L05064周丽华

项目类别项目批准号BL05064附件3 华南农业大学大学生科技创新活动项目结题书项目名称：丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）烯脂酰还原酶fabk1和fabk2基因功能测定 申 请 人：周丽华 朱磊 所在院部：生命科学学院 专业年级： 02级生物技术（人才基地班） 联系电话指导教师: 王海洪 职称 教授 立项日期： 二五 年 四 月 二十 日 结题日期： 二六 年 四 月 七 日华南农业大学大学生科技创新活动项目指导中心 一、简表项目简况项目名称丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）烯脂酰还原酶fabk1和fabk2基因功能测定项目类别B、理科类；申请经费1500元起止年月2005.4-2006.4项目组成员姓 名性别出生年月年级专业班级所在学院上学年综合测评分项目中的分工本人签字周丽华女1983.902生技（人才基地班）生命科学学院基因克隆朱磊男1985.502生技（人才基地班）生命科学学院功能分析指导教师情况姓名王海洪性别男学位博士职称教授研究方向微生物基因组学授课名称微生物学项目简介基因组学和生物信息学的分析表明，梭状芽孢杆菌中有两个烯脂酰ACP还原酶II。与肺炎球菌的烯脂酰ACP还原酶II相比，FabK1有较高的同源性，而FabK2的同源性较差。该项目以丙酮丁醇梭菌为材料，在异体细胞研究FabK1和FabK2的生物学功能，以阐明这两种酶在丙酮丁醇梭菌脂肪酸合成中的作用。二、项目研究的内容与方法（一）基本研究内容克隆fabK1和fabK2基因，转化大肠杆菌fabI（ts） 菌株，检测它们的生物功能。（二）实施方案1 提取丙酮丁醇梭菌的总DNA，设计PCR引物，以总DNA为模板扩增fabK1和fabK2等参与丙酮丁醇梭菌脂肪酸合成的酶的基因；2 测定有关基因的DNA序列，确定基因的正确性；3. 转化大肠杆菌fabI(Ts)突变菌株JP1111，检测丙酮丁醇梭菌的fabK1和fabK2基因能否互补大肠杆菌fabI(Ts)突变菌株；4. 转化至E.coli的野生菌株W3110中，检测目的基因改变W3110对Triclosan（二氯苯氧氯酚）的敏感性的影响情况。三、项目研究过程与资料查阅情况（一）项目研究过程1、目的基因的克隆在引物两侧设计酶切位点，用PCR扩增目的基因。 Clos.fabk1的克隆设计引物如下：5-aggtaaaACatgttaaaaactcagtt-3（含NcoI酶切位点）5-caagcacttcTGcagctttatcaaaag-3(含PstI酶切位点) Clos.fabk2的克隆设计引物如下：5gagaggttatcatgaaattacctcctttac-3（含BspHI酶切位点）5ctgcagttctatccaaatctctcaccattc-3（含PstI酶切位点）连接T载体并测序，结果表明上述基因成功克隆。2、新质粒的构建质粒的选择根据实验目的和酶切位点的需要，选择高拷贝的表达载体pBAD24。目的基因与载体的连接根据引物设计的酶切位点，用双酶切回收目的基因片段并连接载体。经酶切检测，目的基因成功连接到pBAD24载体上，分别命名为Clos.fabk1-pBAD24和Clos.fabk2-pBAD24。图1 Clos.fabk1-pBAD24和Clos.fabk2-pBAD24的酶切结果3、基因功能检测将Clos.fabk1-pBAD24和Clos.fabk2-pBAD24分别转化至fabI（ts）突变株JP1111中。在RB固体培养基上分别进行300C和400C培养，检验目的基因对E.coli fabI基因功能的互补能力。4、基因对Triclosan敏感性检验将Clos.fabk1-pBAD24和Clos.fabk2-pBAD24分别转化至E.coli的野生菌株W3110中，在LB液体培养基中悬浮培养，检测目的基因改变W3110对Triclosan的敏感性的影响情况。（二）资料查阅情况脂肪酸合成循环反应的最后一步是2-反式-烯酰ACP的还原1。在大肠杆菌中这一步是由唯一的NADH依赖的烯酰ACP还原酶I(enoyl-ACP reductase I)(FabI)催化,该酶包含保守的Tyr-(Xaa)6-Lys催化活性中心序列23。在链球菌和梭菌的基因组没有发现存在FabI的同源基因。经研究发现，肺炎链球（S.pneumoniae）基因组编码一个被称为FabK的烯酰ACP还原酶(enoyl-ACP reductase II)。FabK是一个包含FAD的NADH依赖的烯酰ACP还原酶，与FabI没有同源性1。梭状芽孢杆菌一般是专性厌氧的革兰氏阳性细菌。这类细菌包括一些能产生毒素的病源菌，如艰难梭菌（Clostridium difficile）、肉毒梭菌（Clostridium botlinum）、产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）和破伤风梭菌（Clostridium tetani）。还包括一些通过发酵产生丙酮、丁醇、乙醇、异丙醇和有机酸等化合物地在工业生产中有广泛应用的细菌，如：丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum）和丁酸梭菌(Clostridium butyicum)等。目前，已经完成基因组序列测定的梭菌有：产气荚膜梭菌、丙酮丁醇梭菌和破伤风梭菌。同源分析发现，该类细菌中有两个烯脂酰ACP还原酶II，与肺炎球菌的烯脂酰ACP还原酶II比较发现FabK1有50-60%的同源性，而FabK2仅有20%左右的同源性1。该项目以丙酮丁醇梭菌为材料，在异体细胞研究FabK1和FabK2的生物学功能。