FISH技术在血液疾病诊断中的应用PPT课件.pptx

荧光原位杂交 FISH 技术 血液肿瘤诊疗中的应用 一 技术二 质控三 临床应用四 多技术结合应用案例 技术理论 1950 1960 1960 1970 1970 1980 1980 1990 显带时期 非显带时期 1888提出染色体 1914染色体畸变导致肿瘤 1956确定染色体46条 1958应用于血液学 1960发现Ph染色体CML 显带技术高速发展G R 多种血液病相关异常核型被发现 FISH中期 间期 多色FISH 微阵列技术aCGH aSNP CGH技术 分子遗传 细胞遗传学发展简史 FISH技术的发展1990年FISH1992年CGH1996年24色FISH SKY M FISH RX FISH 2001年arrayCGH 技术原理 A G G C T A T T C C G A T A COVALENTBOND F F SpecimenDNA FISHProbeDNA 操作步骤 FISH样本的制备 染色体制备 细胞滴片制备 探针制备 体系 杂交缓冲液 蒸馏水 探针 探针标记杂交 76 变性10min 37 杂交10h 洗脱DAPI 复染荧光显微镜检测结果分析 FISH技术的特点 操作简便 稳定 人员培训较快 方法敏感 特异性好 检测效率高 能迅速得到结果 24小时就可以完成检测 标本来源丰富 细胞不需培养 间期细胞 分裂中期细胞 分化或未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测 可与多种技术结合 细胞形态学 免疫学 流式细胞术 可回顾性分析 可确定恶性细胞的克隆起源或鉴别良恶性细胞 FISH技术的局限性 异常检测取决于能否获得相应探针 三体检测敏感性高于单体或缺失 骨髓 外周血标本较实体瘤 石蜡切片好处理 不能检测全基因组异常 间期FISH FISH主要仪器 FISH分析工作站 荧光显微镜 分析照相软件 荧光原位杂交仪 恒温水浴槽 高速离心机 培养箱 微量加样器pH仪 FISH技术比较 FISH探针种类 着丝粒探针 位点探针 涂染探针 双色单融合探针 额外信号探针 双色双融合探针 正常 异常 双色分离探针 数量 位点探针 人类细胞遗传学命名 nucish CEP8 2 400 nucish BCR ABL 2 400 nucish BCR ABL 3 BCRconABL 2 380 400 nucish MLL 2 400 nucish MLL 2 5 MLLsep3 MLL 1 100 200 nucish CEPX 2 2 CEPX CEPY 1 398 A nucish ABL BCR 2B nucish ABL 2 BCR 3 ABL BCR A ABL BCR B A nucish ABL BCR 3 ABLconBCR 2 B nucish ABL BCR 4 ABLconBCR 3 C nucish ABL 3 BCR 2 ABLconBCR 1 ABL BCR B BCR ABL A C ABL BCR TEL AML1 A nucish TEL 2 AML1 3 TELconAML1 1 B nucish TEL 1 AML1 4 TELconAML1 1 C nucish TEL 2 AML1 5 AML1 TEL AML1 A AML1 TEL B C A B C D5S721 D5S721 D5S721 EGR1EGR1 EGR1 A nucish D5S23 D5S721 1 EGR1 1 B nucish D5S23 D5S721 2 EGR1 1 C nucish D5S23 D5S721 3 EGR1 1 质量控制 质量管理内容 商品探针 自配试剂验证 标准化流程及规范化操作 前处理 实验操作 规范判读标准 建立本实验室判读阈值 建立临床生物参考区间 FISH操作流程 样本制备 细胞 骨髓 外周血 组织等 制片 细胞悬液滴片或石蜡组织切片 预处理 2 SSC 固定液 NaSCN 酶消化 胃蛋白酶 蛋白酶K 变性 温度 杂交 互补结合 温度 洗涤 无附离子溶液 PH 温度复染 DAPIII 读片 荧光显微镜 滤镜 FISH技术要点 样本浓度 切片厚度 细胞状态 充分低渗与固定 制片环境温度与湿度 探针充分混匀 变性液pH与温度 橡皮泥严密封片 洗脱液温度 抗衰变剂 规范判读 规范正常和异常信号 杂交成功率 75 计数数量 方法 单人 分别于不同区域各连续计数200个细胞 双人 每人于不同区域各计数200个细胞 计数规范 信号判读误差 分离信号误判 石蜡切片误差 建立阈值 选取正常样本10 20份建立针对探针的假阳性率 统计方法 x 3SD 分布 95 可信区间 结合临床逐步建立生物参考区间 结果及报告 临床应用 FISH临床应用 检测染色体数目与结构异常 疗效分析 鉴定标记染色体 检测早期复发 鉴定