拮抗玉米茎腐病菌的放线菌菌株发酵产物理化性质研究.pdf

化学工程师 C h e mi c a l E n g in e e r 2 0 1 4年第 0 7期 科 研 与 开 发 文章编号 1 0 0 2 一 l 1 2 4 2 0 1 4 0 7 0 0 0 7 0 3 拮抗玉米茎腐病菌的放线茵菌株 发酵产物理化性质研究 翟贺玲 王艳红 高超 张波 何超 黑龙江八一农垦大学 生命科学技术学院 黑龙江 大庆 1 6 3 3 1 9 摘要 本文通过纸电泳 p H层析等方法研究了拮抗玉米茎腐病菌的放线菌发酵产物的理化性质 同时 也对其光稳定性 温度稳定性实验进行研究 明确该放线菌的发酵产物主要成分为水溶性的中性物质 且具 有较好稳定性 这些理化性质的研究为其下游工艺特别是产物分离提取方法的选择提供理论依据 关键词 玉米茎腐病菌 放线菌 发酵产物 理化性质 中图分类号 Q 9 3 5 文献标识码 A Re s e a r c h in g p h y s ic o c h e mic a l p r o p e r t ie s o f f e r me n t a t io n s u b s tan c e o f t h e s t r e p t o my c e t e s r iv a lr y in g c o r n s talk r o t Z HAI He lin g W ANG Ya n h o n g GAO Ch a o ZHANG B o HE Ch a o L i f e S c ie n c e a n d T e c h n o l o g y C o l le g e o f He i l o n g j ia n g B a y i A g r i c u l t u r a l Un i v e r s i t y Da q i n g 1 6 3 3 1 9 C h i n a Ab s t r a c t P h y s ic o c h e mic a l p r o p e r t ie s o f f e r me n t a t io n s u b s t a n c e o f t h e s t r e p t o my c e t e s r iv a lr y in g c o m s t a lk r o t w e r e r e s e a r c h e d t h r o u g h p a p e r e le c t r o p h o r e s is a n d p H c h r o ma t o g r a p h y At t h e s a me t ime lig h t s t a b ilit y a n d h e a t s t a b ilit y we r e a ls o r e s e a r c h e d T h e r e s u lt s s h o we d t h a t t h e f e rm e n t a t io n s u b s t a n c e w a s id e n t ifi e d n e u t r a l a n d e a s ily s o lu b le in w a t e r I t h a d we ll s t a b iliz a t io n T h e s e p r o p e r t ie s h a d p r o v id e d t h e o r y b a s e s f o r d o w n s t r e a m t e c h n o lo g y e s p e c ia lly f o r s e p a r a t io n a n d e x t r a c t io n me t h o d s Ke y wo r d s C O 1T I s t a lk r o t a c t in o my c e t e f e r me n t a t io n s u b s t a n c e p h y s ic o c h e mic M p r o p e rt ie s 玉米茎腐病 C o rn s t a lk r o t 是我 国玉米生产上 的一类重要病害 也是世界玉米产区普遍发生的一 种土传病害 其发病率一般在 1 5 2 0 严重时 可达 7 0 以上 因此 从生物防治角度考虑 广谱 高效的生防菌剂亟待开发 目前 放线菌是应用最 广的生 防微生物之一 其在 多个领域得到广泛应 用 如医药领域 农业领域 3 1 菌株 Y H 一 1 是黑龙江 八一农 垦大学过程工程教研室从土壤 中分离到 的 一 株生防放线菌菌株 该菌株对玉米茎腐病 C o r n s t a l k