【毕业论文】医学类小鼠甲苯急性毒性实验研究.pdf

安徽医科大学 硕士学位论文 小鼠甲苯急性毒性实验研究 姓名 徐蓉 申请学位级别 硕士 专业 人体解剖与组织胚胎学 指导教师 李光武 黄学应 20060401 安徽医科大学硕士学位论文 学位论文独创性声明 本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果 据我所 知 除了文中特别加以标注和致谢的地方外 论文中不包含其他人已经发表或撰写过的 研究成果 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并 表示谢意 学位论文作者签名 4 冬整 日 期 型 壶 学位论文使用授权声明 本人完全了解安徽医科大学有关保留 使用学位论文的规定 学校有权保留 学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版 有权将学 位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅 有权将学 位论文的内容编入有关数据库进行检索 有权将学位论文的标题和摘要汇编出 版 保密的学位论文在解密后适用本规定 学位论文作者签名 缮券 日期 知 6 t o l ut o l u e n e 英文缩略词表 c h a tc h o li n ea c e t y lt r a n s f e r a s e a e h a c e t y l c h o li n e g a b a g a m m aa m i n o b u t y r i ca c i d g l u c c h i p h e l d 5 0 g l u t a m a t e c e r e b r a lc o r t e x h i p p o c a m p u s h e m a t o x y li ne o s e 3 一 甲苯 乙酰胆碱转移酶 乙酰胆碱 y 一鸣虱基丁酸 谷氨酸 大脑皮层 海马 苏木精伊红 半致死剂量 童竺垦壁垄兰塑主堂堡笙查 中文摘要 小鼠甲苯急性毒性实验研究 目的 研究甲苯急性毒性 观察不同剂量小鼠腹腔注射甲苯 急性中毒一般表 现及神经系统表现 急性中毒肝 心 肾 肺组织形态病理学改变 免疫组 织化学研究脑急性中毒所引起的神经递质与酶的改变 探讨急性毒性危害机制 方法 小鼠腹腔注射甲苯制作急性中毒模型 甲苯组分别按8 0 0 0m g k g 4 0 0 0 m g k g 2 0 0 0 m g k g 1 0 0 0m g k g 5 0 0m g k g 剂量组 对照组为n s 组 每组 1 5 只 雌雄各半 染毒后观察急性中毒行为表现 分组记录死亡时间及死亡数 死亡鼠及时取肝组织分析肝湿重比 定量描述肝损伤 4 d 6 d 8 d 1 0 d 1 2 d 1 4 d 运用程控自主活动箱检测 记录3 m i n 内小鼠活动次数 了解甲苯急性毒性对 小鼠自主活动性的影响 选择2 0 0 0m g k g 10 0 0m g k g 5 0 0m g k g 剂量组及 n s 组 在1 d 7 d 1 4 d 取小鼠的脑 肝 心 肾 肺组织 死亡鼠及时取组织 常规石蜡包埋和切片 各组织常规h e 染色观察组织病理学改变 脑组织n i s s l 硫堇染色观察大脑皮层及海马神经元尼氏体改变 免疫组织化学a b c 法 研究 小鼠大脑皮层的c h a t g a b a g l u 阳性细胞的表达变化 结果 甲苯具有急 性毒性 小鼠甲苯染毒各组都有急性中毒的表现 表现为抑制状态 扭体 反应 迟钝 静伏 眯眼 眼部有分泌物 出汗 呼吸急促转衰弱 食欲降低 甚至出 现死亡 运用寇氏法公式l d5 0 1 7 8 2 3 8 m g k g s i gl d5 0 0 0 6 0 2 l d5 0 的 标准误 l d5 0 9 5 c i 可信区间 1 3 5 8 3 12 3 3 8 8 4 m g l c g 自主活动明 显降低 p 0 0 5 2 0 0 0r a g k g 与1 0 0 0m g k g 5 0 0m g k g 比较有差异 尺o 0 5 脑h e 染色显示染毒各组与n s 组比较在1 d 神经元 神经胶质及神经核团无明 显变化 7 d 甲苯染毒各组神经元肿胀 突起消失 空泡变性 神经胶质细胞可见 空泡变性 数目无明显变化 1 4 d 神经胶质增生 神经核团内神经元变性 大脑 皮层神经元细胞体聚集 n i s s l 硫堇染色显示染毒各组与n s 组比较在1 d 无变化 1 4 d 甲苯染毒各组尼氏体减少 核空泡化 并随剂量增加而严重 免疫组织化学 安徽医科大学硕士学位论叉 一 二 一 显示 c h a t 免疫阳性细胞主要分布大脑皮层 1 d 各剂量组均未见明显变化 7 d 轻度减少 i 4 d 明显减少 g a b a 免疫阳性细胞在大脑皮层和海马广泛分布 1 d 7 d 各剂量组未见明显变化 1 4 d 轻度减少 g l u 免疫阳性细胞1 d 各剂量组未见 明显变化 7 d 1 4 d 减少 以1 4 d 明显 其它重要脏器表现肝脏 死亡小鼠 肝肿大 染毒各组与n s 组比较均有差异 p o 0 5 2 0 0 0 m g k g 组 1 0 0 0 m g k g 组与5 0 