【毕业论文】医学类少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定、细胞体外缺氧模型建立.pdf

福建医科大学 硕士学位论文 少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定 细胞体外缺氧模型建立 姓名 杨晖 申请学位级别 硕士 专业 人体解剖与组织胚胎学 指导教师 王玮 20081001 少突胶质细胞体外培养纯化及鉴定 细胞体外缺氧模型建立 中文摘要 目的 1 观察体外培养少突胶质细胞的增殖和分化 观察其生物学特性 探讨获得细 胞纯度较高的实验方法 为少突胶质细胞损伤后髓鞘形成障碍或脱髓鞘疾病 的研究奠定基础 2 建立体外少突胶质细胞缺氧培养模型 方法 1 取新生s d 大鼠脑皮质进行体外培养 根据星形胶质细胞和少突胶质细胞生 长时间差异 细胞生长方式及细胞对培养层粘附等特性的不同 采用两次恒 温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养 倒置显微镜结合免疫荧光染 色法鉴定细胞种类并判断纯度 2 缺氧联合低糖培养建立细胞体外缺氧培养模型 透射电镜观察细胞超微结 构 结果 1 获取高纯度的大鼠少突胶质细胞 少突胶质前体细胞祖细胞a 2 8 5 阳性 成 熟少突胶质细胞半乳糖脑苷脂阳性子 2 缺氧培养2 d 时细胞变化不明显 但缺氧培养6 小时 细胞存活率明显下降 并且随着缺氧时间延长存活细胞更少 凋亡细胞更多 至缺氧培养1 0 t 时 大多数细胞破碎 结论 1 两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少 突胶质细胞 2 低糖联合缺氧培养模型可以建立可行的少突胶质细胞体外缺氧模型 关键词 少突胶质细胞细胞培养细胞分离鉴定缺血 缺氧 2 t h ep u r i f i e dc u l t i v a t i o na n di d e n t i f i c a t i o na n do x y g e nd e p r i v a t e d c u l t i v a t i o no fo u g o d e n d r o c y t e sf r o mn e o n a t a lr a tc e r e b r u m a b s t r a c t o b j e c t i v e t oc u l t u r e p u r i f ya n di d e n t i f yt h ea s t r o c y t e sa n do l i g o d e n d r o c y t e sf r o m r a tc e r e b r a lt i s s u e a n dt os t u d yt h ei n f l u e n c eo fo x y g e na n dg l u c o s ed e p r i v a t i o no n 0 2 a p r o g e n i t o r s m e t h o d sb a s e do nt h ed i f f e r e n tp r o p e r t i e so fc e l l u l a ra d h e s i o n s d e v e l o p m e n t a l t i m e c o u p e sa n dg r o w t hp a t t e r no fa s t r o g l i a lc e l l sa n do l i g o d e n d r o c y t e s a s t r o c y t e s a n do l i g o d e n d r o c y t e sw e r ec u l t u r e da n dp u r i f i e db yt w i c eo r b i t a ls h a k i n g a n d i d e n t i f i e db yi m m m u n o f l u o r e c e n c et e c h n i q u e 0 2 ap r o g e n i t o r sw e r ec u l t u r e di n o x y g e nd e p r i v a t i o nc o m b i n i n gw i t hl o wg l u c o s em e d i u mt om i m i ch y p o x i ci n j u r y e l e c t r o n m i c r o s c o p ew a su s e d t o s t u d y t h eu l t r a s t r u c t u r a l c h a n g e so f0 2 a p r o g e n i t o r s r e s u l t s 1 a s t r o c y t e sa n do l i g o d e n d r o c y t e si nm i x e dc u l t u r ea p p e a r e db e t t e r g r o w t ha n dd i f f e r e n t i a t i o nt h a nt h er e s p e c t i v e