出口蜂蜜中稳定碳同位素测定方法 液相色谱元素分析同位素比值质谱联用法编制说明.doc

出口蜂蜜中稳定碳同位素测定方法 液相色谱/元素分析-同位素比值质谱联用法编制说明一、 标准制定的任务来源及意义1、任务来源本标准是根据国家认证认可监督管理委员会下达的任务，名称为进出口蜂蜜中各组分碳同位素比值的检测，计划编号为2011b154，由中华人民共和国江苏出入境检验检疫局负责制定。2、制定标准的意义蜂蜜是蜜蜂采集开花植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜味物质，蜂蜜的成分除了葡萄糖和果糖外，还有多种氨基酸、维生素、生物酶和微量元素等成分，具有优良的营养价值和保健作用，长期以来深受人们的喜爱。近年来国内外蜂蜜掺假程度越来越严重，少数不法商人为了牟取暴利，在纯正的蜂蜜中掺入相对便宜的糖浆。这对我国蜂产品市场造成了极大负面影响，欺骗了广大消费者。因此，开发有效、灵敏的蜂蜜掺假检测方法变得极为迫切。近年来，碳同位素质谱技术逐渐成为目前国际上用于产地溯源和鉴别食品成分掺假的一种直接而有效的工具。植物光合作用中c3和c4两种代谢途径的产物碳同位素比值（13c值）有较大差异，利用这个差异可以通过测定蜂蜜的13c值，能够鉴别蜂蜜（主要含c3植物糖）中是否掺入的c4植物糖浆（如玉米糖浆、甘蔗糖浆）。现在国际上通用的是元素分析仪-同位素质谱法（ea-irms），目前该法已经成为各国蜂蜜检测机构的首选方法1-2。但是这种离线方法只能判定较高含量的c4植物糖掺假水平，对于c3植物糖浆（如大米糖浆、甜菜糖浆）掺假判定存在缺陷。液相色谱-同位素质谱法（lc-irms）的引入为更精确的测定蜂蜜同位素值、判定蜂蜜掺假情况开辟了更为广阔的前景。蜂蜜中各种糖经液相色谱在线分离后，通过irms在线测定各个组分的13c值。这样可以克服之前离线方法的缺点，提高检测方法的灵敏度，并且可以对c3植物糖的掺假进行鉴定。目前国外著名检测机构applica已利用液相色谱/元素分析-同位素质谱法来鉴别蜂蜜的掺假，提出了纯正蜂蜜的同位素比值应该满足的要求5-8，而我国还没有相应的国家标准来鉴别蜂蜜掺假。因此迫切需要制定相应的标准来规范我国的蜂产品市场，同时通过建立不同品种蜂蜜的碳同位素值数据库，为我国有关部门进一步开展蜂蜜的品质、来源以及所标注的产品名称、产地和加工过程的真实性的监管工作提供科学根据和数据基础，在保护消费者利益方面起重要作用。二、编制依据本标准的编制遵循gb/t 1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则和gb/t 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求进行编写制订的。三、标准制定过程本标准起草单位在2011年4月收到认监委的任务下达文件后，成立了标准起草小组，第一起草人任组长，对小组成员进行了分工，并制定了时间进度表（见表1）。本标准起草人通过查询相关资料和文献，结合蜂蜜检测的实际情况，建立了蜂蜜中各组分碳同位素比值的液相色谱/元素分析-同位素质谱测定方法，选取10种不同蜜源的纯正蜂蜜对该方法进行验证，这些纯正蜂蜜样品主要包括实验室的蜂蜜监控样品和购自蜂农的纯正蜂蜜，同时利用该方法对实验室已有的糖浆进行检测。经实验研究验证后，该方法能满足蜂蜜掺假的检测要求。表1 本标准制定工作时间进度安排时间工作内容完成情况2011.4 2011.5查阅并整理相关文献资料，购买标准品或样品；确定标准的技术路线。完成2011.42011.5优化前处理条件和检测条件；对不同蜜源的蜂蜜和糖浆进行检测，进行方法室内和室间验证，起草标准征求意见稿。完成2011.52011.6征求意见，汇总意见，形成送审稿。完成 四、主要试验技术论证本标准利用液相色谱-同位素质谱法和元素分析-同位素质谱法（lc/ea-irms）对蜂蜜中各组分碳同位素进行测定。适用范围包括油菜蜜、洋槐蜜、葵花蜜、椴树蜜、荆条蜜、芦芯蜜、山花蜜、紫云英蜜、荔枝蜜、苹果蜜、苜蓿蜜等11种不同品种的纯正蜂蜜。本标准选取55个纯正蜂蜜进行验证（8个蜂蜜购自于蜂农，11个蜂蜜来自于土畜商会，36个为蜂蜜监控样品）。其中油菜蜜29个，洋槐蜜7个，葵花蜜5个，椴树蜜4个，荆条蜜2个，芦芯蜜2个，山花蜜2个，紫云英蜜、荔枝蜜、苹果蜜、苜蓿蜜各1个。检测每个样品的蜂蜜整体、蜂蜜蛋白质及各种糖的碳同位素值，根据applica实验室提出的判定准则，计算蜂蜜蛋白质与蜂蜜同位素差值13cp-h、果糖、葡萄糖13c值之差13cfru-glu以及各个组分13c最大差值13cmax，根据上述三个参数的阈值来确认蜂蜜是否掺假。