0 m g k g 组比较有差异f p 0 0 5 eh e 染色显示肝细胞空泡变性明显 脂肪 变性 细胞间隔增大 有片状坏死 随剂量增加而严重 1 d 变化明显 7 d 部分 恢复 1 4 d 接近正常 心脏 肉眼观有轻度红肿 h e 染色显示部分心肌细胞肌纤 维溶解 t l 肌细胞肿胀 肾 肾脏肉眼观有肿胀 h e 染色显示小鼠甲苯染毒各剂 量组肾小管上皮细胞肿胀 部分脱落 微绒毛脱落 管腔破坏 髓质充血 随剂 量增加而严重 7 d 部分恢复 1 4 d 接近正常 肺 肺直观无明显异常 h e 染色 显示小鼠肺细支气管与部分肺泡腔内可见灶性炎性坏死 中性粒细胞浸润 7 d 部 分恢复 1 4 d 接近正常 结论 小鼠腹腔注射甲苯发现具有急性毒性 l d 1 7 8 2 3 8m g k g 中毒小鼠自主活动性降低 p 0 0 5 肝 心 肾 肺都有 不同程度的损伤 以肝损伤最为严重 染毒小鼠死亡原因可能由于脑水肿 肝 中毒及 l i 脏损伤而导致多脏器的功能衰竭 脑组织神经元凋亡 神经递质表达 和含量的改变 关键词 甲苯小鼠急性中毒l d 5 0自主活动性免疫组织化学a b c 法 脑肝心肾肺组织病理学 安徽医科大学硕士学位论文 a b s t r a c t e x p e r i m e n t a lr e s e a r c ho na c u t et o x i ce f f e c t so ft o l u e n e i nm i c e o b i e c t i v e t oo b s e r v eo na c u t et o x i ce f f e c t si nm i c ea f t e rd i f f e r e n td o s e so f t h et o l u e n e i n t r a p e r i o n e a li n j e c t i o nj u s ta sf o l l o w s t h eg e n e r a la n dt h et o x i cp h e n o m e n o no f n e r v o u ss y s t e ma n do t h e ro r g a n si nm i c e m ep a t h o l o g i cc h a n g e so ft h ed i f f e r e n t o r g a n s s u c ha s l i v e r h e a r t k i d n e y l u n g t h ec h a n g e so ft h en e u r o t r a n s m i t t e r sa n d t h ee n z y m eo w i n gt ot h ea c u t et o x i c i t yu s i n gi m m u n o h i s t o c h e m i s t r ym e t h o d s a n d e x p l o r e dt h ea c u t et o x i cm e c h a n i s m s m e t h o d s t om a k et h ea c u t et o x i cm i c em o d e l s o fi n t r a p e r i o n e a lc a v i t yi n j e c t i o n t h et o l u e n eg r o u p sc o u l db ec l a s s i f i e di n t of i v e t e a m s 8 0 0 0 m g k g 4 0 0 0 m g k g 2 0 0 0 m g k g 1 0 0 0 m g k g 5 0 0 m g k g t h e c o n t r o l g r o u p w a sn o r m a ls o d i u m t h en u m b e ro fe a c ht e a mw a s15 o fw h i c ht h em a l ea n df e m a l e n u m b e r sw e r ee q u a l a f t e ru s i n gt o l u e n e t h ea c u t et o x i cp e r f o r m a n c e sa n dr e c o r dt h e d e a t ha n dn u m b e ro f d e a t hw e r eo b s e r v e d w h o s eh e p a t i ct i s s u e sw e r eu s e dt oa n a l y z e t h el i v e r r a t i oo fw e tw e i g h ts ot h a tt h eh e p a t i ci n j u r i e sc o u l db ed e s c r i b e d q u a n t i t a t i v e l y t h ep r o g r a m m a t i cc o n t r o l l i n ga u t o n o m i ca c t i v i t i e sc a s ec o u l db