l yp u r i f i e dn e u r o g l i a l e s p e c i a l l yf o rt h e o l i g o d e n d r o c y t e s 0 2 a p r o g e n i t o r s w e r e a 2 8 5 一p o s i t i v e t h e m a t u r e o l i g o d e n d r o c y t e sw e r eg a l p o s i t i v e 2 e l e c t r o nm i c r o s c o p es h o w e dab u n d l eo f f i l a m e n ti nt h ec y t o p l a s m ao f0 2 a p r o g e n i t o r s t h en u m b e ro fa p o p t o t i c0 2 ac e l l s i n c r e a s e da f t e ro x y g e nd e p r i v a t i o nc o m b i n e dw i t hl o wg l u c o s ef o r6h o u r s a n dt h e a p o p t o t i cc e l l si n c r e a s e dw i t ht i m ed e p e n d i n g m o s tc e l l su n d e r g on e c r o s i sa f t e r c u l t u r i n gi no x y g e nd e p r i v a t i o nc o m b i n e dw i t hl o wg l u c o s em e d i u mf o r10h o u r s c o n c l u s i o n s 1 h i g hr a t i o so fp u r i f i e do l i g o d e n d r o c y t e sc a nb eo b t a i n e db yt w i c e o r b i t a lm a k i n ga n dp r o p e rc u l t u r em e d i u m 2 o x y g e nd e p r i v a t i o nc o m b i n e dw i t h l o wg l u c o s eo n0 2 ac u l t i v a t i o nc a nm i m i ct h ei s c h e m i c h y p o x i cc h a n g e so n0 2 a p r o g e n i t o ri nv i v o k e yw o r d s o l i g o d e n d r o c y t e c e l lc u l t i v a t i o n p u r i f i c a t i o n i d e n t i f i c a t i o n i s c h e m i a h y p o x i a 3 英文缩写 b d n f c n s c n t f c s p g s d m e m e g f b f g f f b s g d n f g a l i g f m a g n g f n r g n t 0 2 a o m g p p d g f p b s r g c s t g f 英文缩略语表 a b b r e v i a ti o n 英文全称 b r a i n d e r i v e dn e u r o p h i cf a c t o r c e n t r a ln e r v o u ss y s t e m c i1i a r yn e u r o p h i cf a c t o r 中文全称 脑源性神经营养因 子 中枢神经系统 睫状神经营养因子 c h o n d r o i t i ns u l f a t e硫酸软骨素蛋白多 p r o t e o g l y c a n s 糖 d u l b e c c o sm o d i f i e de a g l e sm e d i u m 改良的e a g l e 培养 d u l b e c c o基 e p i d e r m a lg r o w t hf a c t o r 表皮生长因子 b a s i cf i b r o b l a s t g r o w t hf a c t o r f e t a lb o v i n es e r u m 碱性成纤维生长因子 胎牛血清 g l i a lc e l ll i n e d e r i v e dn e u r o p h i c 胶质细胞源性生长 f a c t o r因子 g a l a c t o c e r e b r o sid e半乳糖脑苷脂 i n s u li n l i k eg r o w t hf a c t o r胰岛素样生长因子 m y e l i n a s s o c i a t e dg l y c o p r o t e i n 髓磷脂相关糖蛋白 n e r v eg r o w t hf a c t o r n e u r e g u li n n e u r