r o t 有较强的拮抗作用 本实验主要对其发酵 产物进行纸 电泳 p H层析以研究其理化性质 同时 也对其发酵产物进行光稳 定性 热稳定性 溶解度 等进行相关实验 以期为该菌株的进一步研究 特 别是下游工艺发酵产物分离提取方法 的选择提供 参考 更期待为该菌株早 E t 实现产业化奠定理论基 收稿 日期 2 0 1 4 0 4 0 4 基金项 目 黑龙江八一农垦大学 大学生创新创业训练计划 项 目 x c 2 0 1 3 0 5 6 作者简 介 翟 贺玲 1 9 9 0 一 女 2 0 1 0级生物技术专业本科生 通讯作者 王艳红 1 9 7 9 一 女 讲师 硕士 毕业于沈阳农业大学 现 主要从事微生物药物相关的教学与科研工作 础 1 材料与方法 1 1 菌株及所 用试 剂和实验器材 放 线 菌 菌 株 Y H l 禾 谷 镰 刀 菌 F u s a r iu m g r a m in e a r u m 均由黑龙江八一农垦大学过程工程 教研室提供 所用试剂均为分析纯 所用主要实验器材 电 泳仪 微量进样器 水平电泳槽 层析缸 无菌玻璃 板等 1 2 稳定性 实验 1 2 1 温度稳定性实验将放线 菌菌株 Y H 一 1的 发酵液放在 5 0 4 一 2 0 放置 2 0 d 对照为室温放置 的发酵液 管碟法测定生物活性 重复 3次 1 2 2 光稳 定性实验将放线菌 菌株 YH l 的发 酵液在紫外光下分别照射 2和 4 h 对照为未进行紫 外光照处理 管碟法测定生物活性 重复 3 次 1 3 纸 电泳 实验 采 用新 华 1号 中速 滤纸顺 着 纸 纹方 向裁成 3 2 c m x 0 6 c m的滤纸条 用微量进样器吸取放线菌 翟贺玲 等 拮 抗玉米茎腐病 菌的放 线茵菌株发酵 产物理化性质研究 2 0 1 4年第 0 7期 菌株 Y H一 1的发酵液 1 O L在滤纸 中央点样 在 电 泳槽 的两端贮液槽 内分别加 p H值为 4和 p H值为 8的 N a H P O 柠檬酸缓冲液 用缓冲液均匀湿润滤 纸条但点样处勿浸入 标记正负极 盖好电泳槽盖 并做好降温处理 先在 5 0 V电压下预电泳 3 0 mi n 再 在 1 5 0 V的电压下电泳 1 h 然后将电压调到 3 5 0 V 继续 电泳 2 h后终止 取出晾干 生物显影 对 Y H一 1 发酵产物性质进行判断 1 1 4 极性和溶解度 实验 极性和溶解度实验主要采用 B e t in a t 1 溶剂系统 进行 此溶剂系统包括 水 水饱和的苯 水饱 和的 正丁醇及水饱和的乙酸乙酯 试 验 方法 取 放 线 菌菌 株 YH 一 1的发 酵液 1 O L点样于新华一号滤纸上 上行展开 展开距离 1 5 e m 完毕后将纸条吹干 紫外线灭菌 生物显影并 测量 R f 值 1 1 5 p H层 析试 验 对 放线 菌菌株 Y H一 1的发酵液采 用 p H层析 法 进行酸碱性和离解度 的测定 具体方法如下 取新华一号 中速滤纸 顺着滤纸纸纹方 向裁成 长 1 7 c m 宽 0 6 c m的 9条滤纸带 然后将各滤纸条 用不同 p H值的缓冲液处理 晾干 点样 1 0 L 在 7 0 乙醇溶剂中上行展层 展 开距离为 1 5 e ra 完毕 后将滤纸条吹干 紫外线灭菌 生物显影并测量 R f 值 7 l 2 结果与分析 2 1 温度稳定性实验 将放线菌菌株 Y H一 1的发酵液分别放在不同温 度 5 0 4 一 2 0 o C 保存 2 0 d 管碟法测定抑菌活性 3 次重复 表 1 温度对 Y H 一 1 发酵液活性 的影 响 Ta b 1 Ef f e c t s o f t e mpr e t ur e o n f e r me n t a t io n a c t iv it y o f YH一1 从表 1可 以看出 冷冻效果最好 抑菌 圈直径 的平均值 2 7 2 m m 其他温度处理后抑菌圈直径的平 均值分别为 2 6 1 2 6 7 2 7 2 mm 与对 照 2 7 0 ra m相 比 活性几乎没有降低 因此 放线菌菌株 Y H一 1的 发酵液具有很好的温度稳定性 2 2 光 稳定 性实验 将放线菌菌株 YH l 的发酵液经紫外线照射 2 和 4 h后 管碟法测定生物活性 结果见表 2 表 2 光照对 Y H 一 1 发酵液活性的影响 T a b 2 Ef f e c t s o f d iff e r e n t t ime o n f e r me n t a t io n a c t ivit y o f YH一1 处理时间 m 抑菌圈直径 mm 2 4 从表 2可以看出 紫外光照射处理与 同时段对 照相 比 活性几乎没有改变 存活率分别为 9 8 5 和 9 7 1 这表明该菌的发酵液具有光照稳定性的特 