同时为了研究不同蜜种纯正蜂蜜混合后的样品是否符合applica实验室提出的判定准则，本标准选取了四种纯正蜂蜜（油菜、洋槐、椴树和葵花）按照不同的比例制备混样，共11个。混合比例见表2。表2、四种蜜种纯正蜂蜜混合比例表样品比例 %油菜-洋槐75-2550-5025-75油菜-椴树75-2550-5025-75洋槐-椴树75-2550-5025-75油菜-洋槐-椴树30-30-40油菜-洋槐-葵花30-30-40同时将一个糖浆与一个纯正油菜蜜按照不同比例混合，利用本标准的方法进行检测，蜂蜜和糖浆混合比例分别是95%/5%，90%/10%，85%/15%。1、元素分析-同位素质谱法（ea-irms）前处理条件的选择元素分析-同位素质谱法用于测定蜂蜜整体同位素值13ch和蜂蜜中蛋白质同位素值13cp。样品中的碳元素经元素分析仪高温燃烧后转化为co2，经过净化和干燥后通过同位素质谱仪测定样品的13c值。本标准的样品前处理主要参照aoac 998.12和gb/t 18932.1-2002进行操作。对于蜂蜜整体13c值的测定，采用微量进样器移取一定量的未稀释蜂蜜于锡杯中即可。蜂蜜中蛋白质13c值的测定时，需要将蜂蜜中的蛋白质提取出后烘干才能进行测定。蛋白质沉淀剂的选取参照上述两个标准，采用钨酸钠溶液和硫酸溶液，确保蜂蜜中蛋白质充分沉淀后，离心弃上清液后加水清洗蛋白质。由于蜂蜜中糖的水溶性大大高于蛋白质的水溶性，反复用水清洗可确保蜂蜜中的糖没有影响蛋白质13c值的测定。将清洗后的蛋白质烘干后碾磨混匀后进行制备，可确保蛋白质13c值测定的取样代表性，从而能获得准确的结果。使用元素分析-同位素质谱测定样品的同时通过测定标准样品的13c值进行质量控制，每个批次的检测样品间隔对标准样品进行测定，确保测得的标准样品的13c值与标准物质证书标注值相差小于0.30 。2、液相色谱-同位素质谱法（lc-irms）测定条件的优化 液相色谱-同位素质谱条件测定蜂蜜样品中果糖、葡萄糖、二糖、三糖碳同位素比值（13cfru、13cglu、13cds、13cts）。样品按照一定浓度稀释后，经液相色谱进行分离，各组分依次被湿法氧化为co2，再通过同位素质谱仪测定各个糖组分的13c值（具体流程见图1）。测定方法主要参考applica实验室的方法。由于本标准测定的是碳同位素比值，因此流动相不能含有有机物和其他含碳的无机盐，本标准采用的流动相为100%超纯水，色谱柱为钙离子交换柱，柱温设置为85以改善分离效果。蜂蜜中各个糖组分的分离是以离子交换作用和体积排阻作用，因此各糖的出峰顺序依次为寡糖、三糖、二糖、葡萄糖和果糖。图1、液相色谱-同位素质谱测定示意图 在进行样品测定前，需要不断调整氧化剂过二硫酸钠溶液和催化剂磷酸溶液的流速，确保氧化炉g中体系的氧化能力能够充分氧化分离后的各个组分。如图1分离后的组分在氧化炉g处于99.9下充分氧化为co2，经过nifon膜后与流动相分离后再经干燥器j充分干燥后进入同位素质谱测得13c值。thermo nc2500 元素分析-同位素质谱仪得到的同位素标准物质图谱、11种纯正蜂蜜13ch和13cp图谱、11个蜂蜜混合样13ch和13cp图谱见图2-23；thermo 液相色谱-同位素质谱仪得到的同位素标准物质图谱、11种纯正蜂蜜色谱图、11个蜂蜜混合样色谱图见图24-46。 图2 标准物质ea-irms色谱图 13ch13cp 图3油菜蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图4洋槐蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图5葵花蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图6 椴树蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图7荆条蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图8芦芯蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图9山花蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图10紫云英蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图11荔枝蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图12苹果蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图13苜蓿蜜ea-irms色谱图13ch 13cp 