o f a c t o r 0 li g o d e n d r o c y tt y p e2a s t r o c y t e p r o g e n i t o rc e l1 o li g o d e n d r o c y t em y e li n 1i p o g l y c o p r o t e i n p l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r p h o s p h a t e b u f f e r e ds a l i n e r e t i n a lg a n g l i o nc e l l s t r a n s f e rg r o w t hf a c t o r 神经生长因子 神经调节素 神经因子 少突胶质细胞一2 型 星形胶质祖细胞 少突胶质细胞髓磷 脂糖蛋白 血小板源性生长因 子 磷酸缓冲盐溶液 视网膜神经节细胞 转化生长因子 学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人郑重声明 所呈交的学位论文 是本人在导师的指导下 独立进行研究j 1 作所取得 的真实成果 除文中已注明引用的内容外 本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写 过的作品成果 对本论文的研究做出重要贡献的个人和集体 均已在文中以明确方式标明 本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担 作者签名 手写 埤 导师签名 手写 j 啦 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留 使朋学位论文的规定 同意学校保留并向国家 有关部l j 或机构送交论文的复印f 和电子版 允许论文被夯阅和借阅 本人授权福建医科大 学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索 可以采j j 影印 缩印或扫 描等复制手段保存和汇编本学位论文 保密的学位论文在解密后适用本授权j 侈 作者签名 手写 导师签名 手写 年 上月 l 日 前言 少突胶质细胞 o l i g o d e n d r o c y t e 是中枢神经系统 c n s 成链鞘细胞 其 前体细胞 0 2 a 祖细胞 来自室管膜下区 随着中枢神经系统的发育 逐步迁 移到白质 增殖 分化 形成髓鞘包裹神经元轴突 少突胶质细胞在发育过程中 大体经历了少突胶质细胞 i i 型星形胶质前体细胞 p r e o l i g o d e n d r o c y t e t y p e i ia s t r o c y t e p r e0 2 a 0 2 a 未成熟少突胶质细胞和成熟少突胶质细胞五个阶 段 l 其形态 表达产物和功能呈现一个渐变及连续的过程 并没有严格的界限 中枢神经系统的细胞由神经元和胶质细胞组成 胶质细胞又包括星形胶质细 胞 少突胶质细胞和小胶质细胞 长期以来 认为少突胶质细胞的主要功能就是 形成中枢系统轴突的髓鞘 营养和保护轴突 但近年的研究发现少突胶质细胞尚 有为中枢神经系统提供神经营养因子和生长因子 表达轴突生长抑制分子等其它 作用 在临床上 少突胶质细胞与多发性硬化症 脊髓损伤等中枢神经系统疾病 关系密切 在组织学上 视神经与脑实质中的白质或脊髓中的白质相似 神经纤维表面 没有s c h w a n n 神经膜 但有髓鞘存在 因此 视神经不是一般的周围神经 而 是中枢神经的一个向前突出的神经束 视神经损伤后 出现髓鞘脱失 少突胶质 细胞死亡和髓鞘再生 基因表达变化等病理改变 产生的髓鞘碎片能抑制视神经 轴索再生 少突胶质细胞的抑制特性由特定的抑制分子介导 目前已鉴定的抑制 分子主要有n o g o 髓鞘相关糖蛋i 刍 m y e l i n a s s o c i a t e dg l y c o p r o t e i n m a c 少突 胶质细胞髓鞘糖蛋i 兰t o l i g o d e n d r o c y t em y e l i ng l y c o p r o t e i n o m g p 等 它们通过 同一受体复合体传导抑制信号 阻滞抑制分子及其受体 或调整神经元的内在生 长状态以克服抑制分子的抑制作用 可以促进视神经损伤后再生 近年来的研究表明 中枢神经系统损伤后再生失败与少突胶质细胞有关 少 突胶质细胞产生的蛋白n i 3 5 2 5 0 对中枢神经再生具有强烈的抑制作用 其单克 隆抗体i n 1 可使这种抑制作用消失 视神经再生失败的原因除了与其神经元 r g c s r e t n a lg a n g l i o nc e l l s 再生能力低下 营养因子缺乏有关外 其微环境中存 在着神经生长抑制因子也是一个重要因素 2 1 近1 0 余年的研究发现少突胶质细 胞及髓磷脂对中枢神经的再生具有抑制作用 3 1 1 1 通过体外培养研究可以了解到少突胶质细胞系的存活 增殖 分化以及发育 4 过程中细胞的生物学变化 同时加深理解生长因子 转录因子对细胞系的调节以 及基因的表达 观察不同缺氧时间对少突胶质细胞的损伤作用 为进一步实验提 供切实可行的实验模型 为进一步研究视神经的损伤修复及少突胶质细胞相关疾 病奠定基础 材料与方法 