eu s e dt o d e t e c ta n dr e c o r dt h ea c t i v i t i e s i n3 m i n t h ei n f l u e n c e so ft o l u e n ea c u t et o x i c i t yo n m i c ea u t o n o m i ca c t i v i t i e sc o u l da l s ob ek n o w n a l lt h e s eo p e r a t i o n sw e r ec a r r i e do u t i n4 d 6 d 8 d 1 2 d 1 4 dr e s p e c t i v e l y f o u rg r o u p s 2 0 0 0 m g k g 1 0 0 0 m g k g 5 0 0 m g k ga n d n o r m a ls o d i u mc o u l db es e l e c t e d t h eb r a i n 1 i v e r h e a r t k i d n e y l u n g t i s s u e si n 1 d 7 d 1 4 dw e r e u s e dt om a k ep a r a f f i ni m b e d d i n ga n ds e c t i o nu s i n gt h et i s s u e s o r i g i n a t e df r o mt h eb r a i n l i v e r h e a r t k i d n e ya n dl u n go fm i c ea sw e l la st h es a m e t i s s u e sf r o mt h ed e a t h t h e s ep r o c e s s e sw e r ej u s ta sf o l l o w s t oo b s e r v et h eh i s t o r i c a l a n dp h a r m a c o l o g i c a lc h a n g e sa f t e rn o r m a lh e t oo b s e r v et h ec h a n g e so fc e r e b r a l c o r t e xa n dn i s s lb o d i e si nt h en e u r o n so fh i pa f t e rb r a i nt i s s u en i s s l t or i s e i m m u n o h i s t o c h e m i s t r ya b em e t h o dt oe x p l o r et h ec h a n g e so f t h ec h a t g a b a o l u p o s i t i v ec e l l si nt h em i c ec e r e b r a lc o r t e x r e s u l t s t o l u e n eh a da c u t et o x i c i t v t h e m i c et e a m su s i n gn a r c o t i c sa l ls h o w e da c u t et o x i cp e r f o r m a n c e ss u c ha s i n h i b i t i o n 一6 1 安徽医科大学硕士学位论文 二 一 一 a c t i v i t i e s w r i t h i n g d u l lr e a c t i o n s s t i l lb e n d i n g s q u i n t i n ge y e s t h eo c u l a rr e o n s e c r e t i n g s w e a t i n g t h eb r e a t h l e s s n e s st u r n i n gi n t oa s t h e n i a a p p e t i t ed e g r a d i n ga n dt h e d e a t h t ou s ek a r b e r sm e t h o dl d5 旷 1 7 8 2 3 8 r a g k g sl gl d s o o 0 6 0 2 l d 5 0 s e l d5 0 9 5 c i c i 1 3 5 8 3 12 3 3 8 8 4 m g 蚝 t h eo b v i o u sd e d u c t i o n o ft h ea u t o m a t i ca c t i v i t i e sn u m b e r p 0 0 5 w h i c hi n d i c a t e dt h e r ew e r ed i f f e r e n c e s a v a i l a b l ea m o n g2 0 0 0 m g k g h i 曲d o s e a n d1 0 0 0 m g k g m i d d l ed o s e 5 0 0 m g k g 1 0 w d o s e p 0 0 5 h eo f b r a i