图14油菜蜜-洋槐蜜(75%-25%) ea-irms色谱图13ch 13cp 图15油菜蜜-洋槐蜜(50%-50%) ea-irms色谱图13ch13cp 图15油菜蜜-洋槐蜜(25%-75%) ea-irms色谱图13ch 13cp 图16油菜蜜-椴树蜜(75%-25%) ea-irms色谱图 13ch13cp 图17油菜蜜-椴树蜜(50%-50%) ea-irms色谱图13ch13cp图18油菜蜜-椴树蜜(25%-75%) ea-irms色谱图13ch13cp图19洋槐蜜-椴树蜜(75%-25%) ea-irms色谱图13ch13cp图20洋槐蜜-椴树蜜(50%-50%) ea-irms色谱图13ch13cp图21洋槐蜜-椴树蜜(25%-75%) ea-irms色谱图13ch13cp图22 油菜蜜-洋槐蜜-椴树蜜(30%-30%-40%) ea-irms色谱图13ch13cp图23 油菜蜜-洋槐蜜-葵花蜜(30%-30%-40%) ea-irms色谱图图24 标准物质lc-irms色谱图图25油菜蜜lc-irms色谱图图26洋槐蜜lc-irms色谱图图27葵花蜜lc-irms色谱图图28椴树蜜lc-irms色谱图图29荆条蜜lc-irms色谱图图30芦芯蜜lc-irms色谱图图31山花蜜lc-irms色谱图图32紫云英蜜lc-irms色谱图图33荔枝蜜lc-irms色谱图图34苹果蜜lc-irms色谱图图35苜蓿蜜lc-irms色谱图图36油菜蜜-洋槐蜜(75%-25%) lc-irms色谱图图37油菜蜜-洋槐蜜(50%-50%) lc-irms色谱图图38油菜蜜-洋槐蜜(25%-75%) lc-irms色谱图图39油菜蜜-椴树蜜(75%-25%) lc-irms色谱图图40油菜蜜-椴树蜜(50%-50%) lc-irms色谱图图41油菜蜜-椴树蜜(25%-75%) lc-irms色谱图图42洋槐蜜-椴树蜜(25%-75%) lc-irms色谱图图43洋槐蜜-椴树蜜(50%-50%) lc-irms色谱图图44洋槐蜜-椴树蜜(25%-75%) lc-irms色谱图图45油菜蜜-洋槐蜜-椴树蜜(30%-30%-40%) lc-irms色谱图图46油菜蜜-洋槐蜜-葵花蜜(30%-30%-40%) lc-irms色谱图五、方法的主要技术指标1、精密度数据选取一个纯正葵花蜂蜜，连续测定10次平行样品，测定室内精密度。室内精密度试验由江苏出入境检验检疫局完成，具体数据见表3。实验数据表明，方法的最大相对标准偏差为0.45%，见表3。2、纯正蜂蜜检测情况本标准选取55个纯正蜂蜜进行验证，检测每个样品的蜂蜜整体、蜂蜜蛋白质及各种糖的碳同位素值，详细结果见表4。根据applica实验室提出的判定准则，若样品同时满足13cfru-glu1.00 、13cmax2.10 和13cp-h-1.00 这三个条件，判定为阴性蜂蜜；若上述三个条件至少一个无法满足，判定为掺假蜂蜜。由表4可见，55个共11种纯正蜂蜜全部符合上述判定准则，13cfru-glu在-0.990.75范围内，13cmax在0.442.07范围内，13cp-h在-0.921.93范围内。3、纯正蜂蜜混合样的检测情况本标准选取11种纯正蜂蜜中的四种，按照不同的比例混合后进行检测，混合比例见表2，一共11个蜂蜜样本。按照本标准的ea-irms和lc-irms法进行检测，详细结果见表5。可见不管是两种纯正蜂蜜混合样本还是三种纯正蜂蜜的混合样本，都完全符合纯正蜂蜜判定准则，13cfru-glu在-0.130.56范围内，13cmax在0.291.80范围内，13cp-h在-0.291.12范围内。4、蜂蜜与糖浆混合样检测情况 本标准选取1个纯正油菜蜂蜜和1种大米糖浆，按照不同的比例混合后进行检测，蜂蜜和糖浆的混合比例依次是95%/5%，90%/10%，85%/15%，一共3个蜂蜜糖浆样本。按照本标准的ea-irms和lc-irms法进行检测，详细结果见表6。可见三种蜂蜜糖浆的混合样本全部不符合纯正蜂蜜的判定准则，为阳性样本，13cfru-glu在0.030.10范围内，13cmax在2.655.89范围内，13cp-h在0.961.32范围内。六、结论综合上述情况，本方法可满足蜂蜜掺假鉴定的要求，适用于11种纯正蜂蜜，同样适用于不同种类纯正蜂蜜的混合蜂蜜，能够有效鉴定碳-3植物糖的掺假，方法的精密度等各项技术指标均符合gb/t 1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则、gb/t 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法的要求。