,22:129132.11zlotkina,hershkoh,eldara.possibletransmissionofstreptococcusiniaefromwildfishtoculturedmarinefishej.applenvironmicrobiol,1998,64:40654067.biochemistryidentificationanddrugsensitivitytestofpathogenicstreptococcusfromtilapiainguangxilibo,chenming,liliping,chenhanzhong,xuzenghui.,l1chad,huangweiyi.,liangwan-wen(1.guangxiinstituteoffisheries,nanning530021,china;2.collegeofanimalscienceandtechnology,guangxiuniversity,nanning530005,china)abstract:eightstreptococcuseswereisolatedfromdiseasedtilapiasinfarmsinnanning.theresultsshowedthat6isolatedstrainsweres.iniae,theother2strainsweres.agalactiaebybiochemistryidentification,anddrugsensitivitytestprovidedusefulinformationforclinic.keywords:tilapia;streptococcus;biochemistryidentification;drugsensitivity产前日粮碳水化合物来源和莫能菌素对经产奶牛围产期代谢和泌乳的影响y.一h.chung等着张春林摘译刘开朗,卜登攀校摘要:选用85头经产荷斯坦奶牛随机设计,评估产前碳水化合物来源及莫能菌素对围产期奶牛干物质采食量,血液参数和泌乳性能的影响.日粮处理按照2