ns e c t i o na n dc o n t r o lg r o u p si n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r ei l o o b v i o u sc h a n g e si nt h en e l j x o n s g l i a lc e l l sa n dn u c l e u si nl di n t e r v a l a f t e ru s i n g t o l u e n e t h es w e l l i n gc e l l s t h ed i s a p p e a r i n gp r o c e s s e s d e g e n e r a t i v ev a c u o l o u sa n d n e u r a l 百i ac e l l sw e r en oo b v i o u sc h a n g e so ft h en u m b e r so ft h en e u r a lg l i ac e l l s a v a i l a b l ea t7 d t h es w e l l i n gn e u r o n sa n dg l i a c e l l s d e g e n e r a t i v en u c l e u s t h e c o n c e n t r a t i n gn e u r a lb o d i e sw e r ef o u n di nt h ec e r e b r a lc o r t e xa t1 4 d n i s s lb o d i e so f b r a i ns e c t i o l la n dc o n t r o lg r o u p ss h o w e dn oc h a n g e sa tl d h o w e v e r w h a tc o u l db e s h o w e da t1 4 dw a st h a tt h e r ew e r ed e c r e a s i n gn i s s lb o d i e s v a c u o l u sn u c l e a r w h i c h t u r n e do u tt ob e c o m es e r i o u sf o l l o w i n gt h ei n c r e a s i n gd o s e s i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y e x p r e s s i o n ss h o w e dt h a t c h a tp o s i t i v ec e l l ss p r e a d i n gm a i n l yi nc e r e b r a lc o r t e xi n e a c hd o s et e a mh a dn oo b v i o u sc h a n g e sa tl d w h i l et h e r ew e r eo b v i o u sd e c r e a s i n g n u m b e r so fc h a tp o s i t i v ec e l l s t h ew e a ke x p r e s s i o n so f g a b aw e r e 豁w e l la st h e s p r e a d i n gp o s i t i v ec e l l sm a i n l yo nt h ec e r e b r a lc o r t e xa n dt h eh i p a l lt h eo b s e r v a t i o n c o u l db ef o u n dt h a tt h e r ew e r en oo b v i o u sc h a n g e sa m o n ge a c hg r o u pa tl dw h i l e o b v i o u sd e d u c i n gn u m b e r so ft h eg a b a p o s i t i v ec e l l sa t7 da n d1 4 d n em a i n l y s p r e a d i n gg l up o s i t i v ec e l l s t h en u m b e ro f w h i c hs h o w e dn oo b v i o u sc h a n g e sa m o n g e a c hg r o u pa tl d w h i l et h e r ew e r eo b v i o u sd e d u c i n gc h a n g e sa t7 da n d1 4 d t h e o t h e ro r g a n s e x p r e s s i o n s l i v e r s w e l l i n g t h e r ew e r ed i f f e r e n c e sn o to n l yb e t w e e n n a r c o t i c st e a ma n dt