七、参考文献1、 aoac official method 998.12, c-4 plant sugars in honey.2、 gb/t 18932.1-2002, 蜂蜜中碳-4植物糖含量测定方法3、 gb/t 1.1-2000标准化工作导则 第1部分：标准的结构和编写规则4、 gb/t 20001.4-2001标准编写规则 第4部分：化学分析方法5、 michael krummen, andreas w. hilkert, dieter juchelka, et ala new concept for isotope ratio monitoring liquid chromatography/mass spectrometry. rapid commun. mass spectrom. 2004, 18, 22606、 a. i. cabanero, j. l. recio, mercedes ruperez，liquid chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry: a new perspective on honey adulteration detection. j. agric. food chem. 2006, 54, 97197、 lutz elflein, kurt-peter raezke, improved detection of honey adulteration by measuring differences between 13c/12c stable carbon isotope ratios of protein and sugar compounds with a combination of elemental analyzer - isotope ratio mass spectrometry and liquid chromatography - isotope ratio mass spectrometry (13-ea/lc-irms). apidologie, 2008, 5, 5748、 boschker ht, moerdijk-poortvliet tc, van breugel p, et ala versatile method for stable carbon isotope analysis of carbohydrates by high-performance liquid chromatography/isotope ratio mass spectrometry. rapid commun mass spectrom, 2008, 22, 3902表3 葵花蜂蜜的精密度数据（n=10）次数13cfru 13cglu13cds13cts13ch13cp1-24.69-24.92-24.54nd-24.56-22.962-24.72-24.99-24.42nd-24.60-23.023-24.79-24.86-24.59nd-24.45-23.054-24.60-24.79-24.60nd-24.61-22.935-24.58-24.88-24.68nd-24.49-23.106-24.55-24.83-24.42nd-24.63-23.077-24.63-24.86-24.71nd-24.59-22.958-24.78-24.9-24.44nd-24.47-22.929-24.73-24.86-24.69nd-24.70-23.0910-24.77-24.93-24.57nd-24.41-23.12rsd %0.360.230.45-0.380.33表4 纯正蜂蜜的13c值数据source13cfru 13cglu13cds13cts13cfru-glu13cmax13cp-h13ch13cp葵花-24.49-24.69-26.15nd0.202.030.54-24.66-24.12苹果-25.10-25.10-26.42nd0.001.560.12-24.98-24.86油菜-27.34-27.55-26.52nd0.201.170.47-26.85-26.38荔枝-24.53-24.70-24.34nd0.171.000.68-24.38-23.70油菜-26.58-26.76-26.05nd0.181.561.49-26.69-25.20油菜-27.38-27.58-27.96nd0.200.800.17-27.33-27.16油菜-27.68-27.73-28.32nd0.050.64-0.38-27.85-28.23紫云英-23.89-24.37-22.87nd0.482.01-0.92-23.96-24.88油菜-28.86-28.95