1 实验材料 1 1 实验动物 新生普通级s p r a g u e d a w l e y s d 大鼠 p 2 由福建医科大学实验动物中心 提供 1 2 实验设备 台式高速离心机8 0 0常州国华电器有限公司 超净工作台b c m 1 0 0 0苏州 倒置荧光相差显微镜n i k o n t e 2 0 0 0 s日本 c 0 2 培养箱t h e r m o h e p ac l a s s10 0美国 三气培养箱培养t h e r m o美国 解剖显微镜北京泰克仪器有限公司 3 7 恒温摇床h z p 一2 5 0 型上海精宏 1 3 主要试剂及其配制 1 3 1 主要试剂 t r y p a nb 1 u e t 6 l4 6 s i g m a 新生胎牛血清 fbs hyelone 亚硒酸钠 s i g m a 腐胺s i g m a d 一生物素s i g m a 转铁蛋白 s i g m a t r i t o nx 一10 0 s i g m a 胰蛋白酶 g i b c o 多聚赖氨酸s i g m a 兔抗大鼠l m a g 抗体 s a n t ac r u z 兔抗大鼠半乳糖脑苷脂 g c 多克隆抗体 c h e m i c o n 小鼠抗大鼠a 2 8 5 单克隆抗体 山羊抗小鼠 g m 抗体 t r i t c f i t c 标记山羊抗兔i g g 重组人碱成纤维细胞生长因子 b f g f 重组人血小板衍化生长因子 p d g f a a 1 3 2 主要试剂配制 高糖d m e m h y e l o n e 原装液体型 5 0 0 m l 1 胺4 0 m m 葡萄糖4 5 0 0 m g l r d s o u t h e m b i o t e c h 中杉金桥 r d r d 含h e p e s l5 m m l 谷胺酸 窑 d m e m f 1 2 培养基 h y c l o n e 原装液体型 5 0 0 m l l 含h e p e s l 5 m m l 谷胺酸胺2 5 m m b f g f r d 公司产品 每支含b f g f 冻干粉末2 5 u g p b s 配制1 u 咖1 分装于无 菌e p 管中 一2 0 保存 p d g f a a r d 公司产品 每支含p d g f a a 冻干粉末1 0 u g p b s 配制1 u u 1 分装于无菌e p 管中 一2 0 保存 o 4 t r y p a nb l u e t r y p a nb l u e0 4 9 生理盐水1 0 0 m l 加热至完全溶解 用滤 纸过滤 4 多聚甲醛磷酸缓冲液的配法 多聚甲醛4 0 克 融于0 1 m m p b s 6 0 0 m l 中 搅拌混匀 放入6 0 水浴箱中 并不断搅拌 滴力i i n a o h 使其p h 值在7 2 7 4 并使其变清晰 等多聚甲醛溶解 完全后拿出水浴箱 再b o o 1 m m p b s 4 0 0 m l 定容至1 0 0 0 m l 避光4 c 冰箱保存 2 实验方法 2 1 少突胶质细胞的培养方法 参照m c c a r t h ym 3 方法 结合预实验情况建立 少突胶质细胞的分离培养及纯化方法 具体步骤如下 2 1 1取材 取新生4 8 h 之内的s d 大鼠 7 5 酒精消毒后切开头皮 眼科剪自枕骨大孔向 上剪开颅骨及硬脑膜 取出脑组织 p b s 漂洗后 解剖镜下用显微镊剥除软脑膜 取脑皮质切成小块 放入离心管中 加入p b s 后用吸管轻轻反复吹打 2 1 2 冲洗细胞 制备细胞悬液 1 取上清液 1 0 0 目滤器过滤 6 2 收集过滤液配平后1 5 0 0r m i n 离 5 5 分钟 弃上清液 3 d m e m 培养液l m l 重悬细胞 4 取0 1 m l 细胞悬液滴入血细胞记数板 在倒置显微镜下观察细胞并记数活细胞 的数目 台盼蓝拒染细胞 大多数细胞为单细胞状态 球形 边界清晰 折光 性好 细胞内部背景清晰 不被台盼蓝着色 2 1 3 混合胶质细胞培养 根据上一步经血细胞记数板记数的活细胞数目 调节细胞浓度为1x1 0 6 m l 接种于7 5 m l 预先涂有多聚赖氨酸的培养瓶中 培养基为高糖d m e m 含1 5 f b s 置于3 7 c 5 c 0 2 培养箱中培养 饱和湿度条件下培养3 d 后换液 2 1 40 2 a 纯化及少突胶质细胞诱导分化培养 混合培养7 d 后细胞分二层 经1 5 0 r p m 振荡2 h 去除小胶质细胞 换液 d m e m 高糖含1 5 f b s 孵育4 6 h 后再次1 5 0 r p m 振荡1 5 1 7 h 收集脱落细胞 4 0 0 目滤器 过滤 1 5 0 0 r p m 离 5 8 分钟沉淀其中的少突胶质细胞 在d m e m f 1 2 1 i 1 0 f b s 中以1 0 6 的浓度接种于预先涂有多聚赖氨酸的盖玻片上 可得到纯化的少突胶质 细胞 于纯化培养第l d 收集含有细胞的盖玻片进行免疫荧光染色 2 20 2 a 细胞鉴定 将纯化的0 2 a 祖细胞培养一天后 吸弃培养液 用0 1 m o l l 磷酸缓冲液配制 的4 多聚甲醛固定 用0 2 a 祖细胞特异性抗体a 2 8 5 做免疫荧光鉴定 具体步骤 如下 1 吸弃培养液 用0 0 1 mp b s p h 7 4 含0 1 b s a 轻轻洗涤5 