h ec o n t r o lt e a mb u ta l s oa m o n g2 0 0 0 m 眺g t e a m 1 0 0 0 m g k gt e a m a n d 5 0 0 m g k g t e a m t h eo b v i o u s v a c u o l a r d e g e n e r a t i o n a d i p o s e d e g e n e r a t i o n w i d e n i n gc e t lc o m p a r t m e n t l a m e l l a rn e c r o s i ss h o w e db yh e t h e 7 一 安徽医科大学硕士学位论文 c h a n g e so fl i v e rc o u l db em o r ea n dm o r es e r i o u sw i t ht h ei n c r e a s i n gd o s e s o b v i o u s c h a n g e sa tl d r e c o v e r ya t7 d n e a r i n gt on o r m a l i t ya t1 4 d h e a r t t h el i g h ts w e l l i n g t h r o u g hn a k e d e y e s c a r d i a cm u s c l ec e l l s s w e l l i n ga n dc a r d i a cm u s c l ef i b e r s p a r t i a l l y d i s s o l v e d k i n d e y s w e l l i n gt h r o u 曲n a k e d e y e s t h ec h a n g e sa m o n g e a c h g r o u p s w e l l i n ga n dp a r t i a ld e f l u x i o n o fr e n a lt u b u l a re p i t h e l i a lc e u s d e f l u x i o no f m i c r o v i l l i t h eb r e a k d o w no fn e p h r i ct u b u l e t h ec o n g e s t i v ek i d n e ym e d u l l a a l lt h e c h a n g e so ft h ek i n d e yc o u l db em o r ea n dm o r es e r i o u sf o l l o w i n gt h ei n c r e a s i n g d o s e s p a r t i a lr e c o v e r ya t7 d n e a r i n gt on o r m a l i t ya t1 4 d l u n g n oo b v i o u sc h a n g e s c o u l db ef o u n d h es h o w e dt h a tt h el e u c o c y t e sa n dt h ef o c a li n f l a m m a t o r yn e c r o s i sa t t h es u r r o u n d i n g so f b r o n c h i o l ea n dp a r t i a la l v e o l a rs p a c e s p a r t i a lr e c o v e r ya t7 d n e a r i n g t on o r m a l i t ya t1 4 d c o n c l u s i o n s t h et o x i ce f f e c t so f t h et o l u e n eo nt h em i c ew e r e f o u n da f t e ri n t r a p e r i o n e a li n j e c t i o n l ds 0 1 7 8 2 3 8m g k g t h ed e c r e a s i n go ft h e m i c ea u t o m a t i ca c t i v i t i e s o o 0 5 t h e r ew e r es o m ei n j u r i e so ns o m ei m p o r t a n t o r g a n ss u c ha s l i v e r h e a r t k i d n e y l u n gi nd i f f e r e n tl e v e l s e s p e c i a l l yo nt h el i v e r t h ed e a t hc a u s eo fm i c em i g h tb eo w e dt ot h em o s fw i t hc e r e b r a le d e m a t o x i c i n j u r i e so f l i v e ra n dh e a r t s w e l l i n gc e