!Analyst QS操作手册-简体中文版.doc

AnalystQS标准操作手册AnalystQS 文件结构及电脑系统的维护1.1 Analyst QS 程序文件结构。电脑系统为Dell Precision 650 工作站,具有两个硬盘;分别为C盘和D盘。C 盘为Windows 2000系统(或NT4.0 / SP5以上)。 Analyst QS 则被安装在D 盘。在Analyst 子目录下D:Program FilesAnalyst可找到五个子目录。 Bin 目录下包含Analyst QS 的主程序。oMALDI Server 目录下包含控制oMALDI 离子源的程序。 包含在这两个目录下的文件不能够被更改或删除, 否则会影响到软件的功能。 Firmware 目录下包含仪器上系统控制器的软件。Help 目录包含内建的帮助文件。 而Simulation 目录下则包含模拟程序的文件。1.2 Analyst QS Project 文件结构。所有被取得的图谱数据均被储存于D 盘中称为PE Sciex Data 的目录中。 在这个目录里, 所有的数据被划分储存于数个Projects 目录下。 API Instrument 是一个独一无二的Project,不能够被用于一般的扫描工作或是拷贝于其他的Project 下。 它包含所有仪器和软件执行工作时所需要一般信息参数。 只有一般使用者定义的Projects 才可以被用来执行一般的数据采集(Acquisition)。 每个Project 包含数个不同的子目录其包含各种不同的信息数据文件。 在PE Sciex Data 中, 还有一个Workspaces 的目录, 其包含AnalystQS 中的视窗编排。 这对在Data Explore 中显示处理过的定性质谱数据相当有用。Project 目录的典型文件结构如下图:(范例为API Instrument Project)采集方法(Acquisition Methods) - 所有调校(Tune)及批处理(Batch)的采集方法均被储存于这个目录下。 同时,自动校正Q1 与TOF MS 的预设方法亦存于此API Instrument Project。API BioAnalyst - 包含BTB Data Dictionary。csv 文件, 这是预设作为BioAnalyst 运算的文件。 这个目录只有安装BioAnalyst 才会存在。批处理Batch - 储存批处理编辑器(Batch Editor)中产生的批处理样品清单(Batch Sample lists)。Bundler - 一个特殊的程序,用来将所有的采集数据整合成单一的*.wiff 文件。Configuration - 储存硬件配置(Hardware Profiles)的地方。Data - 储存所有被采集的数据。Instrument Data - 一个核心文件叫InstrumentData.ins 存于此, 这个文件包含了所有质量校正资料以及分辨率的参数资料。 强烈建议将这个文件备份。Log - 任何由Analyst QS 产生的文字报告文件均被存于此。Parameter Settings - 所有仪器的电压设定及连结均被储存于这个文件中ParamSettingsdef.psf。 强烈建议将这个文件备份。Preferences -所有的设定(包括parameter, tuning, instrument, processing, appearances 及queue)都被以Tunedata.tun 的形式存于这个目录中。Processing Scripts - 处理数据的小程序被存于此; 这些小程序可在工具列中的Script 下找到。Project Information - 定量设定文件存于此。Quantitation Methods - 储存定量数据的积分方法。Results - 储存定量模式下的结果列表(Results Tables)。Templates - 储存一般的批处理模版。Tuning Cache 临时文件夹，所有在Tune 中由单击Start 而不是Acquire 所得到的采集数据被以日期和时间为档名存于此。 这些文件均可被易名并移动至任何Project 下的Data 子目录。 这里最多只存两个采集数据。1.3 文件及电脑维护。最好每日将电脑重新开机。 同时也建议不要安装其他软件于采集工作站的电脑中,除非绝对需要。 