m i n 3 2 4 多聚甲醛室温下固定2 0 m i n 用0 0 1 mp b s p h 7 4 含0 1 b s a 洗5 m i n 3 3 动物非免疫血清 羊 室温封闭4 5 m i n 吸弃多余液体 勿洗 4 加一抗 小鼠抗大鼠a 2 8 5 单克隆抗体 5 u g m 1 湿盒i q 4 c 冰箱中 过夜 5 0 0 1 mp b s p h 7 4 含0 1 b s a 洗5 m i n 3 6 加二抗 山羊抗小鼠i g m 抗体一t r i t c 1 u 1 0 6 c e l l s 湿盒内室温暗 处孵育6 0 m i n 用0 0 1 mp b s p h 7 4 含0 1 b s a 洗5 m i n 3 7 磷酸盐缓冲甘油封片 荧光倒置显微镜观察拍照 使用同一个对比 7 度 同一个曝光时间 空白对照用p b s 代替一抗 其它实验步骤同上 2 3 成熟少突胶质细胞免疫荧光鉴定 将纯化后的0 2 a 祖细胞接种在涂有多聚甲醛的盖玻片进行诱导分化 培养三 天后 吸弃培养液 用0 1 m o l l 磷酸缓冲液配置的4 多聚甲醛 p f a 固定 用 少突胶质细胞特异性抗体半乳糖脑苷脂 g a l a c t o c e r c b r o s i d c g a l 做免疫荧光鉴 定 具体步骤如下 1 吸弃培养液 用冷0 0 1 mp b s p h 7 4 洗5 m i n x 3 2 4 多聚甲醛 p f a 固定3 0 m i n 用0 0 1 mp b s p h 7 4 洗5 m i n x 3 3 0 1 t r i t o n x 一1 0 0 处理1 5 m i n 4 3 h 2 0 2 孵育1 0 m i n 阻断内源性过氧化物酶 5 用0 0 1 mp b s p h 7 4 洗5 m i n 3 6 加一抗 兔抗大鼠g a l 抗体 1 5 0 置湿盒内4 c 冰箱中过夜 7 0 0 1 mp b s p h 7 4 洗5 m i n 3 吹干 8 加二抗 f i t c 标记山羊抗兔i g g 1 2 0 0 湿盒p j 3 70 c 孵育3 0 m i n 9 0 0 1 mp b s p h 7 4 洗5 m i n 3 1 0 5 0 缓冲甘油封片 荧光倒置显微镜观察拍照 使用同一个对比度 同一个曝光时间 空白对照用p b s 代替一抗 其它实验步骤同上 3 细胞缺氧培养模型建立 参 k 照 g o l d b e r gm p 方法建立缺氧模型 原代纯化培养3 d 细胞 培养瓶或培养 板 置三气培养箱培养 培养条件为3 7 c 9 5 n 2 5 c 0 2 培养液为低糖d m e m 培养基 含0 5 f b s 分别培养2 h 4 h 6 h 8 h l o h 对照组细胞继续常规培 养 培养液为高糖d m e m 培养基 含0 5 f b s 培养条件为3 7 5 c 0 2 9 5 空气 结果 1 形态学观察 1 1 混合胶质细胞培养 混合胶质细胞培养3 天后倒置相差显微镜下可见 有两种类型的细胞 多数 的细胞体积较大 胞体扁平 具有较粗的突起 呈片状 胞核较大 圆形 在扁 平细胞表面可见一些体积较小 胞体较透亮呈圆形或椭圆形的细胞 具有单极或 双极的细小突起 培养第7 8 天后倒置相差显微镜下可见 胞体扁平 突起粗 大的细胞长满瓶底 在前者的表面有成堆或呈葡萄串样生长的胞体较小 折光性 强的细胞 图1 1 2 纯化0 2 a 形态观察 从摇床上振荡下来的细胞纯化培养2 4 小时后 细胞成堆聚集形成克隆球 边缘迁移出细胞 图2 3 第2 3 天细胞增殖旺盛 细胞体积较小 胞体较 透亮呈圆形或椭圆形 多数细胞具有双极突起 其突起较细直无分支 图4 5 1 3 诱导分化后细胞形态观察 多数细胞的体积无明显的变化 部分细胞胞体略有增大 细胞突起明显增多 在粗短的初级胞突上 出现茂密的次级胞突且相互交联成蜘蛛网状 图6 7 2 细胞免疫荧光鉴定 2 10 2 a 祖细胞a 2 8 5 鉴定结果 荧光标记呈阳性 红色阳性反应物位于胞体和突起 2 2 少突胶质细胞g a l 鉴定结果 荧光标记呈阳性 绿色阳性反应物位于胞体和突起 空白对照组结果为阴性 3 细胞缺氧培养模型 倒置显微镜观察 0 2 a 纯化培养3 天后 细胞可长满2 5 c m 2 培养瓶的底部 细胞体积小 胞体呈 圆形有强折光性 多数细胞为双极突起 也有部分呈单极突起 少数细胞未见明 显突起 细胞突起较长 突起细直而无分支 图8 缺氧培养l 2 h 细胞形态未 见改变或少数细胞的突起变短 图9 1 0 缺氧培养4 h 部分细胞突起皱缩或断 裂变短 无突起的细胞增多 部分细胞色泽变暗 细胞碎片增多 培养液中悬浮 的细胞及细胞碎片增多 图1 1 缺氧培养6 h 8 h 细胞密度较稀 较多细胞突起 皱缩或崩解 在细胞周围可见崩解的突起碎片 培养液中悬浮细胞和细胞碎片增 多明显 图1 2 1 3 缺氧培养1 0 h 细胞密度明显稀疏 多数细胞脱落或崩解 细胞突起皱缩或崩解 培养液中悬浮细胞及细胞碎片更多 仅少数细胞仍贴壁 图 1 4 9 论文附圈 圈l 混台胶震钿臆培养第七天 x 2 0 0 目20 2 a 祖细臆形成克鏖球 x 2 0 0 雕 睡4 纯化的0 2 a 租鲴胞有单辍或取撮霓起 x 2 0 0 圈50 2 a 祖蛔囊a 2 8 5 标记阳性 2 0 0 毋e 母鼍 鬈荸 参 船 