-28.72nd0.092.071.93-28.82-26.89洋槐-21.66-21.20-21.18nd-0.461.81-0.53-22.46-22.99葵花-24.69-24.92-24.54nd0.231.961.60-24.56-22.96油菜-26.93-27.12-27.78nd0.181.400.38-26.77-26.38油菜-26.51-26.64-27.86nd0.131.910.39-26.34-25.95油菜-27.60-27.67-29.01nd0.061.830.25-27.43-27.18芦芯-24.56-24.69-25.91-25.660.141.35-0.58-24.72-25.29芦芯-24.26-24.30-25.12-24.870.041.420.67-24.38-23.70洋槐-23.83-23.32-25.31nd-0.511.99-0.32-23.70-24.02洋槐-24.27-24.15-25.34nd-0.121.24-0.48-24.10-24.58黄荆条-24.98-24.80-25.55nd-0.181.621.01-24.94-23.93荆条-26.59-26.60-28.62nd0.012.030.14-26.74-26.60油菜-22.69-22.36-23.88nd-0.331.520.20-23.14-22.94油菜-23.68-23.43-24.44nd-0.251.630.85-23.66-22.81山花-22.75-22.26-23.83nd-0.491.57-0.03-22.84-22.87山花-25.69-25.66-25.41nd-0.031.971.76-25.48-23.72油菜-25.95-26.70ndnd0.750.96-0.28-25.74-26.02油菜-27.92-28.28-28.70nd0.361.280.47-27.89-27.42油菜-27.58-27.90-25.90nd0.322.000.52-27.17-26.65油菜-28.34-28.72ndnd0.381.340.45-27.83-27.38油菜-28.26-28.70-29.42nd0.441.740.21-27.89-27.68葵花-24.60-25.03-24.65nd0.430.440.34-24.93-24.59葵花-24.80-24.66-25.76nd-0.141.940.95-24.77-23.82葵花-23.74-24.09-24.64nd0.351.520.92-24.04-23.12苜蓿-24.56-24.57-25.58nd0.011.650.56-24.49-23.93油菜-24.44-24.53-24.59nd0.090.950.87-24.51-23.64油菜-24.36-24.42-25.36nd0.061.821.08-24.62-23.54洋槐-23.50-23.32-23.49nd-0.180.95-0.73-23.54-24.27洋槐-24.12-24.02-25.30nd-0.101.28-0.30-24.26-24.56洋槐-24.58-24.62-24.96nd0.041.620.77-24.11-23.34油菜-27.70-27.8-27.88nd0.100.80-0.04-27.08-27.12油菜-27.70-27.76-27.72nd0.060.600.06-27.22-27.16椴树-24.31-24.51-25.16nd0.201.680.51-23.99-23.48椴树-24.33-24.34-24.64nd0.010.970.57-24.24-23.67椴树-24.50-24.6-25.09nd0.101.590.72-24.22-23.50椴树-24.55-24.64-24.90nd0.091.170.91-24.64-23.73油菜-27.80-28.05-28.01nd0.251.190.93-27.79-26.86油菜-28.03-28.36-28.26nd0.331.490.97-27.84-26.87洋槐-24.66-23.67-24.28nd-0.991.100.18-23.75-23.57油菜-25.74-25.49-26.46nd-0.251.030.04-25.47-25.43油菜-28.02-28.16-28.10nd0.141.791.42-27.79-26.37油菜-28.00-28.30ndnd0.301.911.40-27.79-26.39油菜-27.14-26.44-28.44nd-0.702.000.06-27.09-27.03油菜-25.92-26.5-26.73nd0.581.01-0