此外BioAnalyst 需要Internet Explorer 5.0 以上作为database searching。每个月做一次:1. 将C:Temp下所有的*.tmp 文件清除,仪器使用频繁则需缩短清除的间隔。2. 将硬盘整理,可使用ScanDisk (Norton Utilities)或是DisKeeper。每六个月做一次:1. 将API instrument Project 下多余的数据删除。2. 备份及删除不再使用的Project。 (我们建议所有的实验室均有自己的备份策略)质量校正及最佳化2.1 优化仪器A.选择和激活硬件配置文件 (Hardware Profile)双击以打开硬件配置编辑器(Hardware Configuration Editor)。选择, 然后单击, 此时被选的图标会变成绿色，表明此硬件配置被激活。然后单击以关闭此窗口B. 建立一个TOFMS 的采样方法(Creating a TOF MS method)。将Project 移至API instrument (这个project 只用作质量校正用)。 单击使仪器由待机(standby)转成准备(ready)状态, 此时可听到Exhaust Gas 喷出的声音。 下一步, 双击以打开一个空白的手动调校方法。 在TOF MS Scan type 模式下选择正离子模式(Positive mode), 设定TOF 扫描范围由1001000 amu 并在Source/Gas 下设定气体及电压值如下图。扫描次数(Cycles)可设为30。在Compound 及Advanced MS 下的参数值可以设定如下。不论何时改变TOF 的扫描范围一定要记得在Advanced MS 下Q1 Transmission Window 中单击。这会自动计算出针对新的扫描范围最佳的四极杆传输率(Optimal Quadrupole Transmission)。Pulser Frequency 应该设定在6.99 kHz。 如果是不同的扫描范围,亦可单击TOF Extraction Parameters 视窗下的键已获取最佳的脉冲频率。 Ion Energy (在Resolution 下)一般已经由工程师最佳化,正常使用下并不需要自行调整。 MCP (Multi-Channel Plate)可设定范围在2100-2600 以决定检测器的灵敏度。 样品的强度较低时可以设定较高的MCP 值。 在校正时为了获取更好的离子统计值, 样品离子的强度应高于60 counts。 同时, 应尽量避免离子强度高于1000 counts 以造成检测器的饱和, 这将会影响质量校正的准确度(Accuracy of Calibration)。 在所有的参数都调整好后, 此采样方法便可以被储存起来便于日后的质量校正。 单击后命名此采样方法, 然后按下OK 即可。C. 启动注射针泵(Starting the Syringe Pump)。以1 mL 注射针取一些TOF MS 的校正标准品。 在此, 我们以ALILTLVS Peptide/CsI 为例。 要启动注射针泵, 在MS Method 下选择Syringe Pump Method。 在这个视窗中, 注射针的内径及流速可被定义。 对1 mL 的注射针而言, 其内径为4.61 mm。 在所有的参数键入正确后,单击以启动针泵。如果在针泵启动后要改变流速, 则在键入新的流速后单击。 一般使用流速5uL/min来做质量校正。D. 最佳化质量峰的形状及分辨率(Optimizing Peak Shape and Resolution)。现在单击开始采样过程, 此时会有两个视窗出现在下方,左方是Total Ion Chromatogram (TIC,总离子流色谱图)而右方是TOF MS 质谱图。所得到的图谱数据可由此观察, 或者你也可以在质谱图中右击鼠标键并点选Open File 以将整个图谱展开。 要放大质谱图的区域, 只要以鼠标在X 轴下方拖拉出所需的区域即可。 要缩小, 则在X 轴下方双击鼠标即可。 放大829 m/z 让同位素的峰也可被看到。 以鼠标突出829 的质量峰。 在View 下选择Graph Info Window。 分辨率及质量峰中心的质量会显示其中。质量峰的形状与分辨率在仪器上可被调整。 打开仪器的前门并记录原始的数值,包括Plate Voltage (PV),Grid Voltage (GV), Focus Control Module (FCM), Mirror Voltage (MIR)及Offset (OFS)。 