点 可 以进一步应用 2 3 纸电泳实验 放线菌菌株 YH 一 1 的发酵液分别在酸性 p H 4 和碱性 p H 8 的缓 冲液中进行 电泳 多次 电泳结 果 表明 电泳时发酵产物没发生任何移 动 仍在在点 样点处 表 3 说 明该发酵产物是中性物质 此结果 为下游工艺提供依据 表 3 Y H 一 1 发酵液的纸 电泳 结果 Ta b 3 Ef f e c t s o f pa p e r e le c t r op h o r e s is o f YH一1 f e r me nt a t io n 不同 p H缓冲液 R f 值 pH4 pH8 0 0 2 4 极性和溶解 度实验 采用 B e t in a 溶剂系统进行极性和溶解度实验 放线菌菌株 YH 一 1 发酵液在此溶剂系统中的 R f 值 见表 4 表 4 Y H 一 1 发酵液在 B e t i n a 溶剂系统中的 尺 值 Ta b 4 Rf va lu e o f YH一1 f e r me n t a t io n in Be t ina s o lv e n t s 从表 4可 以看 出 该发酵液的活性成分在水 中 的 尺 f 值最大 在水饱和的苯和乙酸 乙酯溶液中 活 性组分没有任何移动 说明该活性组分在水中的溶 解度较好 在有机溶剂 中溶解较少或者不溶解 因 此 将活性组分鉴定为水溶性的抗生素 2 5 p H层 析试 验 根据 B e t in a溶剂系统的实验结果 放线菌菌株 YH 一 1的发酵液 由于其发酵产物具有极性较强的特 点 经不同 p H处理后 我们选择 7 0 乙醇溶剂展 层 图谱见图 1 2 0 1 4年第 O 7期 翟贺玲等 拮抗玉米 茎腐病菌的放线茵茵株发酵产物理化性质研 究 0 65 0 6 0 卜 0 5 01 理 I o 4 5 1 0 4 01 l 0 3 51 l O 3 O十 r 1 r r 1 T一 2 2 3 4 5 6 7 8 9 l p H值 图 1 p H层析结果 F ig 1 Re s u lt s o f p H c h r o ma t o g r a p h y 结果表 明无论在在酸性 区间还是在碱性 区间 R f 值基本在 同一位置 基本没有改变 与经典抗生 素图谱相比 其 p H层析图谱为中性抗生素图谱 因 此推断其活性组分为中性物质 此实验结果与纸 电 泳的实验结果一致 均证 明菌株 YH 一 1的发酵液活 性组分为中性物质 3 结论 放线菌菌株 Y H一 1的发酵液经对其理化性质进 行研究 发现其稳定性较好 无论高温处理还是低 温贮 藏该发酵液仍保持很高的活性 对光不敏感 见光不易分解 因此 该发酵产物可开发成符合人 们需要 的 具有生 防潜力 的农用抗 生素 满足人们 对绿色产 品的需求 在植物病害 的田间防治上起到 积极作用 具有较好的应用价值和前景 8 对于放线菌菌株 YH 一 1的发酵液的理化性质进 行研究 本研究 主要进行 的纸 电泳 实验 生物显影 结果表明活性组分 电泳时不 向正负极移动 只在点 样点处 可推断其活性组分为中性抗生素 采用 B e t in a 溶剂系统进行 的纸层析试验明确了该放线菌 发酵产物的有效组分极性较强 推测其属于中性的 水溶性抗生 素 在有机溶剂 中不溶解或者溶解较 少 对其进行 的 p H纸层析试验明确了 Y H 一 1 发酵 产物 的有效组分在无论在酸性条件还是在碱性条 件下其 R f 值基本没用变化 在约在同一条直线上 也就是说 R f 值不受 p H值的影响 进一步证明 YH 一 1的发酵产物为 中性物质 因此 通过对放线菌 菌株 Y H 一 1 发酵液理化性质的研究已明确其活性组 分为中性物质 此性质又与刘秋等 的龟裂链霉菌 菌株 M Y 0 2发酵液中抑菌活性组份 S N 0 6相似 为 下游工艺选择分离方法提供理论依据 但二者的主 要化学成分 的化学结构 抗菌作用机制等方面是否 相似还有待于进一步研究 参考文献 1 吴海燕 孙淑荣 范作伟 等 玉米茎腐病研究现状与防治对策 J 玉米科学 2 0 0 7 1 5 4 1 2 9 1 3 2 2 陈润玲 檀尊社 赵保献 等 玉米茎腐病研究进展F J 西北农业 学报 2 0 0 5 l4 6 1 5 7 1 6 0 3 姜钰 董怀玉 徐秀德 等 放线菌在植病生防中的研究进展 J 1 杂粮作物 2 0 0 5 2 5 5 3 2 9 3 3 1 4 田小卫 一株放线菌次生代谢产物抗菌活性的初步研究 J 植 物保护 2 0 0 4 3 0 2 5 1 5 3 5 周德庆 微 生物学实 验手册 M 上 海 上海 科学 技术 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