i l sa n dv a c u o t u sd e g e n e r a t i o no f t h eb r a i n k e yw o r d s t o l u e n e m o u s e a c u t et o x i c l d s o a u t o m a t i ca c t i v i t y i m m u n o h i s t o c h e m i s t r y a b c c e r e b r a l i v e r h e a r t k i d n e y l u n g h i s t o p a t h o l o g y 8 一 安徽医科大学硕士学位论文 小鼠甲苯急性毒性实验研究 引言 1 1 甲苯的用途及造成的环境污染 甲苯 t o l u e n e 是芳香族化合物的重要成员 分子式c h a 是无色有芳香气 味的液体 主要来源于石油的催化重整 工业应用广泛 主要作为燃料和化工用 燃料用甲苯主要作为汽油的添加成分 以提高汽油的辛烷值 化工用一是用于生 产苯和二甲苯 一是作为有机溶剂 甲苯与苯有相似的有机溶解性能 毒性小于苯 在工业上常取代苯而被广泛 应用 导致甲苯的产量及消费量逐年增加 据统计 我国1 9 9 0 年的甲苯生产量为 4 2 万吨左右 1 9 9 9 年增长8 0 而消费量已达到1 0 0 万吨 除在工业上应用 现在室内装修中甲苯的污染严重 目前室内装饰中多用甲苯代替纯苯作各种胶油 漆涂料和防水材料的溶剂或稀释剂 如油漆 清洁剂 粘胶等 因甲苯的过量暴 露 已造成多起因装修而引起的甲苯急性中毒事件 另外随着甲苯工业的迅速发 展 从事甲苯及其相关行业人数急剧增加 职业性甲苯中毒事件及生活中甲苯中 毒时有发生 随着汽车使用的普及 汽车尾气中甲苯的空气污染越来越严重 现 在甲苯除作为职业性污染指标以外 也作为室内空气污染指标之一 在排污物中 如有甲苯即会污染水源 由此可见其污染的程度及范围越来越严重 其引发的环 境问题及毒性危害正在引起人们的重视 1 9 9 9 年7 月在北京市一座建筑工地发生 了 起作业工人使用稀释剂导致甲苯急性中毒事件 造成1 9 人中毒 死亡2 人的 严重后果 1 2 0 0 5 年8 月四川省成都一家皮鞋厂发生因打开几十公斤重粘鞋胶水 密封造成挥发 5 6 名工人立刻出现双手不停颤抖 浑身抽搐 昏迷等甲苯急性中 毒症状被紧急送往当地医院 经诊断为甲苯中毒 随着生活水平的提高 有家装 杀手之称的甲苯等苯的同系物对普通居民特别是妇女儿童的伤害也越严重 有媒 体报道 在患白血病的儿童中 有9 0 家里在近期装修过 仅北京市每年因有毒 9 一 安徽医科大学硕士学位论文 建筑装饰材料引起的急性中毒事件就有4 0 0 多起 中毒人数1 0 万人 死亡人数达 3 5 0 人 慢性中毒达1 0 万人次 1 1 2 甲苯的急性毒性 甲苯的毒性可分为两个方面 急性毒性和慢性毒性 急性甲苯中毒是指短期 内大量接触甲苯所引起的 以中枢神经系统的麻醉作用为主要临床表现的全身性 疾病 根据国家标准 u d c6 1 3 6 3 2 g b 5 0 4 4 8 标准将甲苯定级在i 级 中度危害 急性中毒状况表现为偶可发生中毒 实验动物有致癌性 1 人在短时间内吸入高浓度的甲苯时 会出现中枢神经系统麻醉作用 轻者有 头晕 头痛 恶心 胸闷 乏力 意识模糊 严重者可致昏迷以致呼吸 循环衰 竭而死亡 且有吸入甲苯经临床和毒理 1 研究证实其主要表现为急性中毒性脑病 脑水肿 出现不同程度的意识及精神障碍 急性甲苯中毒可引起神经系统不可逆 的损伤 出现各种症状 厌食 记忆减退及共济失调等小脑症状 患者有乏力 肢体麻木 四肢末端呈手套 袜套样触痛觉减弱或消失的表现 有研究报道 1 甲苯 在抑制突触传递的过程中可不伴有中枢神经系统形态改变 说明在发生器质性改 变前 可有功能改变或生化改变的预兆 b o e y 等研究表明对人群行为影响表现为 急性毒性低 动物中枢神经系统的作用呈双相反应 低浓度时表现为兴奋 高浓 度表现为抑制 甲苯对肝脏的损害 临床可出现消化道功能障碍 黄疸及肝大 肝功能异常 血胆红素增高 凝血酶原时间延长 肝穿刺组织学检查可见肝细胞变性坏死 3 组 织病理学研究死亡动物发现肝细胞脂肪变性 肝窦内可见脂质空泡 并随剂量增 加而变化显著 n e e b a hm 等研究发现甲苯 2 3 m m o l k g 体重 可抑制大鼠肝 细胞转运和蓄积胆汁酸的能力 导致血清中t b a 浓度升高 亚急性毒实验表明 1 可导致肝细胞合成蛋白质能力下降及胆汁酸代谢紊乱 肝细胞的通透性增加 使 血清中a s t a l t 及l d h 等酶活性升高 对心脏的影响 心电图可见窦性心动过 缓或过速 p r 间期延长及房室传导阻滞 s t t 改变 临床突然死亡可能是由于完 全性房室传导阻滞或心室颤动所致 急性毒性实验 可见心肌轻度脂肪变性 伴 安徽医科欠学硕士学位论丈 灶性凝周性坏死 甲苯的肾毒性主要为 少尿型和非少尿型急性肾功能衰竭 其 机制可能为甲苯导致横纹肌溶解而出现肌球蛋白血症 产生肾小管损失为主的肾 损失和肾功能衰竭 肾活检可见肾小管袢区损失伴有细胞管型 尿马尿酸明显增 高 血液中有大量苯甲酸及马尿酸形成 另外 急性甲苯中毒有因大面积皮肤 灼伤引起急性肾功能衰竭及d i c 的报告 唐文娟 6 