装机时, 工程师会最佳化所有的电压值包括正离子及负离子(表列于Parameter Settings 中)。最佳化时应注意三件事: 强度(intensity; cts), 形状(shape; 对称symmetry) 以及分辨率(resolution)。 一般的步骤为:1. 设置Duration为10分钟或更长2. 关闭MCA3. 开始采样，并观察829 的质量峰及其同位素峰。4. 调整喷针和气流以使该质量峰的强度稳定于100700 counts 之间以避免检测器饱和的影响。5. 调整GV 直到获取最佳的质量峰形状/分辨率/强度。 开始时用3 V 来调整, 然后用0.5 V 来微调。6. 调整OFS 直到获取最佳的质量峰形状/分辨率/强度。 开始时用1 V 来调整, 然后用0.2 V来微调。7. 接着调整PV 然后再调整GV 直到获取最佳的质量峰形状/分辨率/强度。注意: QSTAR 上的极性控制是由软件来控制, 可以经由Manual Tune 视窗下勾选Positive 或Negative来改变极性。有关TOF 部分的参数(BERTAN Module)并不能由软件控制。 它们均被记录于Parameter Settings 部分并且需要手动调整。质量峰的形状决定于位于质量峰50%的宽度与5%的宽度之比值(peak width at 50 % / peak width at 5% peak height)而且其值必须大于0.35(Tailing Factor; 拖尾系数)。 这些值均可在Graph Info Window 中找到。分辨率在m/z 829应该至少要7000, m/z 132 则应该大于3000。对于829 及132 的强度应该大于60 counts。2.2 手动TOF 质量校正(Manual TOF Calibration):A. TOF MS 模式校正(Calibrating in TOF MS mode)。在仪器得到好的分辨率, 质量峰的形状及强度后,便可以执行质量的校正。 在Advanced MS 下勾选MCA (multiple channel averaging)。 单击以采集约20 个扫描数据。 扫描完成后在质谱图中右击鼠标并点选Open File。在所打开的质谱图中右击鼠标并点选后以下的视窗便出现:在Experimental Mass 中会自动出现所要校正的质量数, 在TOF Calibration 视窗中选择正确的质量参考表(Reference Table)后Theoretical Mass 中便会出现正确的理论质量数。 接着单击以获得新的校正数值(a 及t0), 然后单击以运用新的校正数值。 勾选以将所得的校正数值设定为预设的校正值。 最后单击以存入新的校正数值，点选Tools Settings Instrument Options 可以看到新的校正数值并可将其列出来。B. MSMS 模式下的校正(Calibrating in MS/MS mode)。在此可用Glu1-Fibrinopeptide B 来做校正。 以1 mL 注射针取足量的Glu-Fibrinopeptide 标准品并将之放置于注射针泵上。 将扫描模式(Scan Type)改为子离子扫描(Product Ion)。 在Products of 的视窗中键入母离子的质量数785 并设定TOF 扫描范围为651500 amu (记得在Advanced MS 视窗下用鼠标点一下Suggest 以重设四极杆传输率)。 碰撞气体的数值(在Source/Gas 下CAD 的值)应设为56。 在Resolution 下,将Q1 resolution 改为Low resolution 以打开Q1四极杆的传输率。 这会让离子的C12/C13 同位素通过Q1,以得到较高的离子计数值和额外的带电状态的信息。 最后, 在Compound 下的碰撞能量(Collision energy; CE)可被调整以影响母离子的碎片化程度。 设定CE = 21,扫描次数为100, 单击Start 以开始扫描。放大785 m/z 附近以观察同位素的形态。 此时增加CE, 碎片的程度增加, 在获取较佳的175.1 及1285.5m/z 时的CE 即为最佳的值(CE 35-40)。 改变扫描次数为30, 在Advanced MS 下选取MCA。 储存此采样方法并命名为TOF_Pos_Cal_GluFib.dam。 点选以开始扫描。 