文献表明，Triclosan对E.coli FabI具有明显的抑制作用（0.2g/ml） 4。而在转入肺炎球菌的fabK基因后，E.coli野生菌株W3110对Triclosan的敏感度大大降低，在较高浓度下（2000g/ml）仍可生长1。因此，本项目分别转化Clos.fabk1和Clos.fabk2至E.coli野生菌株W3110研究它们改变W3110对Triclosan的敏感性的影响情况。1 Hedia MARRAKCHI*, Walter E. DEWOLF, Jr, Chad QUINN, Joshua WEST, Brian J. POLIZZI, Chi Y. SO, David J. HOLMES,Biochem. J. (2003) 370, 10551062 (Printed in Great Britain) 1055 Characterization of Streptococcus pneumoniae enoyl-(acyl-carrier protein)reductase (FabK)2 Baker, M. E. (1995) Biochem. J. 309, 10291030 Enoyl-acyl-carrier-protein reductase and Mycobacterium tuberculosis InhA do not conserve the Tyr-Xaa-Xaa-Xaa-Lys motif in mammalian 11band 17b-hydroxysteroid dehydrogenases and Drosophila alcohol dehydrogenase.3 Parikh, S., Moynihan, D. P., Xiao, G. and Tonge, P. J. (1999) Biochemistry 38, 1362313634 Roles of tyrosine 158 and lysine 165 in the catalytic mechanism of InhA, the enoyl-ACP reductase from Mycobacterium tuberculosis. 4 Haihong Wang and John E. Cronan THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 33, Issue of August 13, pp. 3448934495, 2004 Functional Replacement of the FabA and FabB Proteins of Escherichia coli Fatty Acid Synthesis by Enterococcus faecalis FabZ and FabF Homologues*四、项目成果完成形式和价值1、项目结果对E.coli fabI基因功能的互补检验结果表明Clos.fabk1能互补E.coli fabI基因的功能，但是转化后大肠杆菌的生长受到一定的抑制；而Clos.fabk2不能互补E.coli fabI基因的功能。图2 Clos.fabk1和Clos.fabk2基因功能检测结果对Triclosan敏感性影响实验的结果显示Clos.fabk1可以大大降低W3110对Triclosan的敏感性，同样，转化后大肠杆菌的生长受到一定的抑制。2、项目成果分析经检验功能上互补大肠杆菌的fabI基因的功能，这说明根据同源比较所得到的烯脂酰还原酶基因在大肠杆菌中依然可以表达并且有生物学活性，可以推测在丙酮丁醇梭菌中，该基因所编码的产物具有将2-反式-烯酰ACP还原的活性,进一步的验证则需要分离纯化有关酶蛋白，研究它们的酶学特性。直接转化进入大肠杆菌的fabK2不能够互补fabI基因的功能，推测原因有可能是该基因不能在大肠杆菌中大量的表达。对大肠杆菌密码子偏好性的研究表明，主要有7种密码子在大肠杆菌中是最不常用的，而在fabK2的基因中这其中密码子的使用频率比较高，并且有稀有密码子连续使用的现象。解决该基因在大肠杆菌中的表达问题可以采取提高稀有密码子使用效率的手段或使fabK2中的稀有密码子发生无义突变，另外fabK2与大肠杆菌fabI的同源性相对比较低，其是否真正具有与fabI相同的生物学功能有待于进一步证实。在Clos.fabK1转化进入大肠杆菌之后，大肠杆菌的生长受到一定的抑制。分析原因为pBAD24是一种高拷贝的高效表达载体， Clos.fabK1转化进入大肠杆菌后大量表达，其过量的产物对大肠杆菌的生长有一定的影响。3、项目价值本课题研究了FabK1和FabK2的生物学功能，对其酶学特点的分析奠定了理论和实验的基础。有助于理解丙酮丁醇梭菌脂肪酸合成的特殊性，为研究其它细菌，特别是一些病原菌的烯酰ACP还原酶提供理论指导。同时，弄清这两种酶功能上的差异，可丰富细菌脂肪酸合成的多样性，为新型抗生素提供特异性靶。另外，确定同源基因的功能对后基因组学的发展具有重要的意义。五、经费使用情况引物合成：210元序列测定：360元试剂材料费：950元合计：1520元六、申请人对该项目研究工作完成后的认识总结通过对本项目的研究，我们认识到以下几点：1、科学研究需要认真严谨的态度。注重实验细节，一丝不苟是使实验获得成功的重要条件。详细记录实验过程是进行实验分析的重要依据。2、文献的查阅对科学研究有重要的提示作用。文献资料可以为实验提供有价值的参考数据，可避免一些错误和有利于实验的顺利进行。3、科学研究需要独立思考，这是解决困难的必要手段。4、实验过程中难免会遇到各种预想不到的问题和困难，排除困难的决心和坚持到底的精神对科研实验是非常重要的。5、作为本