j 毒 0 w 尸 h 口 7 口 p 口一 尊 圈6 培葬虚熟的少突莪履坷臆 x 2 0 0 圈7 步突腔质细胞o c 标记目性c x 2 0 0 图8 映氧培养o 小时的少究胶质细臆 x 1 0 0 圈9 缺氧培井1 小时的少兜晚硬细盥 x 2 0 0 圈1 0 缺氯培井2 小时的少究胶质细臆 2 0 0 圈1n i t 氧培养4 小时的步兜肚质细胞 x2 0 0 蛩挚 a k 隧鬻 麟溪 田1 2 靛氧培养6 小时的少突脏质绷童 x 2 呻 翻 缺轭培养8 小时的步宪腔质细胞 x 2 圈1 4 缺氧培井l o 小时的少究艘质细胞 2 0 0 讨论 1 少突胶质细胞原代培养的建立和意义 少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞 m y e l i n f o r m i n ge e l l 神 经纤维髓鞘的形成是中枢神经系统 c n s 发育成熟的标志之一 在髓鞘形成障 碍等疾病研究中 发现脱髓鞘或再生的轴突能否再髓鞘化是影响神经功能恢复的 重要原因之一 近年来应用细胞替代治疗已成为一大热点m 1 钔 通过体外培养 获得少突胶质细胞 将其移植入髓鞘形成障碍的中枢神经系统内 可揭示髓鞘形 成和再生机制k 1 5 3 这些实验需要大量的少突胶质细胞 因此必须对少突胶质细 胞进行体外纯化和培养 本实验观察到混合胶质细胞原代培养7 天后 贴壁的星形胶质细胞相互融合 形成一层细胞毡 0 2 a 祖细胞则散布其上 因细胞生长缓慢而无法融合 这些表 现是星形胶质细胞和少突胶质细胞的生长特性不同而决定的 也为振荡分离纯化 0 2 a 祖细胞提供了可能 振荡频率是影响细胞分离的重要因素 国内报道多为 8 0 1 2 0 r p m 8 1 2 h 本实验观察到振荡频率在2 0 0 2 5 0 r p m 时间在1 7 1 9 h 可将大部分的少突胶质前体细胞脱离而不会造成星形胶质细胞层的剥脱 条件限定培养基和生长因子的正确使用是神经胶质细胞分离培养成功的关 键 在0 2 a 祖细胞纯化后采用无血清的条件限定培养基加入生长因子p d g f b f g f 来促进其增殖 研究证实有丝分裂原p d g f b f g f 对0 2 a 祖细胞的增殖 起关键性作用 在缺乏p d g f b f g f 的培养基中细胞的增殖能力明显减弱 可 能是由于有丝分裂原通过其受体系统作用于靶细胞 激活细胞膜上酪氨酸激酶受 体 促进细胞周期由g l 期进人s 期使胞细增殖 1 6 在无血清培养基中 加入甲 状腺素 胰岛素 转铁蛋白 腐胺 黄体酮和微量元素硒等 可促使0 2 a 祖细 胞朝少突胶质细胞定向分化 成熟的少突胶质细胞为分裂终期细胞 不具有分裂 增殖能力 在无血清条件下不受影响 而星形胶质细胞具有分裂增殖能力 在此 条件下很难存活 l5 1 本实验采用大鼠大脑皮层的细胞进行混合胶质细胞的原代培养方法 再利用 细胞粘附力 生长速度等生长特性的差异 采用恒温摇床振荡分离法结合条件限 定培养基分离纯化0 2 a 祖细胞 g c 是表达于少突胶质细胞膜以及髓鞘的一种主 1 3 要类脂 它是鉴定少突胶质细胞普遍应用的特异性化学标志物 l7 1 免疫荧光染色 鉴定结果表明纯度超过9 5 近年来采用的多种纯化方法有振荡分离纯化法 密度梯度法 免疫吸附法和 神经干细胞定向分化培养等 前两者获取的细胞纯度较低 后两者要求的条件较 高 操作过程繁杂 而且干细胞完全的定向诱导分化还存在一定的困难 作者认 为适时的原代混合胶质细胞体外培养 大约七八天 星形胶质细胞通过缝隙连 接成层 少突胶质前体细胞迁移至星形胶质细胞层上 因而为通过振荡方法分 离少突胶质细胞系细胞提供了条件 根据细胞自身及对于不同材料贴壁速度的不 同而进行差速贴壁是纯化细胞的方法 可淘汰小胶质细胞 成纤维细胞 少量胞 体较大的星形胶质细胞 少突胶质前体细胞纯化率达9 5 以上 2 低糖联合缺氧培养模型可以建立可行的少突胶质细胞体外缺氧模型 目前国内外多应用无糖或低糖培养基联合缺氧培养造成体外缺氧损伤模型 1 8 1 9 2 0 k e l l e h e rj a 2 1 1 等研究表明星型胶质细胞在高糖无氧 9 5 n 2 5 c 0 2 条 件下 培养4 8 h 以内未见明显的细胞损伤 可是当葡萄糖的浓度下降到生理浓度 时 在无氧条件下培养2 4 h 以内即可出现细胞损伤 可能与缺氧时细胞可以通过 糖酵解提供a t p 有关 缺氧引起0 2 a 细胞凋亡可能通过如下途径 2 2 2 3 2 4 1 1 以谷氨酸受体为主的兴奋性神经递质受体过度活化引起的细胞凋亡 2 缺氧产 生大量的氧自由基 损伤线粒体d n a 激活c a s p a s e 9 启动凋亡反应 3 缺 氧引起c a 2 超载 氧化应激使线粒体通透性改变 导致线粒体膜电位降低 a t p 合成减少而损伤 线粒体膜间室中的c a s p a s e 前体 c a s p a s e 激活剂等潜在的凋亡 诱导因子释放 诱导凋亡 本实验建立了可行的细胞缺氧培养模型 在缺氧培养 6 小时以后0 2 a 即可发生凋亡 并随着缺氧时间的延长而加重 1 4 附圈 实验中所用的主要仪器设备 图1 倒置相差显微镜系统 j 图3c 0 2 培养箱 图2 超净工作台 rj 图4 三气培养箱 图5 立体视显微镜 l 翻j邑 结论 1 两次恒温摇床振荡分离纯化法和条件限定培养基培养可获取高纯度的大鼠少 