取得图谱后再做一次质量校正。其理论质量为(MH+)175.1190 Da 及1285.5444 Da 。C. 为新的校正标准建立一个质量参考文件(Reference File for New Calibration Standard)如果Glu1-Fibrinopeptide B 被经常用来作为校正标准品, 质量参考表的建立会更方便。 选择Tools Settings Tuning Options 点选后再点选并键入Glu-Fibrinopeptide B,然后输入两个质量数175.1190 及1285.5444 如下图。 单击然后关闭视窗即可。2.3 校正小提示基本上每天早晨再使用仪器前都应该做一次校正以确定质量的准确性。 每天的校正动作可提供一般30ppm 以下的准确度(在室温没有明显的改变前提下)。特定离子的强度至少每次扫描60 counts 以上。注意每次扫描特定离子强度不要超过饱和的1000 counts 同时也不要超过总和200 000 counts。可能的话, 用同样的脉冲频率(Pulsar Frequency)扫描并校正。如果需要更好的校正准确度, 外标校正(External Calibration)在分析样品前应该立刻被使用(这可提供510ppm 的准确度) 相对来说, 内部校正(Internal Calibration)能够提供更高的质量准确度(5 ppm)。 一个内标准品(Internal Standard)可被加入样品中,而样品的质谱图可以同时被分析及校正。2.4 附录A. ALILTLVS_CsI TOF 校正材料:碘化铯CsI (Sigma cat# C8643: 25 g)合成肽 cPDI inhibitor (Sigma Cat# A1061, 1 mg) 甲醇 (色谱纯)甲酸 (色谱纯)1. CsI 储备液 (3 x 10-2 M)2. 稀释溶剂: 水 ：甲醇：甲酸 = 49.5 : 49.5 : 13. TOF校正储备液(6 x 10-5 M CsI 及 3 x 10-5 M 肽)将 1 mg 的肽溶于 40 mL 的稀释溶剂中 加入 80 uL CsI 储备液。 4. TOF校正稀释液(6 x 10-6 M CsI 及 3 x 10-6 M肽)将 TOF校正储备液以稀释溶剂稀释 10 倍. 若信号太强, 则再稀释 23 倍。B. Glu1-Fibrinopeptide BSIGMA(cat. # F-3261). 溶于 30% 甲醇/水 + 1%甲酸, 浓度大约在5 pmol/uL 左右. 若使用Nanospray做校正，则浓度需再稀释至约1 pmol/uL 左右。C. Hamilton注射器的内径表D用 Renin Substrate 做MS/MS校正在Mass Standards Test Kit中可以找到，用带三个电荷的母离子m/z 583.3做子离子扫描，以子离子m/z 1028.5312和110.0713做校正。Q2 增强模式3.1 在子离子扫描模式下的 Q2 增强 (Q2 Enhancing).在 Qstar Pulsar 以上等级的机器均可使用 Enhancing (或 Q2 pulsing)的功能. 当 Q2 pulsing 功能被打开, 对特定选定的小质量范围离子的duty cycle (或transmission efficiency)会被增强. 这个增强功能通常只用在窄小的质量范围, 或是增强的范围可设定涵盖整个扫描范围以增加整个范围的灵敏度.第一个例子, 勾选 Enhance all. 这时可在 Advanced MS 窗口中观察到 Q2 transmission 中有五个传输窗口 出现, 并且对每个窗口中的 Q2 pulsing 都已被最佳化. 不需要调整任何值, 单击 Start 开始采集数据. 大约会有2 5 倍的增强.第二个例子, 在 Compound 下输入所需增强的质量数, 如 187, 再单击 Apply 并注意到 IRD 及 IRW 的值已被更改. 这些值是根据质量而定的, 因此 Apply 在每次质量更改时一定要再按一次. 同时注意到 Display Mass 窗口中亦会出现所输入的值. 相对的也可以在 Display Mass 窗口中键入质量并勾选 Enhance. 按下 Start 开始扫描, 一般强度大约会增加 8X 左右. 这对特定信息的采集非常有用。3.2 母离子扫描(Precursor Ion Scanning).