3 等实验发现雌性小鼠对混苯 的毒性作用较雄性小鼠敏感 可能是雌性小鼠内的脂肪含量与体重比例高于雄性 具有强的亲脂性 使得其在雌性体内易于蓄积或存留时间长有关 也可能是由于 雌性激素对某些酶活性的影响使其在雌性体内的生物转化与雄性不同 从而导致 其在两性间的差异 吸入甲苯可导致支气管炎 肺炎 肺出血及肺水肿 急性中 毒实验 可见肺组织淤血 出血明显并随剂量增加而严重 甲苯的急性高浓度接 触和吸入 会引起皮肤粘膜损害及呼吸道损伤 轻者出现颜面潮红 结膜充血 咽痛等 重者可引起接触性皮炎 皮肤灼伤 角膜上皮脱落或疱性角膜炎 另有报道 甲苯急性毒性可导致胎儿先天性缺陷 即畸形 女性对苯及其同 系物危害较男性敏感 甲苯 二甲苯对生殖功能亦有一定影响 但对此未做急性 毒性的研究 急性甲苯中毒能引起不同程度的肝 肾 肺等器官损伤 严重者常因多器官 功能衰竭而死亡 1 3 甲苯急性毒性的研究意义 目前国内外对于甲苯的急性毒性研究不完整 主要集中在中枢神经系统的损 伤上 或是与其他芳香烃的联合毒性 对于甲苯急性毒性对代谢器官损伤的研究 很少 甲苯的产量及消费量逐年增加 结构稳定且有毒性 很难被降解处理 随 之引发的环境问题越来越严重 对于甲苯类 低毒 或 无毒 物质毒性研究也 将提到议事日程上 以便更好的规范生产 使用和防护 本实验通过小鼠腹腔注射建立甲苯急性中毒模型 观察其毒性行为表现 判断急性毒性 得到小鼠腹腔注射l d s o 通过脑 肝 心 肾 肺组织切片的 h e 染色 了解观察组织病理学形态变化 探讨其急性毒性机制及死亡原因 通 1 1 安徽医科大学硕士学位论丈 过脑切片的免疫组织化学法 观察c h a t g a b a g t u 的表达 研究甲苯的急性 毒性有利于清楚认识甲苯的急性毒性机制 了解急性毒性对不同脏器的危害是否 存在差异 死亡的原因 提高对急性毒性的认识 为对症解毒提高理论依据 拿 出有效的针对性揞施 降低其危害程度 并在认识其急性毒性危害的基础上 建 立预防或控制甲苯急性毒性的方法 第一部分急性中毒的行为表现 分5 个剂量组小鼠腹腔注射制作甲苯急性中毒模型 观察甲苯急性中毒的一 般行为表现 神经行为学改变 并通过不同组中毒小鼠死亡数确定甲苯急性毒性 的急性剂量一效应关系 死亡 得出l d5 0 2 材料和方法 2 1 主要试剂和设备 1 甲苯分析纯 合肥工业大学化学试剂厂 批号 2 0 0 5 0 6 1 2 2 1 0 0 1 a l 微量注射器 3 程控自主活动箱 型号z i l 2 医科院药研所制 4 程控h w 水迷宫 型号s m g 2 医科原油研所制 2 2 动物饲养 健康昆明小鼠 体重2 0 a 2 9 普通级 安徽医科大学动物中心提供 分组前大 笼饲养 分组后小笼饲养 定量给食 昼夜自然交替 2 3 动物筛选 童壁垦登垄兰塑主兰堡垒查 一 方法 自主活动性筛选及水迷宫筛选 操作步骤是在注射前3 天通过程控自 主活动箱及h w 水迷宫训练一周 水迷宫参照系不变 水温保持在2 0 2 2 c 自主 活动箱记录1 8 0 s e e 小鼠活动次数 每天训练一次 水迷宫记到终点的时间 每天 训练2 次 每次训练4 回 每天记录最后一回结果 每次训练时间安排在1 0 a m 与4 p m2 f 日q 先进行自主活动性筛选 再进行水迷宫训练 筛选结果水迷宫训练结果呈现潜伏期时间逐步缩短的趋势 自主活动开始阶 段轻度下降 第五次后基本无变化 按第五次结果9 0 区间去除两端极值 筛选 出9 0 只 2 4 动物分组 小鼠适应环境1 w 经过水迷宫进行筛选取健康小鼠为实验对象 雌雄各半随 机分为6 组 n s 组 甲苯组8 0 0 0m g k g 4 0 0 0m g k g 2 0 0 0m g k g 1 0 0 0m g k g 5 0 0 m g k g 剂量组 每组1 5 只 2 5 甲苯染毒 根据小鼠体重计算甲苯体积后用l o o 1 微量注射器取分析纯甲苯腹腔注射 甲苯组剂量分别为8 0 0 0m g k g 4 0 0 0m g k g 2 0 0 0 m g k g 1 0 0 0m g k g 5 0 0m g k g n s 组取2 0 0 0m g k g 组等体积的n s 腹腔注射 停针1 0 s e e 注射后放入小箱 2 6 一般表现观察 观察指标有 反应体位异常 叫声异常 对外界刺激反应性 肌肉张力 运动状态 毛色被毛蓬松 竖毛 植物神经表现流涎 出汗 呼吸状态呼吸方式 呼吸困难 过速 衰竭 食欲有 无 死亡情况首次出现死亡时间 死亡状态 死亡数 13 童竺垦壁垄堂堡主芏堡笙查一 消化系统腹部外形 粘膜结膜 2 7 神经行为学观察 于注射后4 d 6 d 8 d 1 0d 1 2 d 1 4 d9 a m 运用程控自主活动箱检测 记录 3 m i n 内小鼠活动次数 2 8i d5 0 记录甲苯剂量组小鼠死亡时间和数量 观察小鼠死亡情况 根据死亡数目及 剂量 本实验结果符合使用改进寇氏法公式l gl ds o x m d p 0 5 l d5 0 的 9 5 c i 可信区间 l g 1 x 5 0 士1 9 6 s x 5 0 其中x 为最高浓度的对数 d 为 相邻两组剂量对数差值 p 为死亡率之和 得出l d5 0 2 9 行为学数据处理 使用s p s s l1 5 软件进行a n o v a 检验 