突胶质细胞 2 低糖联合缺氧培养模型可以建立可行的少突胶质细胞体外缺氧模型 1 6 参考文献 1 a s o uh h a m a d ar m i y a z a k it e ta 1 c n sm y e l i n o g e n e s i si nv i t r o t i m ec o u r s ea n d p a r t t e r no f r a to l i g o d e n d r o c y t ed e v e l o p m e n t j n e u r o s c ir e s 19 9 5 4 0 4 519 一5 3 4 2 s ok f y i ph k r e g e n e r a t i v ec a p a c i t yo fr e t i n a lg a n g l i o nc e l l si nm a m m a l s j v i s i o nr e s 1 9 9 8 3 8 1 0 1 5 2 5 1 5 3 5 3 b a n d t l o wc z a c h l e d e rt s c h w a bm e o l i g o d e n d r o c y t e sa r r e s tn e u n tg r o w t h b y c o n t a c ti n h i b i t i o n j jn e u r o s e i 1 9 9 0 1 0 1 2 3 8 3 7 3 8 4 8 4 c a d e l l id s b a n d t l o w c e s c h w a b m e o l i g o d e n d r o c y t e a n dm y e l i n 嬲一s o c i a t e d i n h i b i t o r so fn e u r i t eo u t g r o w t h t h e i ri n v o l v en e u r i t eo u t g r o w t ht h e i ri n v o l v e m e n ti n t h el a c ko fc n s r e g e n e r a t i o n j e x pn e u r o l 19 9 2 l15 1 18 9 19 2 5 蔡文琴 李海标 发育神经生物学 m 北京 科学出版社 1 9 9 9 1 5 6 1 6 3 6 c a r o n ip s c h w a bm e t w om e m b r a n ep r o t e i nf r a c t i o n sf r o mr a tc e n t r am y e l i n w i t h i n h i b i t o r y p r o p e r t i e sf o rn e u r i t eg r o w t ha n df i b r o b l a s ts p r e a d i n g j jc e l l b i o l 1 9 8 8 1 0 6 1 2 8 1 1 2 8 8 7 s c h w a b m e m y e l i n a s s o c i a t e di n h i b i t o r so fn e u r i t eg r o w t h j e x p n e u r o l 19 9 0 1 0 9 1 2 5 8 c a r o n ip s c h w a bm e a n t i b o d ya g a i n s tm y e l i n a s s o c i a t e di n h i b i t o ro fn e u r i t e g r o w t hn e u t r a l i s e s n o n p e r m i s s i v es u b s t r a t ep r o p e r t i e s o fc n s w h i t em a t t e r j n e u r o n 1 9 8 8 1 8 5 9 6 9 s c h w a bm e r e g e n e r a t i o no fl e s i o n e dc n sa x o n sb yn e u t r a l i z a t i o no fn e u r i t e g r o w t hi n h i b i t o r s as h o r tr e v i e w j jn e u r o t r a u m a 1 9 9 2 9 2 1 9 2 1 10 s c l m e l ll s c h w a bm e a x o n a lr e g e n e r a t i o ni nt h er a ts p i n a lc o r dp r o d u c e db y a na n t i b o d ya g a i n s tm y e l i n a s s o c i a t e dn e u f i t eg r o w t hi n h i b i t o r s j n a t u r e 19 9 0 3 4 3 6 2 5 5 2 6 9 2 7 2 11 b r o s a m l ec h u b e ra b f i e d l e rm