当要在一个有特定碎片特征的混合物中找到特定的化合物组成时, 母离子扫描是一个相当有用的工具. 在此举个例子, 母离子扫描要找到一个具有 187 m/z (b2 离子)的肽段. 将 Scan type 改为 Precursor Ion, 标列的参数会随之改变. 母离子扫描为一个缓慢的扫描实验, 故最好尽可能缩小搜寻的范围。母离子扫描时, Q1 会扫描一个指定的质量范围, 离子在 Q2 被撞成碎片, 然后所有的碎片离子会被 TOF 检测器分析。电脑会搜寻每个TOF 扫描以寻找所指定的母离子并以数学运算的方式将信号回归成在 Q1 扫描的母离子质量。在 Advanced 卷标中, 首先设定 Q1 的扫描条件. 将 Scan mode 改为 Profile 并设定间隔(Step Size)为 0.5Da。扫描间隔的增减视所需 Q1 扫描的分辨率和扫描速度而定。在 MS 卷标下, 设 TOF 扫描范围为 100 500 amu， 以含括所要找寻的离子质量, 187.07， 四极杆 的质量 范围应包含所有可能的母离子质量, 这个例子中, 包含 Glufibrino peptide 的双电荷及三电荷离子, 故设定 600 900 amu， 扫描时间 15 秒。 Accumulation Time 为四极杆的有效滞留时间(Dwell time), 时间设得越长, 扫描的时间便越久。在 Precursors of 的部分, 点选 Store Full Product Mass Range 并输入 187; 宽度(width)为 1 amu. 如果有可能其它的碎片离子很接近所设定的质量, 则可以将宽度设得更小. 在 Resolution 下, 分辨率设成 Low. 这可让更多的离子通过 Q1 因而取得较佳的灵敏度, 可是 质量数不会很准确。 若将分辨率改回 Unit 通常会造成灵敏度下降 2 3 倍, 但具有较好的母离子质量准确度。 在 Compound 下的 CE 通常会设得相 当高, 约 55(或更高; 82 / 93), 因为需要获得最大的碎片程度以得到最大的 187.07 信号。 最后, 设定扫描次数为 3，然后开始扫描, 注意所得到的总计数值为三次扫描的累加。Q2 pulsing 的功能最常用于母离子扫描 , 因为唯有在母离子扫描才是真正扫描很小的质量范围. 在此,187.1 离子由 Q2 传输进入 TOF 时会由于 Q2 pulsing 的功能而被增强。 在 Precursors of 的窗口下点选 Enhance. 这将会自动设定 IRD 及 IRW 的值. 不用更改其它的参数, 直接开始扫描. 即可发现 785 得强度增加，一般大约会增加 4 10 倍的强度。3.3 完全储存模式的母离子扫描 Full Store Mode Precursor Ion Scanning.前面介绍的母离子扫描为 Full Store Mode. 这会允许相同扫描的数据中获得更多母离子的信息. 此模式下在特定 TOF 质量范围的所有碎片资料会被储存于一个文件中. 在 Explore 下将此文件打开, 在 TIC 图 中右击鼠标并点选 TOF Precursor Ranges. 其它的母离子质量亦可被输入 , 同时提取离子色谱图 (Extracted Ion Chromatogram (XIC)可由所储存的碎片数据中建立.注意此文件是在 Q2 pulsing 功能打开下得到的, 仅仅小质量范围(100 300 amu)被增强。因此, 其它不在 这个范围的母离子可能不会被看到。QSTAR XL开机步骤此过程适用于仪器被切断电源之后的重新启动1、查看各路气体是否充足Gas1/Gas2Curtain GasExhaust GasVentCAD0.7MPa0.4MPa0.5MPa0.4MPa0.4MPaCurtain Gas不足则仪器会自动停机2、检查电源线已连接在仪器上并打开质谱仪上的电源开关4、打开计算机5、打开其它设备（如LC）QSTAR XL 关机步骤QSTAR XL 关机步骤分为两种情况1日常关机过程为了保持仪器内部的高真空，仪器通常是出于开的状态。所以，当不是用仪器时，只需将仪器设为待机（Standby）状态即可。仪器待机时，系统会处于最低消耗状态 Curtain Gas为最小流量，为了保持Orifice，Skimmer和Q0清洁 Exhaust Gas关闭 离子源，四极杆，TOF等部分的高压设为零，只在检测器上有低电压关机前应等采样过程结束,然后停止样品流入离子源（