3 结果 3 1 一般表现 甲苯组的毒性随剂量增加而死亡数整加 毒性后果严重 染毒后持续观察8 h 各甲苯组均无进食 饮水行为 反应迟钝 聚团静伏 呼吸弱 眼部分泌物增多 3 d 开始部分进食 但反应迟钝 4 d 开始活动增多 逐渐恢复正常 7 d 与n s 组相 比正常 体重增长7 d 较n s 组少 甲苯组 8 0 0 0m g k g 剂量组直接为抑制状态 表现为扭体 后肢强直 眯眼 短暂旋 转扭动后静伏 对外界刺激无反应 出汗 呼吸急促后转衰弱 眼部有分泌物 有轻微竖毛现象 1 5 m i n 出现死亡 2 h 全部死亡 死亡状态僵伏 腹腔有轻微鼓胀 1 4 一 安徽医科大学硕士学位论文 4 0 0 0m g k g 剂量组直接为抑制状态 表现为扭体 后肢强直 眯眼 短暂旋 转扭动后静伏 对外界刺激无反应 出汗 呼吸微弱 眼部有分泌物 1 5 m i n 左右 出现死亡 死亡小鼠全部出现在2 d 内 2 d 后小鼠不再死亡 7 d 未死亡小鼠出现 眼部疾病 失明 图2 2 0 0 0 m g k g 短暂兴奋后转入抑制状态 对外界刺激无反应 出汗 呼吸微弱 眼部有分泌物 部分小鼠出现面部挠毛现象 半小时左右既有小鼠死亡 小鼠死 亡主要出现在3 d 内 4 d 后不再有死亡 1 0 0 0 m g k g 剂量组兴奋时间略长 然后转入抑制状态 对外界刺激无反应 出 汗 呼吸微弱 1 个半小时左右出现个5 t 1 1 1 鼠死亡 2 d 无死亡 3 d 开始进食 5 0 0 r a g k g 剂量组兴奋较前几组又有延长 但也进入抑制状态 无死亡 出现 面部挠毛现象 3 d 开始进食 上述具体结果统计数据见表1 一l 表l 一1 腹腔注射甲苯小鼠急性毒性死亡 t a b l 1t h ea c u t et o x i cd e a t ho f m i c ea f t e ri n t r a p c r i o n a li n j e c t i o n 1 0 0 01 58 5 2 0 0 0j 52 5 4 0 0 01 51 5 4 6 1 l l 2 4 8 1 3 2 6 7 5 3 3 8 6 7 8 0 0 0 1 5 1 5 1 5 一 一 1 5 1 0 0 4 h 内死亡 2 h 内全部死亡 3 2 神经行为学表现 小鼠甲苯染毒各组与n s 组比较均有差异 p 0 0 5 2 0 0 0i r 啦g 与1 0 0 0 m g 限g 5 0 0m g k g 5 0 0 r a g g 组比较有差异 p o 0 5 表1 2 室整垦翌垄兰堡主兰堡垒查 表1 2 甲苯自主活动实验结果 x 土s t h b l 2t h er e s u l to f t h ea u t o m a t i ca c t i v i t i e s 组别 m 班g 4 d 6 d8 d l o c l1 2 d1 4 d 2 0 0 05 1 7 l 士3 0 4 8 7 9 8 6 士6 4 4 7 2 8 0 士3 7 0 6 8 8 0 士5 5 4 6 5 8 0 t 3 7 0 6 3 8 0 a 3 7 0 1 0 0 0 7 3 8 2 士4 9 6 69 3 2 7 士6 9 98 5 7 l 8 28 7 5 7 8 4 4 8 0 7 1 1 4 5 4 7 8 5 7 t 3 3 1 5 0 08 44 7 l 4 0 2 8 9 5 3 士7 0 38 2 3 0 士4 1 47 6 7 0 士4 7 9 7 4 9 0 j 3 6 0 7 4 9 0 土3 11 n s1 0 7 4 0 6 4 9 1 0 8 0 7 士4 1 7 1 0 9 2 0 8 8 2 1 0 8 2 肚4 7 3 1 0 8 9 0 j 4 7 7 1 0 8 4 肚3 3 1 注 组间两两比较有差异 p o 0 5 不同时闻点两两比较有差异 p 0 0 5 3 2 急性剂景一效应关系 死亡 l o 根据公式计算得出 l d5 0 1 7 8 2 3 8r a g k g sl gl d5 0 0 0 6 0 2 l d5 0 的标准 误 l d5 0 9 5 c i 1 3 5 8 3 12 3 3 8 8 4 m g k g 表i 3 表1 3 腹腔注射甲苯小鼠急性毒性l d5 0 t a b l 3l d 5 0o f t h em i c ea f t e ri n t r a p e r i o n a li n j e c t i o n l1 55 0 000 02 6 9 90 0 0 0 21 51 0 0 042 6 7 3 0 0 00 0 7 1 31 52 0 0 08 5 3 33 3 0 10 2 8 4 61 5 4 0 0 01 38 6 73 6 0 20 7 5 2 51 58 0 0 0 1 51 0 0 0 3 9 0 31 1 6 安徽医科大学硕士学位论文 第二部分急性中毒组织病理学变化 在前面研究发现甲苯对小鼠在神经行为 呼吸系统等方面具有毒性作用 甚 至导致小鼠的死亡 为了探讨急性毒性的机制和死亡原因 进行小鼠甲苯急性中 毒模型的不同时间点 不同剂量组的脑 肝 心脏 肾 肺等组织的形态学观察 2 材料与方法 2 1 组织标本选取 l d 7 d 取2 0 0 0 m g k g 1 0