e ta 1 r e g e n e r a t i o no fl e s i o n e dc o r t i c o s p i n a l t r a c tf i b e r si nt h ea d u l tr a ti n d u c e db yar e c o m b i n a n t h u m a n i z e di n i a n t i b o d y f r a g m e n t j jn e u r o s c i 2 0 0 0 2 0 2 1 8 0 6 1 8 0 6 8 12 m c c a r t h yk d d e v e l l i sj p r e p a r a t i o no fs e p a r a t ea s t r o g l i a la n d o l i g o d e n d r o g l i ac e l lc u l t u r e sf r o mr a tc e r e b r a lt i s s u e j jc e l l b i o l 19 8 0 8 5 8 9 0 1 3 g o l d m a ns s t e ma n dp r o g e n i t o rc e l l b a s e dt h e r a p yo f t h ec e n t r a ln e r v o u ss y s t e m 1 7 j n a tb i o t e c h n o l 2 0 0 5 2 3 7 8 6 2 8 7 1 14 l e ek h y o o nd oh p a r ky g e ta 1 e f f e c t so f 酉i a lt r a n s p l a n t a t i o no nf u n c t i o n a l r e c o v e r yf o l l o w i n ga c u t es p i n a lc o r di n j u r y j n e u r o t r a u m a 2 0 0 5 5 5 7 5 5 8 9 1 5 何平 沈馨亚 少突胶质细胞增殖和分化的研究进展 j 神经解剖学杂志 2 0 0 0 1 6 2 1 8 3 1 8 8 16 f r a n o s i sl a c h a p e l l e v i r g i n i aa a b r a h i mn q e ta 1 f i b r o b l a s tg r o w t hf a c t o r 2 f g f 2 a n dp l a t e l e t d e r i v e dg r o w t hf a c t o r a b p d g f a b p r o m o t ea d u l ts v z d e r i v e do l i g o d e n d r o g e n s i si nv i v o m o lc e l ln e u r o s c i 2 0 0 2 2 0 3 3 9 0 4 0 3 1 7 伍亚民 马海涵 廖维宏 大鼠星形胶质细胞和少突胶质细胞的纯化培养与 鉴定 j 创伤外科学 2 0 0 0 4 2 0 7 2 0 9 18 r a j a k u m a r a s w a m yn h o s s a i nm s a n d e r sr d f r a n k sn p m a z em n e u r o p r o t e c t i v ei n t e r a c t i o np r o d u c e db yx e o na n dd e x m e d e t o m i d i n eo ni nv i t r oa n d i nv i v on e u r o n a li n j u r ym o d e l s n e u r o s c il e t t 2 0 0 6 4 0 9 2 1 2 8 3 3 19 i i j i m at m i s h i m at a k a g a w ak 1 w a oyn e u r o p r o t e c t i v ee f f e c to fp r o p o f o lo n n e c r o s i sa n da p o p t o s i sf o l l o w i n go x y g e n g l u c o s ed e p r i v a t i o n r e l a t i o n s h i pb e t w e e n m i t o c h o n d r i a lm e m b r a n e p o t e n t i a l a n dm o d eo fd e a t h b r m n r e s 2 0 0 6 10 9 9 1 2 5 3 2 2 0 a r d e s h i r ia k e l l e ym h k o m e ri p h u mp d h e r s o np s m e c h a n i s mo f p r o g e s t e r o n en e u r o p r o t e c t i o n o fr a t c e r e b e l l a r p u r k i n j e c e l l s f o l l o w